WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО. ...»

На правах рукописи

ШИКЕЕВА АМУЛАНГ АЛЕКСЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ

НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО.

03.02.07 – генетика

14.01.12 – онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук Завалишина Лариса Эдуардовна кандидат медицинских наук Кекеева Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

Фаворова Ольга Олеговна, доктор биологических наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой молекулярной биологии и медицинской биотехнологии медико-биологического факультета Чхиквадзе Владимир Давидович, доктор медицинских наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный научный сотрудник хирургического отдела



Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт онкологии имени Н.Н.Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «___» _______ 2014 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1; www.med-gen.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «_____»___________________ 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна   3 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Рак легкого является одним из самых распространенных злокачественных новообразований и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных.

По данным ВОЗ на 2008 год рак легких стал причиной смерти 1,3 миллиона человек. В 2011 в России зарегистрировано более 50 тысяч новых случаев рака легкого, при этом 36% случаев выявлено на 4 стадии заболевания (Чиссов В.И., 2011). Курение является одним из главных факторов риска развития рака легкого (курильщиками являются 87% пациентов с этой нозологией).

Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 53%.





Пятилетняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и составляет в разных странах от 5 до 18%, несмотря на высокий уровень развития современных методов диагностики и лечения.

Группа немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) включает примерно 85% всех раков. Среди гистологических типов НМРЛ – аденокарцинома, плоскоклеточный рак легкого, аденоплоскоклеточный, крупноклеточный рак. Первые два типа составляют 80всех НМРЛ. Показано, что для каждого гистологического типа существует свой профиль генетический изменений, так, например, мутации генов EGFR, KRAS, транслокация EML4/ALK характерны для аденокарцином легкого (Grepmeier U., 2005). Для плоскоклеточного рака легкого показана амплификация генов FGFR1 и SOX2 (Sos M.L., 2012). Характерной особенностью нашей страны является преобладание плоскоклеточного рака, что обусловлено большим количеством курящего населения. В последнее время в связи с развитием персонализированного подхода к выбору тактики лечения онкологических больных важное значение имеют не только клинические характеристики пациента, а также гистологический тип опухоли, но и молекулярногенетические особенности опухоли и их применение для диагностики, прогноза заболевания и определения чувствительности к таргетной терапии.

В ряде работ показано, что молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно нормальных тканях. Недавние исследования выявили, что опухолевое окружение НМРЛ имеет гетерогенную структуру и играет важную роль в прогрессировании опухоли и эффективности лечения (Guo M., 2004).

Однако, несмотря на постоянно усовершенствующиеся подходы к диагностике и лечению пациентов с НМРЛ, существует ряд проблем (таких как позднее выявление заболевания, низкий процент выживаемости пациентов и др.), решение которых в настоящее время является актуальным. Лечение пациентов с НМРЛ зачастую не приводит к ожидаемым эффектам, что обуславливает высокий процент рецидивов и прогрессирования заболевания. В этом аспекте изучение молекулярно-биологических свойств опухолевых клеток и опухолевого окружения может оказать существенную помощь в решении проблем ранней диагностики, эффективности лечения и прогноза течения НМРЛ.

Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и смежных с опухолью условно нормальных тканях, а также оценке практической (диагностической и прогностической) значимости этих нарушений.

Цель исследования Изучить молекулярно-генетические изменения в немелкоклеточном раке легкого и смежных с опухолью условно нормальных тканях.

  4  Задачи исследования

1. Изучить аллельный дисбаланс локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938 в НМРЛ и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

2. Изучить аномальное метилирование промотора генов FHIT, TIMP3, CDH1, MGMT, RASSF1A, DAPK1, CD44 в НМРЛ и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

3. Определить частоты мутаций генов EGFR и KRAS и транслокацию гена ALK в не плоскоклеточном НМРЛ для определения чувствительности к таргетным препаратам.

4. Определить уровни экспрессии микроРНК: let-7a, miR-155, miR-205 – в опухолевой ткани и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

5. Провести сравнительный анализ выявленных молекулярно-генетических нарушений для различных гистологических типов НМРЛ и других клинических параметров.  Научная новизна Впервые на российской выборке проведено комплексное исследование молекулярно-генетических изменений НМРЛ: потери гетерозиготности (ПГ), микросателлитной нестабильности (МН), эпигенетических изменений на материале опухолевой ткани и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. Впервые на российской выборке проведено исследование уровней экспрессии ряда микроРНК в опухолевой ткани, смежных с опухолью нормальных тканях пациентов с НМРЛ. Впервые изучено состояние опухолевого окружения на различных расстояниях от опухолевого очага.

Практическая значимость Определены молекулярно-генетические характеристики плоскоклеточного рака легкого (структурные нарушения локусов D9S925, D17S928, гиперметилирование промотора генов CDH1 и CD44), которые могут рассматриваться в качестве маркеров данного гистологического типа НМРЛ в сложных диагностических случаях в дополнение к данным иммуноморфологического исследования.

Выявлены молекулярно-генетические изменения, а именно аллельные нарушения микросателлитов D2S405, D3S1300, аберрантное метилирование промотора генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155, которые могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза НМРЛ.

Определена чувствительность пациентов с аденокарциномой легкого к таргетным препаратам.

Выявлен и охарактеризован молекулярный профиль «опухолевого поля» при НМРЛ, что открывает перспективы дальнейшего усовершенствования оперативного и консервативного лечения пациентов с данной нозологией.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для НМРЛ характерны высокие частоты потери гетерозиготности/микросателлитной нестабильности локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, CDH1, CD44, TIMP3, MGMT и снижение экспрессии микроРНК let-7a.

2. В смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли выявлены эпигенетические изменения и отсутствуют аллельные нарушения. В ряду: опухоль – смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см – смежная   5  условно нормальная ткань на расстоянии 5 см – происходит уменьшение частоты эпигенетических изменений.

3. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности/микросателлитная нестабильность локусов D9S925, D17S928 и метилирования генов CDH1 и CD44 – ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого и могут использоваться в качестве маркеров для гистологической верификации опухоли; аллельные нарушения регионов D2S405, D3S1300, метилирование промоторов генов RASSF1A и FHIT, снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 ассоциированы со стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и метастазированием и могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза.

4. Смежные с опухолью морфологически не измененные нормальные ткани, содержащие молекулярно-генетические изменения, формируют «опухолевое окружение» выявленное на расстоянии 5 см от опухолевого очага.

Апробация работы Материалы диссертации доложены: на десятой конференции «Нанотехнологии в онкологии», 15 декабря 2012г., Москва, на конференции «European Conference of Human Genetics», 8-11 июня, 2013г., Париж, Франция.

Личный вклад автора в проведение исследования Автор принимала непосредственное участие в планировании и проведении исследования. Для реализации цели исследования автором сформированы группы пациентов с НМРЛ, не получавших предварительного лечения. Автором лично проведены все молекулярно-генетические исследования, использованные в работе.

Автором проанализированы современные данные отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, проведен математический и статистический анализы полученных данных, сформулированы основные результаты и выводы. Результаты исследования опубликованы в научных журналах и доложены на конференциях.

Публикации По результатам диссертации опубликовано 6 печатных работ соискателя, в том числе 4 статьи – в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы и глав, посвященных описанию материалов и методов исследования, изложению полученных результатов и их обсуждения, содержит заключение и выводы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 38 рисунков. Библиографический указатель включает 178 наименований, из них 10 отечественных и 168 иностранных источников.

–  –  –

Методы исследования Выделение ДНК и микроРНК проводили из операционного материала, фиксированного в формалине с последующей парафинизацией (парафиновые блоки).  Для оценки частоты аллельных нарушений в образцах опухолевой ткани, смежной с ней нормальной ткани на расстоянии 2 см и 5 см и их сравнения с помощью микросателлитного анализа исследовались локусы D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938, как наиболее часто повреждаемые при НМРЛ. Определение структурных нарушений генов EGFR, KRAS, ALK проводили у 140 пациентов с не плоскоклеточным НМРЛ (аденокарцинома, аденоплоскоклеточный рак). Мутации генов EGFR и KRAS выявляли с помощью фрагментного анализа, прямого секвенирования и ПЦР в режиме реального времени. Наличие транслокации гена ALK определяли с помощью FISH.  Оценку частоты аномального метилирования промотора генов RASSF1A (3p21.3), FHIT (3p14.2), DAPK1 (9q21.33), CDH1 (16q22.1), CD44 (11p13), TIMP3 (22q12.3), MGMT (10q26.3) в образцах опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на различном расстоянии проводили с помощью анализ аномального метилирования промоторов генов, наиболее часто повреждаемых при НМРЛ.

  7  Выделение ДНК проводили по протоколам коммерческого набора «ДНК-сорб-В», РФ, или «QIAamp DNA FFPE Tissue Kit» («QIAGEN», Германия).

Бисульфитную модификацию ДНК проводили по протоколам набора «EpiTect Bisulfite FFPE Kit» фирмы «QIAGEN», Германия.

Микросателлитный анализ проводили с помощью ПЦР по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 50-100 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2. Амплификацию проводили по следующей программе (35 циклов): денатурация при 94С – 40 с; отжиг при 59-61С – 1 мин; элонгация при 72С – 30 с. Продукты разделяли в 6%-ном денатурирующем ПААГ и окрашивали нитратом серебра.

Фрагментный анализ. Продукты ПЦР, объём которых предварительно установлен идентификацией электрофорезом в 8% ПААГ, смешивали с 0,5 мкл флуоресцентного маркёра LIZ-500 и 11 мкл HI-DI формамида («Applied Biosystems», США). Вносили полученную смесь в соответствующие лунки в плашке аппарата. Денатурировали в течение 2 минут при температуре 98С с последующим охлаждением до +4 0С. Плашку помещали в генетический анализатор Genetic Analyzer 3500xl («Applied Biosystems», США).

Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывали метил-чувствительной рестриктазой HpaII фирмы «Cибэнзим», РФ, по следующей схеме: к 1500 нг (8 мкл) геномной ДНК добавляли 3 е.а. (1 мкл) фермента и 2 мкл соответствующего 10-кратного буфера, доводили до 20 мкл дист. водой и инкубировали в течение 10-12 часов в термостате при температуре 37С.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для определения мутаций генов EGFR и KRAS проводили ПЦР по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 65-100 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед.

Taq-полимеразы, 5 мМ MgCl2, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4). Амплификацию проводили по следующей программе (35 циклов): денатурация при 94С – 40 с; отжиг при 60-62С – 40 с; элонгация при 72С – 30 с. Финальную инкубацию проводили при 72С в течение 10 мин.

Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР). Для исключения возможной гомозиготной делеции исследуемых генов МЧ-ПЦР проводилась на парных образцах: гидролизованная и негидролизованная ДНК. ПЦР проводили при помощи программируемого термоциклера «Терцик» фирмы «ДНК-технология», РФ, с использованием термофильной ДНК-полимеразы («СибЭнзим», РФ) по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 20-170 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl pH 8.4.

Оптимальное содержание МgСl2 в буфере подбирали экспериментальным путем для каждой пары используемых праймеров. Амплификацию проводили по следующей программе (35 циклов): денатурация при 94С – 40 с; отжиг при 60-64С – 40 с; элонгация при 72С – 30 с. Финальную инкубацию проводили при 72С в течение 10 мин.

Обратной транскрипция. Обратная транскрипция микроРНК проводилась c помощью полиаденилирования 3'-конца микроРНК и последующим праймированием олиго-dT праймерами, которые на своем 3'-конце имеют дегенеративный анкер, а на 5'конце универсальную концевую последовательность, по протоколам коммерческого набора «miScript II RT Kit» фирмы «QIAGEN», Германия, в термоциклере Veriti 96-Well Thermal Cycler фирмы «Applied Biosystems», США, по программе: 37 0С – 60 мин; 95 0С

– 5 мин.

  8  ПЦР в режиме реального времени (Real-time ПЦР). Для определения мутаций гена EGFR использовали 2 технологии: аллель-специфическую ПЦР и детекцию амплификации с помощью молекул Scorpions по протоколам коммерческого набора «Therascreen EGFR RGQ PCR Kit» на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («QIAGEN», Германия).

ПЦР в режиме реального времени для определения уровня экспрессии микроРНК.

Определение экспрессии «зрелых» микроРНК проводили по технологии SYBR Green с помощью микроРНК специфичных праймеров «miScript Primer Assay» по протоколам коммерческого набора «miScript SYBR Green PCR Kit» на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («QIAGEN», Германия).

FISH исследование транслокации гена ALK проводили по протоколам коммерческого набора «Vysis LSI ALK Dual Color Break Apart FISH Probe» фирмы «Abbot Molecular», США.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили при помощи программ Graph Pad Instat Version 3.1a и Microsoft Excel. Для выявления достоверных ассоциаций между выявленными молекулярно-генетическими изменениями и клинико-морфологическими параметрами пациентов, последних делили на группы по возрасту, полу, локализации опухоли, стадии опухолевого процесса, статусу курения, гистологическому типу, степени дифференцировки. В выделенных группах сравнивали частоты выявленных нарушений по каждому гену и локусу, а также варианты сочетания молекулярно-генетических изменений в различных локусах и генах, с помощью двустороннего варианта точного критерия Фишера. Статистическую обработку данных об экспрессии микроРНК проводили с помощью одноконцевого парного и непарного теста Стьюдента.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Аллельные нарушения при НМРЛ Анализ семи микросателлитных повторов, расположенных в наиболее часто повреждаемых при НМРЛ хромосомных локусах: 2p23.3, 2q35, 3p14.2, 3p22.2, 3p26.3, 9p22.1, 17p13.3 проводили на генетическом материале, полученном из опухолевой и смежной условно нормальной ткани. Выявлено, что у 102 из 110 пациентов с НМРЛ (93%) обнаружена ПГ и/или МН, по крайней мере, по одному из маркёров. Итоговые частоты аллельных изменений приведены в табл. 2. Электрофореграммы, демонстрирующие ПГ и МН исследуемых маркеров, показаны на рис. 1.

–  –  –

Наибольшая частота аллельных нарушений у пациентов с НМРЛ выявлена для микросателлита D3S1300 – 60%. Для локусов D3S1300, D9S925, D17S938 характерна только ПГ. МН в этих регионах не обнаружена. Полученные значения на данной выборке соответствуют опубликованным ранее данным из разных стран, например, для   9  региона D2S164 – 50% случаев НМРЛ (Tseng R.C. et al., 2005), для D3S1539 – 60% (Woenckhaus M., 2005).

–  –  –

ПГ и/или МН сателлитов D3S1768 и D17S938 составили 49 и 52% соответственно.

Выявлена статистически достоверная ассоциация между курением и плоскоклеточным раком легкого (p = 0,003). Показано, что аллельный дисбаланс в исследуемых локусах характерен для курильщиков: D17S938 (p = 0,032), D3S1768 (p = 0,004), ПГ/МН в локусе D3S1768 также ассоциирована с плоскоклеточным раком легкого (p = 0,002).

Полученные данные свидетельствуют о том, что в НМРЛ происходят многочисленные мутационные события, приводящие к повреждению различных участков генома. Найденные генетические изменения могут использоваться как молекулярные маркёры плоскоклеточного рака легкого, для дифференциальной диагностики в сложных случаях, в дополнении к данным морфологического исследования, а также могут оцениваться как маркеры прогноза.

Аллельные нарушения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии   По данным ряда исследований молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно нормальных тканях (Tang X. et al., 2008; Yendamuri S., 2008), однако в ходе нашей работы в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли ПГ/МН не обнаружено. Вероятно, это можно объяснить тем, что структурные изменения не затрагивают смежные с опухолью нормальные ткани, а накапливаются только в опухоли. Однако, существуют исследования, показывающие наличие молекулярногенетических изменений не только непосредственно в опухолевом эпителии, но и в опухолевой строме (опухолевом микроокружении), а также в предопухолевых изменениях (дисплазия) и смежных с опухолью морфологически неизмененных тканях.   Ранее показано наличие структурных изменений, таких как мутации гена EGFR в опухолевом микроокружении и строме на расстоянии 5 мм (Tang X., 2008). В отечественной работе по определению аллельных нарушений и аномального метилирования   11  ряда генов при раке предстательной железы показано наличие ПГ/МН в стромальном опухолевом микроокружении (Кекеева Т.В., 2008) Отсутствие аллельных нарушений в условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см в нашем исследовании, позволяет предположить, что, вероятно, при НМРЛ аллельный дисбаланс не затрагивает участки смежной с опухолью условно нормальной ткани на этом расстоянии.

Анализ мутации генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK при НМРЛ Для определения чувствительности опухоли к таргетным препаратам проводился анализ мутаций в генах EGFR, KRAS и транслокации гена ALK у 140 пациентов с НМРЛ с железистой дифференцировкой (аденокарцинома, аденоплоскоклеточный рак). Так как наличие транслокации ALK выявлено в случаях аденокарцином, имеющих дикий тип EGFR и KRAS, то анализ этих изменений проводился последовательно. Алгоритм исследования представлен на рис. 2. Средний возраст пациентов в исследовании составил 60 лет.

Рисунок 2. Схема проведения молекулярно-генетического исследования для определения чувствительности к таргетным препаратам.

Структурные изменения выявлены в 37% случаев не плоскоклеточного НМРЛ. Частота мутаций гена EGFR составила 19% (27/140), мутации в гене KRAS обнаружены в 17% (19/113) случаев, а транслокация гена ALK выявлена у 6% (6/94) пациентов.

В данном исследовании 81% мутаций гена EGFR составили делеции в 19 экзоне (22/27). Выявлены следующие варианты делеций:  p.E746_A750del, p.L747_A749 del,A750P, p.L747_S752 del, p.L747_A750 del, p.K745_E749del, p.A750_K754 del (Шикеева А.А., 2011).

Определение мутаций проводили с помощью 3 различных методов: прямого секвенирования (рис. 3); фрагментного анализа (для 19 экзона) (рис. 4); с помощью коммерческого набора «Therascreen EGFR RGQ PCR Kit».

Мутации в 21 экзоне гена EGFR составили 19% (5/27). У четырех пациентов выявлена мутация p.L858R, в одном случае обнаружена мутация p.L861Q. Все выявленные   12  структурные нарушения в гене EGFR ассоциированы с чувствительностью к препаратам-ингибиторам EGFR.

Мутации в гене KRAS встречаются у 15–35% пациентов с НМРЛ (Roberts P.J.,

2010) и считаются неблагоприятным прогностическим маркером при НМРЛ, поскольку большинство из них обуславливают резистентность к терапии препаратамиингибиторами EGFR. При наличии мутации в гене KRAS, сигнальный Ras/Raf/Mek путь активируется не зависимо от того, заблокирован EGFR или нет.

–  –  –

Рисунок 4. Фрагментный анализ 19 экзона гена EGFR.

В данном исследовании частота мутаций гена KRAS составила 17% (19/113). Анализ мутаций 2 экзона гена KRAS проводили методом прямого секвенирования. Наиболее частые мутации в 12 кодоне: p.G12V –32% (6/19), p.G12D – 26% (5/19), p.G12C – 26% (5/19). Также выявлены мутации p.G12A, p.G12N, p.G13D. Сиквенсограмма, демонстрирующая мутацию в гене KRAS, представлена на рис. 5.

Транслокация гена ALK обнаружена в 6% (6/94) случаев. Определение транслокации гена ALK проводили с помощью метода FISH. Генетические нарушения в этом гене приводят к постоянной активации рецептора ALK, который активирует MAP-киназный и PI3K-киназный и STAT3-зависимые сигнальные пути, ингибирующие апоптоз, стимулирующие клеточную пролиферацию и стромальную инвазию. По данным исследований при НМРЛ частота хромосомных перестроек гена ALK составляет 2-7% (Rodig S.J., 2009).

p.G12V

Рисунок 5. Сиквенсограмма участка 2 экзона гена KRAS.

Для выявления возможных ассоциаций клинико-морфологических характеристик с генетическими нарушениями в исследуемых генах, пациентов делили на группы по возрасту, полу, статусу курения. Деление пациентов на группы по гистологическому критерию не проводилось, т.к. все пациенты имели аденокарциному легкого. В нашем исследовании мутации гена EGFR чаще встречались у женщин – 26% (11/43), чем у мужчин – 13% (11/86).

–  –  –

Показана статистически достоверная разница между частотой гиперметилирования промотора гена DAPK1 в группе пациентов с метастазами в регионарные лимфоузлы и без метастазов (p = 0,005) (табл. 5). В группе пациентов с метастазами частота эпигенетических нарушений в исследуемом гене оказалась выше. Результаты нашего исследования подтверждают опубликованные данные о том, что гиперметилирование промотора гена DAPK1 ассоциировано с метастазированием, а эпигенетические изменения в гене CDH1 ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого (Ji M., 2011).

  15  Сиквенсограмма участка гена CDH1 c метилированными CG-динуклеотидами представлена на рис. 6. В литературе показано, что гиперметилирование промоторов генов CDH1 и TIMP3 ассоциировано с благоприятным прогнозом течения заболевания (Gu J., 2006).

  Рисунок 6. Метил-специфическое секвенирование на примере гена CDH1.

Примечание: Красные стрелки указывают на метилированные CG-динуклеотиды.

Эпигенетические изменения в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли В данном исследовании выявлены эпигенетические нарушения в образцах ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Частоты гиперметилирования промотора исследуемых генов составляют 0-33% для смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см и 0-22% для смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли (рис. 7).

Частота эпигенетических

–  –  –

Рисунок 7. Распределение частот эпигенетических изменений отдельных исследуемых генов в ряду опухоль – смежная ткань на 2см – смежная ткань на 5см.

Согласно результатам исследования, метилирование промотора гена TIMP3 обнаружено в опухоли у 43% пациентов, в опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см в 24% случаев, а в образцах смежной с опухолью ткани на расстоянии 5 см отсутствовало.

В ходе исследования выявлено, что в образцах смежной нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли гены-супрессоры опухолевого роста RASSF1A и FHIT имеют более высокие частоты гиперметилирования промотора, чем гены, кодирующие белки межклеточного взаимодействия CD44, CDH1, TIMP3 (аномальное метилирование промотора гена TIMP3 в образцах смежной ткани на 5 см от опухоли отсутствует).

Аномальное метилирование промотора гена CDH1 в образцах смежных с опухолью тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли составило 30 и 11% соответственно.

Наличие эпигенетических нарушений в гене CDH1 в смежной с опухолью ткани, как и в   16  гене TIMP3, вероятно, свидетельствует о непосредственном участии опухолевого окружения в процессах канцерогенеза и о наличии «поля канцеризации». Однако, в отличие эпигенетических изменений в гене TIMP3, аберрантное метилирование промотора гена CDH1 определяется в смежной ткани на расстоянии 5 см от опухоли.

Говоря о частотах метилирования в образцах смежной с опухолью ткани, стоит отметить, наличие общей тенденции: в ряду опухоль смежная с опухолью ткань на расстоянии 2 см смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см частота эпигенетических нарушений по всем исследуемым генам снижается, т.е. чем удалённее от опухоли располагается окружающая ткань, тем меньше эпигенетических изменений она содержит (рис. 8). Вероятно, «эпигенетическое поле канцеризации» для легкого не заканчивается на 5 см и необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

Структурные нарушения ДНК, такие как ПГ и МН, определяются строго в опухоли и не затрагивают условно нормальные ткани окружающие опухоль. Исследование статуса аномального метилирования показало, что эпигенетические нарушения (гиперметилирование промотора исследуемых генов), в отличие от структурных нарушений, характерно не только для опухоли, но и для морфологически нормальных тканей, окружающих опухоль. Наличие этих изменений в смежных с опухолью тканях свидетельствует о том, что аномальные молекулярно-генетические процессы распространяются за пределы опухолевой ткани.

Частота эпигенетических изменений, % Рисунок 8. Распределение частот эпигенетических изменений всех исследуемых генов вместе в ряду опухоль – смежная ткань на 2см – смежная ткань на 5см от опухоли.

Результаты экспрессии зрелых микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в НМРЛ Исследование экспрессии микроРНК проводилось на 57 образцах операционного материала (парафиновые блоки), полученных от 19 пациентов с НМРЛ: 7 пациентов с плоскоклеточным раком легкого, 7 случаев аденокарциномы легкого и 5 случаев аденоплоскоклеточного рака легкого. Проведен анализ экспрессии микроРНК: let-7a, miRmiR-205 у пациентов с НМРЛ в опухолевой ткани и смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Для количественной оценки уровня экспрессии микроРНК использовали метод относительных определений количественных значений 2 Ct. В качестве эндогенного контроля принимали значения экспрессии малой ядерной РНК – RNU6 («QIAGEN», Германия). Количественное определение экспрессии микроРНК в исследуемых тканях проводили относительно уровня экспрессии этих микроРНК в калибраторе.

В нашем исследовании в качестве калибратора использовались образцы морфологически нормальной ткани, полученной от пациентов с НХЗЛ. Для оценки воспроизводимости полученных результатов, каждый образец исследовали в двух параллелях. Для удобства представления полученных результатов вычисляли значение логарифма Log2 2 Ct для каждой пробы. После этого высчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Для статистической обработки полученных результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента.

Для выявления статистически значимых ассоциаций полученных результатов экспрессии микроРНК с клинико-морфологическими параметрами пациентов, последних делили на группы по возрасту, стадии процесса, гистологическому типу и степени дифференцировки опухоли. Средний возраст пациентов в данном эксперименте составил 63 года.

МикроРНК Let-7a – микроРНК, кодирующая последовательность которой располагается в регионе 9q22.32, принадлежащая к группе микроРНК let-7. В работах по исследованию функций let-7 у человека показано, что микроРНК этой группы имеют функции супрессора опухоли.

МикроРНК MiR-155 – микроРНК, которая кодируется геном домашнего хозяйства MIR155 и располагается в районе 21q21.3. В настоящее время miR-155 является одной из самых изученных микроРНК в медицине. Показано, что мишенями miR-155 являются около 140 генов, среди них гены-супрессоры опухолевого роста (CEBP, IL17RB, PCCD4, TCF12, ZNF652, TP53INP1) (Neilsen P.M., 2013).

МикроРНК MiR-205 участвует в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптозе. Мишенями miR-205 являются такие гены как PTEN, ERBB3, E2F1, E2F5, ZEB1, ZEB2, VEGF-A, IL24, IL32. У пациентов с НМРЛ выявлена гиперэкспрессия этого типа микроРНК (Markou A., 2008).

В данной работе проводился анализ экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miRв опухолевой и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии от опухоли с помощью ПЦР в режиме реального времени.

На гистограмме (рис. 9) представлены значения уровней экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли у каждого пациента. В опухоли экспрессия let-7a снижена у большинства пациентов. Однако для двух других микроРНК: miR-155, miRизменение уровня экспрессии не столь очевидно. Для более удобного представления полученных данных мы вычисляли среднее значение экспрессии со стандартной ошибкой для каждой микроРНК в опухоли и смежных условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см. Для определения статистической достоверности полученных результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента.

–  –  –

Рисунок 9. Экспрессия исследуемых микроРНК у пациентов с НМРЛ.

  18  На рис. 10 представлены средние значения экспрессии микроРНК со стандартной ошибкой, указанной на гистограмме.

Анализ экспрессии трех микроРНК во всех исследуемых образцах показал, что уровень экспрессии микроРНК let-7a значительно снижен в опухоли по сравнению с условно нормальной тканью как на расстоянии 2 см (р = 0,025), так и на расстоянии 5 см (p = 0,012) от опухоли (рис. 10). Статистически достоверных изменений уровня экспрессии miR-155, miR-205 в опухоли относительно смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии от опухоли не выявлено.

Для определения статистически достоверных ассоциаций полученных данных с гистологическим типом опухоли, выделяли 3 группы НМРЛ: АК, ПКРЛ, АПКРЛ. Проанализированы средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолях и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии при разделении опухолей по гистологическим типам. Статистически значимых различий между экспрессией микроРНК в разных гистологических типах НМРЛ не выявлено. Также не оказалось различий между экспрессией исследуемых микроРНК в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли разных гистологических типов НМРЛ.

Рисунок 10. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в исследуемых образцах ткани.

Для выявления ассоциаций экспрессии микроРНК с возрастом пациентов последних делили на две группы: моложе 63 и старше 63 лет. Анализ экспрессии микроРНК в группе пациентов старше 63 лет не показал различий в уровне экспрессии исследуемых микроРНК между опухолью и смежной условно нормальной тканью, в то время как в группе пациентов моложе 63 выявлены достоверные различия. В группе пациентов моложе 63 лет в опухолевой ткани экспрессия микроРНК let-7a и miR-155 значительно снижена (p=0,015; p=0,048, соответственно) по сравнению со смежной условно нормальной тканью (рис. 11).

Одним из критериев злокачественности новообразования является стадия опухолевого процесса. В нашей работе все пациенты поделены по стадии опухолевого процесса на 2 группы: пациенты с I-II и пациенты с III-IV стадией заболевания. Проводили анализ экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в выделенных группах. На рис.

12 представлены средние значения экспрессии микроРНК в let-7a, miR-155, miR-205 в выделенных группах.

Выявлено снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 (p = 0,03; p = 0,023, соответственно) в опухолевой ткани в группе пациентов с III-IV стадией заболевания по сравнению со смежной условно нормальной тканью (рис. 12). У пациентов с III стадией заболевания достоверных изменений уровня экспрессии исследуемых микроРНК не обнаружено.

Рисунок 11. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 у пациентов моложе 63лет.

Рисунок 12. Экспрессия исследуемых микроРНК у пациентов с III-IV стадией НМРЛ.

При разделении пациентов по степени дифференцировки опухоли, выделено 2 группы: дифференцированные (высоко и умереннодифференцированные) и низкодифференцированные опухоли. В выделенных группах проводили анализ экспрессии исследуемых микроРНК во всех образцах тканей (опухолевой и условно нормальной на 2 и 5 см от опухоли). В группе дифференцированных опухолей не выявлено статистически значимых изменений экспрессии исследуемых микроРНК. На рис. 13 приведены данные об экспрессии (средние значения) микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в группе низкодифференцированных опухолей.

Уровень экспрессии микроРНК let-7a в низкодифференцированных опухолях достоверно снижен значительно сильнее (p = 0,013) по сравнению условно нормальной тканью на расстоянии 5 см от опухоли (рис. 13). Снижение экспрессии let-7a относительно условно нормальной ткани на расстоянии 2 см от опухоли статистически не значимо, однако наблюдается явная тенденция (p = 0,06), и, вероятно, при увеличении выборки возможно появление значимых отличий.

Рисунок 13. Экспрессия микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в низкодифференцированных опухолях у пациентов с НМРЛ.

В группе низкодифференцированных опухолей достоверной разницы экспрессии микроРНК miR-155 и miR-205 в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на различном расстоянии не выявлено.

Для оценки изменения уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в зависимости от статуса курения, выделены 2 группы: курящие и некурящие пациенты.

Проводили сравнительный анализ данных экспрессии микроРНК в образцах опухоли и образцах смежной условно нормальной ткани в выделенных группах. В группе курящих пациентов не выявлено статистически значимых различий экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли и смежной ткани.

Экспрессия микроРНК let-7a в опухолевой ткани у некурящих пациентов значительно снижена (p = 0,044) относительно условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли (рис. 14). Достоверных различий экспрессии микроРНК miR-155, miRне выявлено.

Рисунок 14. Средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой ткани у некурящих пациентов.

–  –  –

1,39 1,37 1,54 2,1 Рисунок 15. Среднее значение экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 во всех исследуемых образцах.

Рисунок 16. Средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах курящих и не курящих пациентов.

В группе курящих пациентов экспрессия микроРНК let-7a достоверно снижена (p = 0,038) в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли. Разница средних значений   22  экспрессии для микроРНК miR-155 в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах курящих/некурящих пациентов не достоверна, однако, определенно существует тенденция к статистической значимости подобных отличий (p = 0,07). Для микроРНК miR-205 достоверных отличий в экспрессии не выявлено. На рис. 17 представлены средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными/низкодифференцированными опухолями.

Анализ показал, что условно нормальная ткань на расстоянии 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями имеет противоположные профили экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205. У пациентов с высоко и умереннодифференцированными опухолями уровень экспрессии исследуемых микроРНК снижен, а в группе пациентов с низкодифференцированным раком уровень экспрессии наоборот повышен. Статистически значимыми оказались отличия в значениях экспрессии miR-155 (p = 0,046) и miR-205 (p = 0,043) в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли между выделенными группами пациентов. При сравнении уровня экспрессии miR-155 и miR-205 в смежной с опухолью нормальной ткани в группах пациентов с различной степенью дифференцировки опухоли выявлено, что в низкодифференцированных опухолях экспрессия этих микроРНК выше.

Рисунок 17. Средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями.

В ряде работ показано, что гиперэкспрессия miR-205 характерна для плоскоклеточного НМРЛ с чувствительностью и специфичностью 96 и 90% соответственно (Lebanony D., 2009; Bishop J.A., 2010). Статистически достоверных отличий экспрессии микроРНК miR-205 в опухоли относительно смежной с опухолью условно нормальной ткани и каких-либо ассоциаций с клинико-морфологическими параметрами пациентов.

Проведенное исследование показало, что, во-первых, экспрессия let-7a снижена в опухолевой ткани, относительно смежной условно нормальной ткани. Во-вторых, снижение уровня экспрессии let-7a и miR-155 в опухоли характерно для относительно молодых (моложе 63 лет), некурящих пациентов, поздней стадии опухолевого процесса, низкодифференцированных опухолей. В-третьих, уровни экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 5 см различны в группах курящих/некурящих пациентов, пациентов с различной дифференцировкой опухоли.

  23  Выявлено, что у относительно молодых пациентов онкологические заболевания обычно протекает более агрессивно, чем у пациентов старше. Это явление может объяснить тот факт, что в нашем исследовании снижение уровня экспрессии микроРНК в опухолевой ткани, выполняющих функции супрессоров опухоли, let-7a и miR155 ассоциировано с молодым возрастом, поздней стадией заболевания и низкой степенью дифференцировки. Результаты нашего исследования показывают обратную корреляцию между уровнем экспрессии двух микроРНК (в большей степени let-7a, в меньшей – miR-155) и злокачественностью опухолевого процесса. Этот факт позволяет предположить использование микроРНК let-7a и miR-155 в перспективе в качестве прогностических маркеров опухоли, вероятно, свидетельствующих о не благоприятности прогноза.

ВЫВОДЫ

1. Частоты аллельных нарушений локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938 в НМРЛ составили 47%, 43%, 60%, 52%, 52%, 47%, 49%, соответственно. Потери гетерозиготности и/или микросателлитной нестабильности в смежных с опухолью условно нормальных тканях на 2 и 5 см от опухоли не обнаружено.

2. Частоты аномального метилирования промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, CDH1, CD44, TIMP3, MGMT в НМРЛ составили 70%, 52%, 17%, 61%, 34%, 43% и 15%, соответственно. В смежных с опухолью условно нормальных тканях на 2 и 5 см от опухоли выявлены эпигенетические изменения, частота которых снижается при удалении от опухолевого очага.

3. Частота мутаций гена EGFR составила 19%: 81% мутаций гена EGFR составляют делеции 19 экзона, 19% приходится на однонуклеотидные замены в 21 экзоне. Мутации в гене KRAS обнаружены в 17% случаев, из них 84% мутаций в 12 кодоне гена. Транслокация гена ALK выявлена у 6% пациентов.

4. Экспрессия микроРНК let-7a достоверно снижена в опухолевой ткани, относительно смежной условно нормальной ткани. Снижение уровня экспрессии let-7a и miRв опухоли характерно для относительно молодых, некурящих пациентов, III-VI стадии заболевания, низкодифференцированных опухолей. Уровни экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в условно нормальных тканях на расстоянии 5 см от опухоли различны в группах курящих/некурящих пациентов, пациентов с различной степенью дифференцировки опухоли.

5. В качестве маркеров неблагоприятного прогноза могут рассматриваться аллельные нарушения локусов D2S405, D3S1300, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 в опухолевой ткани. В качестве маркеров дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака легкого – потеря гетерозиготности и/или микросателлитная нестабильность локусов D9S925, D17S938, аномальное метилирование промоторов генов CDH1 и CD44.

6. В смежных с опухолью морфологически неизмененных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли происходят такие эпигенетические изменения как, гиперметилирование промоторов генов и изменение экспрессии микроРНК. Выявленные в смежных с опухолью условно нормальных тканях эпигенетические изменения формируют «опухолевое окружение» выявленное на расстоянии 5 см от опухолевого очага.

Практические рекомендации

1. Выявленные молекулярные повреждения: аллельный дисбаланс локусов D2S405, D3S1300, метилирование генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 в опухолевой ткани могут использоваться в качестве маркеров прогноза НМРЛ в комплексе с другими клиническими показателями.

2. Аллельные нарушения локусов D9S925, D17S938, аномальное метилирование промоторов генов CDH1 и CD44 могут быть использованы в качестве диагностических маркеров плоскоклеточного рака легкого.

3. Определение мутаций генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK у пациентов с не плоскоклеточным НМРЛ (аденокарцинома, аденоплоскоклеточный рак) рекомендовано для определения чувствительности к таргетной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

Шикеева А.А. Аллельные нарушения у пациентов с немелкоклеточным раком 1.

легкого / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Архив Патологии. – 2013. – № 2. – Том 75. – С. 3-8.

Шикеева А.А. Молекулярно-генетические аспекты немелкоклеточного рака легкого / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. – 2013. – №5. – С. 62-67.

Шикеева А.А. Эпигенетические изменения при немелкоклеточном раке легкого / 3.

А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. – 2013. – №5. – С. 19-25.

Шикеева А.А. Анализ молекулярно-генетических изменений в гене EGFR у пациентов с НМРЛ / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А.

Франк // Онкохирургия. – 2011. – № 2. – Том 3. – С. 87-88.

Публикации в других изданиях:

Шикеева А.А. Молекулярно-генетические изменения у пациентов с немелкоклеточным раком легкого / А.А. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Вопросы онкологии. – 2013 – приложение к №3 – том 59 – Материалы VIII Всероссийского съезда онкологов. Том I – стр. 417.

6. Shikeeva A.A. Allelic imbalance in non-small cell lung cancer / Shikeeva A.A., Kekeeva T.V., Zavalishina L.E., Andreeva Y.Y., Frank G.A. // European Journal of Human Genetics – 2013 – June; 21 (Supplement 2) – p. 305 (P11.168).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

FISH – флуоресцентная гибридизация in situ АК – аденокарцинома АПКРЛ – аденоплоскоклеточный рак легкого МН – микросателлитная нестабильность МЧ-ПЦР – метил-чувствительная полимеразная цепная реакция НМРЛ – немелкоклеточный рак легкого НХЗЛ – неспецифические хронические заболевания легких ПААГ – полиакриламидный гель ПГ – потеря гетерозиготности ПКРЛ – плоскоклеточный рак легкого ПЦР – полимеразная цепная реакция



Похожие работы:

«Всероссийская научно­практическая конференция молодых ученых, аспирантов и студентов "Экология и безопасность в техносфере: современные проблемы и пути решения" МОТИВАЦИЯ ЗАНЯТИЯ ШЕЙПИНГОМ СРЕДИ СТУДЕНТОВ В ЮТИ ТПУ А.К. Курманбай, студентк...»

«Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Методические указания к контрольным работам и варианты контрольных работ для студентов заочного отделения медицинского факультета специальности "Фармация" Петрозаводск Издательство ПетрГУ Рассмотрены и ут...»

«1. Цель освоения дисциплины Целью освоения дисциплины "Экология" является формирование у студентов навыков устанавливать причинную обусловленность негативных воздействий деятельности человека на окружающую среду и разрабатывать систему мероприятий по их ограничению и пре...»

«Методы экологических исследований Юг России: экология, развитие. №3, 2009 Methods of ecological researches The South of Russia: ecology, development. №3, 2009 МЕТОДЫ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ УДК 574.587 (262.81-17).001.18 МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ПРОГНОЗА СОСТОЯНИЯ БЕНТОСА В СЕВЕРНОМ КАСПИИ © 2009....»

«Модифицированная программа по курсу "Технология" для неделимых 5-8 классов Обоснование программы Образовательная область "Технология" обеспечивает формирование политехнических и общетрудовых знаний в области технологии, экономики, организации и экологии современного производства, представления о перспективах его развития...»

«Биологические науки Н.А. Дуденкова, О.С. Шубина, Л.П. Тельцов ФГБОУ ВПО "Мордовский государственный педагогический институт имени М.Е. Евсевьева" ФГБОУ ВПО "Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева", г. Саранск М...»

«ПРИНЯТО УТВЕРЖДЕНО Решением Ученого cовета Приказом от "29" марта 2016 г. от "29" марта 2016 г. № 8 Протокол № 3 ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНЫХ ИСПЫТАНИЙ в Аспирантуру ФГБНУ "ГосНИОРХ" Направление подготовки 06.06.01. "Биологические науки" Научная специальность 03.02.08 "Экология" Санкт-Петербург 2016 год Ог...»

«МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Горно-Алтайский государственный университет" МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ САМОСТО...»

«Учреждение высшего образования "Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова" УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе МГЭУ им. А.Д. Сахарова О.И. Родькин 2012 г. Регистрационный № УД-_/р. ГИДРОЭКОЛОГИЯ Учебная прогр...»

«Луценко Е.С. и др. Перифитонные цианобактерии литорали. УДК 582.232(574.586) Перифитонные цианобактерии литорали Кольского залива Баренцева моря Е.С. Луценко1, С.С. Шалыгин2, Д.А. Давыдов2 Факультет пищевых технологий и биологии МГТУ, кафедра микробиологии Полярно-альпийский ботанический сад-институт им. Н.А. Аврорина КНЦ РАН, лабо...»

«УДК 619:615:37.01210 ОБЕСПЕЧЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ В БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА И ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРТОВ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ А. Я. Самуйленко, академик РАСХН В.И. Ереме...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.