WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«ИССЛЕДОВАНИЕ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С УЧАСТИЕМ ФОТОАКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ И НИТРОКСИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ МЕТОДАМИ ЭПР СПЕКТРОСКОПИИ ...»

На правах рукописи

КРУМКАЧЕВА ОЛЕСЯ АНАТОЛЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ С

УЧАСТИЕМ ФОТОАКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ И НИТРОКСИЛЬНЫХ

РАДИКАЛОВ МЕТОДАМИ ЭПР СПЕКТРОСКОПИИ

01.04.17 – химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных

состояний вещества

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Новосибирск - 2013

Работа выполнена на кафедре химической и биологической физики федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» (Новосибирский государственный университет, НГУ) и в лаборатории магнитного резонанса федерального государственного бюджетного учреждения науки Института «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук доктор физико-математических наук, профессор

Научный руководитель Багрянская Елена Григорьевна Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт «Международный томографический центр» Сибирского отделения Российской академии наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им.



Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук доктор физико-математических наук, профессор

Официальные оппоненты Дзюба Сергей Андреевич Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук доктор физико-математических наук Тарасов Валерий Федорович Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное учреждение Ведущая науки Казанский физико-технический институт им.Е.К.

организация Завойского Казанского научного центра Российской Академии наук

Защита состоится “ 23” октября 2013 г. в 1630 часов на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической кинетики и горения им.

В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук по адресу: 630090, Новосибирск 90, ул. Институтская 3, ИХКГ СО РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической кинетики и горения им. В.В. Воеводского Сибирского отделения Российской академии наук.

Автореферат разослан сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук А.А. Онищук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание новых функциональных систем на базе супрамолекулярных комплексов является одной из перспективных задач в областях современной химии, биологии и нанотехнологий. Именно к таким системам относятся комплексы циклодекстрина (ЦД) с фотоактивными молекулами, предназначенные для проведения направленного синтеза и увеличения стабильности лекарств, и комплексы ЦД, ковалентно-связанные с нитроксильными радикалами (НР). Детальное изучение этих систем необходимо для понимания и усовершенствования их функциональных свойств.





Проведение фотолиза в ЦД может приводить к значительному изменению состава продуктов реакций и являться одним из способов проведения направленного синтеза. В тех случаях, когда имеет место зависимость возбужденных состояний молекулы включения от полярности локального окружения, проведение фотолиза в ЦД может привести к изменению реакционного состояния. Другим механизмом влияния ЦД является ограничение реакционной зоны объемом полости ЦД и увеличение времени жизни образующейся при фотолизе радикальной пары (РП). В отличие от гомогенного раствора, где время жизни радикальных пар составляет доли наносекунд, в полости ЦД радикалы удерживаются значительное время – десятки и сотни наносекунд. Это приводит к существенному увеличению выхода клеточных продуктов. Поскольку расстояние между радикалами в полости ЦД сравнимо с размером радикалов, следует ожидать, что при проведении фотолиза в ЦД обменное взаимодействие в РП будет оказывать существенное влияние на магнитные и спиновые эффекты, такие так Химическая Поляризация Ядер (ХПЯ), Химическая Поляризация Электронов (ХПЭ).

Другим направлением развития супрамолекулярной химии с участием циклодекстринов является синтез ЦД, ковалентно-связанных с НР. Такие комплексы являются перспективными для использования в качестве новых поляризующих агентов с целью увеличения сигналов ЯМР протеинов, а также в качестве эффективных и селективных тушителей флуоресценции. Возможность применения НР, ковалентно связанных с ЦД, для решения различных задач в значительной степени зависит от структуры комплекса, что определяет важность исследования равновесия в таких системах и определения параметров, которые в наибольшей степени оказывают влияние на равновесие.

Одна из основных проблем метода спиновых меток и зондов – быстрое восстановление аскорбиновой кислотой, альбумином и другими ферментативными системами до диамагнитного состояния в живых организмах.

Недавно было показано, что замена близких к радикальному центру метильных заместителей на спироциклические в пиперидиновых НР значительно улучшает их стабильность, а также увеличивает время их электронной спиновой релаксации в диапазоне температур 90-130 К1. Известно, что для НР пирролинового и пирролидинового типа константа скорости восстановления биогенными восстановителями почти на порядок ниже чем для НР пиперидинового типа. Поэтому актуальной задачей является синтез новых спирогексан-замещенных пирролиновых и пирролидиновых радикалов и исследование возможности их применения в качестве спиновых меток для изучения структуры и функций биополимеров.

Основными целями работы являются исследование влияния -ЦД на механизмы формирования спиновых эффектов и механизмы фотолиза ароматических кетонов; изучение структуры супрамолекулярных комплексов ЦД со стабильными нитроксильными радикалами; исследование возможности применения новых спиновых меток на основе 2,5-спироциклогексанзамещенных НР пирролинового типа для структурных исследований биополимеров.

Конкретными задачами работы являлись:

1. Экспериментальное исследование спиновых эффектов ХПЭ и ХПЯ в реакциях фотолиза трех различных кетонов: деоксибензоина (ДОБ), дибензилкетона (ДБК) и бензофенона (БФ) и определение роли ЦД в исследуемых фотохимических реакциях.

2. Исследование влияния -ЦД на структуру электронных уровней и релаксационные свойства нижних триплетных состояний ароматических кетонов (БФ, ДОБ) методами ВР ЭПР и импульсного ЭПР

3. Исследование типа структурного равновесия серии комплексов различных НР (в том числе pH чувствительного), ковалентно связанных с TRIMEB (трижды метилированный -ЦД) методами стационарного и импульсного ЭПР.

Исследование влияния образования ковалентной связи с TRIMEB на функциональность и стабильность pH-чувствительного имидазолинового НР.

4. Измерение скоростей электронной спиновой релаксации 2,5спироциклогексан-замещенных нитроксильных радикалов в широком диапазоне температур методом импульсного ЭПР. Измерение расстояния в модельном РНК дуплексе с использованием 2,5-спироциклогексан-замещенной нитроксильной спиновой метки и сравнение полученных результатов со стандартной 2,2,5,5-тетраметил-замещенной нитроксильной меткой.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование влияние (ЦД) на формирование эффектов спиновой поляризации ХПЭ и ХПЯ. Показано, что увеличение времени жизни радикальной пары (РП) в ЦД и обменное взаимодействие в РП являются основными факторами, влияющими на формирование спиновой поляризации.

Впервые показано, что параметры расщепления в нулевом магнитном поле (D и E) триплетных состояний ароматических кетонов зависят от структуры комплекса с ЦД и полярности локального окружения CO-группы. Обнаружено, что скорость электронной релаксации в триплетных молекулах при T=30 K уменьшается в комплексе с ЦД по сравнению с гомогенным раствором из-за ограничения мобильности триплетной молекулы.

Для ряда новых комплексов НР, ковалентно связанных с ЦД (TRIMEB), методами ЭПР показано, что наблюдается равновесие между комплексами с радикальным фрагментом вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость TRIMEB, с преобладанием той или иной формы в зависимости от структуры НР и линкера. Ковалентное присоединение pHчувствительного имидазолинового радикала к TRIMEB сохраняет pHчувствительность радикала, но не увеличивает его стабильность.

Для новых 2,5-спироциклогексан-замещенных НР пирролинового типа, обладающих стабильностью по отношению к биогенным восстановителям, показана применимость для структурных исследований биополимеров методом электрон-электронный резонанс) на примере измерений ДЭЭР (двойной расстояний в модельном РНК дуплексе.

Научная и практическая значимость работы. Результаты работы вносят существенный вклад в развитие представлений о физико-химических процессах с участием циклодекстринов, короткоживущих радикалов и стабильных радикалов. Полученная в работе информация о механизмах эффектов ХПЯ и ХПЭ в радикальных парах в циклодекстринах и о влиянии циклодекстрина на параметры расщепления в нулевом магнитном поле (D и E) триплетных состояний ароматических кетонов может быть использована при изучении фотохимических реакций в супрамолекулярных комплексах.

Полученные в работе данные о зависимости структуры комплекса НР, ковалентно связанного с ЦД, от строения линкера и нитроксильного фрагмента могут быть в дальнейшем использованы для применения таких систем в качестве селективных поляризующих агентов по механизму ДПЯ и селективных тушителей флуоресценции.

Полученная информация о функциональных свойствах новых спироциклогексан-замещенных пирролиновых НР является важным для их применения в качестве спиновых меток для структурных исследований биополимеров.

Личный вклад соискателя. Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором либо при его непосредственном участии. Автор диссертации участвовал в разработке плана исследований, проведении экспериментов, обсуждении результатов, формулировке выводов и подготовке публикаций по теме диссертационной работы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на международных и российских конференциях: EUROMAR 2013 (Херсониссос, Греция, 2013), VIII Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Новосибирск, Россия, 2012); 6th conference on Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides (Марсель, Франция, 2011); 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena (Нордвейк, Нидерланды, 2011); 3rd International Summer School “Supramolecular Systems in Chemistry and Biology” (Львов, Украина, 2010); Всероссийская молодежная школа с международным участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике» (Новосибирск, Россия, 2010); First Symposium “Supramolecular Chemistry for Material and Life Sciences (Новосибирск, Россия, 2010); Международная научная студенческая конференция (Новосибирск, Россия, 2010); Международная школа молодых ученых «Современные проблемы магнитного резонанса и его применения»

(Казань, Россия, 2009 г); V Международный симпозиум “Дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур” (Казань, Россия, 2009), Central European Conference on Photochemistry (Бад-Гаштайн, Австрия, 2008).

Исследования были поддержаны Министерством образования и науки Российской Федерации (ФЦП) «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2012-2013 гг. проект № 8456»

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых научных международных журналах, рекомендованных ВАК, и 16 тезисах докладов международных и российских конференций, 5 из которых были представлены в виде устных докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, четырех глав, в которых изложены полученные автором результаты, выводов, благодарностей и списка литературы, включающего 182 наименований. Работа изложена на 118 страницах, содержит 8 таблиц, 26 рисунков и 23 схемы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражена актуальность темы диссертации, сформулированы основные цели работы и дано описание структуры диссертации.

В первой главе диссертации приводится краткий литературный обзор исследований супрамолекулярных комплексов ЦД (схема 1) и рассмотрены основные методы их исследования.

Проведено обсуждение основных механизмов влияния ЦД на электронно-возбужденные состояния и фотохимические реакции, особое внимание уделено рассмотрению реакций, протекающих по радикальному механизму, в том Схема1. Структура -ЦД числе, обсуждению механизмов формирования эффектов ХПЭ и ХПЯ в гомогенных растворах и организованных средах.

Описано применение метода ЭПР с временным разрешением (ВР ЭПР) для исследования триплетных состояний ароматических кетонов. Рассмотрены особенности комплексов НР, ковалентно связанных с ЦД, и перспективы их применения для увеличения стабильности НР, селективного тушения флуоресценции и т.д. Приведен обзор методик изучения равновесия в комплексах НР, ковалентно связанных с ЦД, с более подробным рассмотрением метода модуляции электронного спинового эха (ESEEM). Обсуждается применение метода двойного электрон-электронного резонанса (ДЭЭР) для изучения структуры и функций биополимеров, и рассмотрены проблемы, возникающие при проведении исследований в “живых” системах и связанные с быстрым восстановлением НР. Обсуждаются возможные варианты решения данной проблемы, в том числе перспективность создания спиновых меток на основе спироциклогексан-замещенных НР. На основе анализа литературных данных сформулированы основные задачи для решения в рамках настоящей работы.

Вторая глава диссертации посвящена изучению влияния

-ЦД на механизмы формирования спиновых эффектов методами ЯМР и спиновой химии - ХПЯ и ХПЭ на примере фотохимической реакции трех кетонов (деоксибензоина (ДОБ), дибензилкетона (ДБК) Схема 2. Химическая структура и общая и бензофенона (БФ)) – схема фотолиза для исследуемых кетонов.

диссоциации и переноса атома водорода (Схема 2). Для повышения концентрации образуемых комплексов в работе использовался метилированный случайным образом -ЦД (R-ЦД). Образование комплекса проверялось методом 1H ЯМР и УФ спектроскопии.

При фотолизе ДОБ в присутствии ЦД (Рис. 1) в спектре ХПЯ наблюдаются сигналы на продуктах рекомбинации бензильного и бензоильного радикалов (РП1), формирующихся в результате диссоциации молекулы ДОБ.

Дополнительно наблюдается сигнал ХПЯ на протонах R-ЦД (3.2 м.д.), что указывает на протекание фотохимической реакции переноса атома Н с внутренней поверхности ЦД R-ЦД на молекулу ДОБ (РП2).

Таким образом, при фотолизе ДОБ в R-ЦД одновременно реализуются два механизма:

диссоциация и перенос атома H. Аналогичные эксперименты ХПЯ (Рис. 1) показали, что при фотолизе ДБК в R-ЦД имеет место диссоциации кетона, в случае фотолиза БФ – перенос атома водорода с R-ЦД. Полученные для комплекса ДБК/R-ЦД результаты согласуются с работой Петровой с соавторами, где методом ХПЯ изучали фотолиз ДБК в -ЦД.

Рис 1. a) Стационарные спектры ЯМР комплексов R-ЦД с 1) ДБК, 2) ДОБ, 3) БФ в D2О, (* = H2O) и b) соответствующие спектры ХПЯ, полученные после фотолиза комплексов. Длительность регистрирующего РЧ импульса – 8.7 мкс, задержка между лазерным и РЧ импульсами -1 мкс. Обозначения (1) ДОБ(I) = PhA–CO–CH2B–PhC; R-ЦД (II); Дифенилэтан (IV) = (PhCH2A)2; Промежуточный продукт перегруппировки (III) = Ph-CO-C6H5-CH2A. (2) ДБК (I) = PhC–CH2B–CO– CH2B–PhC, R-ЦД (II), Промежуточный продукт реакции перегруппировки (III) = Ph–CH2–CO–C6H5–CH2A, Дифенилэтан (IV) = (PhCH2A)2. (3) БФ (I) (Ph)2A–CO, (II) R-ЦД, (III) продукт рекомбинации радикала R-ЦД с кетильным радикалом БФ.

Сравнение результатов экспериментов ХПЯ при фотолизе ДОБ в гомогенном растворе и в присутствии R-ЦД показало, что в случае диссоциации радикалов влияние образования комплекса сводится к увеличению времени жизни РП1 и, соответственно, увеличению выхода клеточного продукта. При фотолизе ДОБ в ЦД обнаружено увеличение выхода продукта реакции перегруппировки, что свидетельствует о высокой подвижности радикалов внутри полости ЦД. Согласно правилу Каптейна для ХПЯ в сильных магнитных полях по S-T0 механизму, наблюдаемая на протоне R-ЦД поляризация должна быть положительной. Однако в эксперименте наблюдается отрицательный знак поляризации, что, как мы предполагаем, определяется формированием ХПЯ по S-T_ механизму. Формирование ХПЯ по S-T_ механизму в молекулярно организованных средах обусловлено увеличением повторных контактов в РП и малым расстоянием между партнерами РП.

При фотолизе комплекса ДБК/R-ЦД сигнал ХПЭ не наблюдается, что, как мы предполагаем, является следствием быстрой рекомбинации радикалов в РП1 в полости R-ЦД. При фотолизе ДОБ и БФ в присутствии R-ЦД регистрируется широкий неразрешенный эмиссионный сигнал ХПЭ (Рис. 2).

Это отличается от ситуации в гомогенном растворе, где при фотолизе ДОБ наблюдается мультиплетная ХПЭ (Рис. 2). На основании сравнения экспериментального спектра ХПЭ с расчетными для радикалов в РП1 и РП2, а так же учитывая отсутствие сигнала ХПЭ при фотолизе комплекса ДБК/R-ЦД, в работе сделан вывод о том, что наблюдаемый при фотолизе комплекса ДОБ/R-ЦД спектр ХПЭ соответствует спектру РП2, образующейся в результате переноса атома Н. Для РП2, в которой только один из партнеров является подвижным, обратная рекомбинации затруднена, и время жизни РП2 значительно больше, чем для РП1. Это позволяет в течение длительного времени (порядка 16 мкс) детектировать методом ХПЭ сигнал от РП2.

Рис 2. ВР ЭПР спектры, зарегистрированные (A) после лазерного возбуждения водного комплекса ДОБ/R-ЦД. На рисунке указаны задержка после лазерного импульса и время интегрирования. (B) через 300 нс после лазерного возбуждения ДОБ в гомогенном растворе (изопропанол). Черная линия соответствует экспериментальному спектру, серая линия – расчетному спектру изопропильного радикала и кетильного радикала ДОБ.

Наблюдаемая при фотолизе ДОБ/R-ЦД и БФ/R-ЦД эмиссионная интегральная поляризация может быть сформирована по триплетному и по S-T_ механизму. Для формирования поляризации по триплетному механизму время жизни триплетного состояния должно быть меньше, чем время электронной спиновой релаксации в триплетной молекуле. На основе литературных и экспериментальных данных в работе сделаны оценки, согласно которым предполагаемое время жизни триплетной молекулы ДОБ в R-ЦД (100-200 нс) существенно больше, чем время электронной релаксации в триплете (14 нс), поэтому наблюдаемая эмиссионная ХПЭ формируется по S-T- механизму.

Увеличение времени жизни РП в R-ЦД по сравнению с гомогенными растворами приводит к изменению механизма формирования химической ядерной и электронной поляризации. Вследствие того, что большую часть времени жизни радикалы проводят внутри ЦД, то есть на малом расстоянии друг от друга, обменное взаимодействие оказывает большое влияние на эффекты ХПЯ и ХПЭ, которые формируются за счет S-T_ переходов.

В третьей главе приведены результаты исследования влияния циклодекстринов на электронную структуру нижнего возбужденного триплетного ароматических кетонов (БФ, ДОБ) методами ВР и импульсного ЭПР. Для ароматических кетонов параметр расщепления в нулевом магнитном поле D определяется вкладами от спин-спинового дипольного взаимодействия (Dss) и спин-орбитального взаимодействия между 3n* и 3* состояниями3 (Dso). В данной работе мы использовали высокую чувствительность параметров расщепления в нулевом магнитном поле ароматических кетонов к полярности локального окружения для определения локализации карбонильной группы (внутри/снаружи полости ЦД) и электронной структуры нижнего триплетного состояния кетонов в комплексе с ЦД.

Для этого было были измерены спектры ВР ЭПР триплетов ДОБ и БФ при T=30 K в полярном растворителе трифторэтаноле (ТФЭ), неполярном метилциклогексане (МЦГ) и в комплексе с R-ЦД в водном растворе (Рис. 3).

Параметры триплетных молекул ДОБ и БФ в различных растворителях, полученные из моделирования экспериментальных спектров, представлены в таблице 1.

Зарегистрированный спектр ВР ЭПР триплетного состояния БФ в комплексе с R-ЦД близок к спектру в неполярном растворителе метилциклогексане, где, согласно литературным данным, реакционным состоянием является 3n–*4. Для ДОБ в неполярном растворителе, метилциклогексане, сигнал от триплетной молекулы не наблюдается. Мы предполагаем, что в данном случае триплетное состояние является комбинацией 3n-* и 3-* состояний, каждое из которых дает примерно одинаковый вклад. Для такой ситуации ожидаемое значение Рис 3. Экспериментальные (линии с шумом) и расчетные ВР ЭПР спектры, полученные при фотолизе БФ (a) и ДОБ (b) при T=30 K в ТФЭ, в смеси H2O/глицерин (7:3) в присутствии 3 mM R-ЦД и в МЦГ. Интервал интегрирования по времени - 0.6-0.8 мкс.

параметра D больше чем величина кванта микроволнового поля (9 гГц), поэтому сигнал ЭПР триплетной молекулы в X диапазоне (9 гГц) не может быть зарегистрирован5. Наблюдение ЭПР спектра триплетного состояния ДОБ в комплексе с R-ЦД указывает на полярное окружение CO группы, а увеличение значения D для триплета ДОБ при образовании комплекса с R-ЦД в сравнении со значением в трифторэтаноле указывает на увеличение вклада от 3-* состояния. Неоднородное уширение линий ВР ЭПР в неполярных растворителях при образовании комплекса с R-ЦД в водных растворах и в неполярных растворителях обусловлено наличием различных геометрических конформаций возбужденной молекулы.

Таблица 1. Параметры расщепления в нулевом магнитном поле (D и E) (±0.

1 ГГц), ширина распределения D и E (±0.1 ГГц), начальная заселенность уровней энергии триплетного состоянии Py. Px. Pz (±0.1), полученные из моделирования экспериментальных спектров.

D(ГГц) /E/(ГГц) D (ГГц) E (ГГц) Молекула Py Px Pz

–  –  –

Мы предполагаем, что разница между экспериментальными ЭПР спектрами триплетных молекул ДОБ и БФ главным образом определяется их различным расположением внутри полости R-ЦД. CO-группа БФ располагается внутри полости R-ЦД и в большой степени экранирована от молекул воды (полярного растворителя) в сравнении с комплексом ДОБ/R-ЦД.

Методом импульсного ЭПР было изучено влияние ЦД на времена продольной и поперечной электронной релаксации T1 и T2 триплетного состояния молекулы БФ в смеси H2O/глицерин и в неполярном растворителе толуоле при T=30 K (Рис. 4). Как видно из рис.4 T2 и T1 зависят от растворителя и от ориентации триплетной молекулы относительно направления внешнего магнитного поля. Наиболее короткое время релаксации (для T1 и T2) наблюдается на краях спектра ЭПР (250 и 500 мТл).

Эти положения соответствуют ориентации оси z (ось z || C=O связи) триплетной молекулы вдоль внешнего магнитного поля.

Измеренные времена релаксации (T1 и T2) в присутствии R-ЦД значительно длиннее, чем в гомогенном растворителе толуоле (максимальные значения T1ЦД/T1толуол=1.5 и T2ЦД/T2толуол=4).

В рамках предположения, что для поперечной и продольной релаксации основным является динамический процесс релаксации, определяющийся модуляцией диполь-дипольного Рис 4. (a) Эхо-детектируемый спектр взаимодействия, уменьшение ЭПР триплетного состояния БФ в смеси скорости электронной H2O/глицерин (7:3) в присутствии 3 mM релаксации триплетного R-ЦД (импульс /2 – 50 нс; задержка состояния БФ в присутствии R- между импульсами – 180 нс).

Зависимость T2 (b) и T1 (c) от значения ЦД в сравнении с гомогенным внешнего магнитного поля: – в смеси растворителем определяется H2O/глицерин (7:3) в присутствии 3 mM ограничением движения из-за R-ЦД, – в толуоле.

эффекта локализации в полости R-ЦД.

Четвертая глава диссертации посвящена исследованию комплексов НР пиперидинового (NCD1, NCD2), пирролинового (NCD4), пирролидинового (NCD3), и имидазолинового (NCD5) типа, ковалентно связанных с трижды метилированным -ЦД (TRIMEB). Для НР, ковалентно связанного с ЦД, характерны различные типы равновесия между формами: это равновесие типа (B - A) (схема 4 модель 1) и равновесие (B - D) (схема 4 модель 2). Положение НР относительно полости ЦД, (НР находится внутри ЦД, снаружи полости ЦД, либо прикрывает полость ЦД) определяется структурой ЦД, длиной и структурой связывающего линкера.

Схема 3. Химическая структура исследованных комплексов.

Для изучения процесса комплексообразования мы использовали методы ESEEM (метод Модуляции Электронного Спинового Эха)6 (T=80

K) и стационарного ЭПР (Т=300 K). Эффект ESEEM для НР возникает вследствие сверхтонкого анизотропного взаимодействия электрона с ядром дейтерия D2O. В случае удаленных ядер частота модуляции соответствует Зеемановской частоте дейтерия, а амплитуда модуляции, нормированная Схема 4. Возможные структурные формы НР, на амплитуду спинового эха (Рис. 5), K(2H) прямо ковалентно связанного с пропорциональна количеству молекул дейтерия в циклодекстрином.

ближайшем окружении НР. Для количественного описания степени доступности НР к молекулам дейтерия использовался параметр Rk=K(2H)(комплекс)/K(свободный радикал)100%. Уменьшение Rk свидетельствует о погружении НР в полость TRIMEB. Из моделирования экспериментальных спектров ЭПР были получены значения времени корреляции движения НР tcorr, которое характеризует динамику радикалов.

Образование комплекса между TRIMEB и НР ограничивает подвижность радикала, тем самым уменьшая значение tcorr.

Для определения типа равновесия (модель 1 или модель 2 на схеме 4)7 в NCDs мы одновременно анализировали измеренные значения tcorr, aN и K(2H) (Рис. 5, табл. 2) и сравнивали их со значениями для свободных НР и со значениями для NCDs в присутствии молекулы–конкурента 1адамантанметанол (AM).

–  –  –

Рис. 6. (а) ЭПР спектры Х-диапазона NCD5 при pH=5.3 (черная линия) и pH=1.2 (синяя линия). (b) Изменение константы СТВ для NCD5 при изменении pH в водном растворе. Константа СТВ aN измерялась между центральной и низкопольной компонентами в ЭПР спектре НР. (c) Зависимость сигнала ЭПР от времени для 0.1 мМ NCD5 в присутствии 1 мМ аскорбата при pH=6.8.

В итоге, комплекс NCD4 показал оптимальное сочетание свойств TRIMEB и НР. Среди всех 5 исследованных систем, NCD4 является наиболее перспективным с точки зрения его использования в качестве селективного тушителя флуоресценции: (1) внутренняя полость TRIMEB остается свободной, что позволяет эффективно образовывать комплекс включения с другими молекулами (2); структура соединительного мостика обеспечивает расположение НР рядом с молекулой включения.

Пятая глава диссертации посвящена исследованию нового типа 2,5спироциклогексан-замещенных НР пирролинового типа. Эти радикалы были синтезированы в лаборатории азотистых соединений к.х.-н. И. А. Кирилюком (НИОХ СО РАН). Измерения, проведенные совместно с Р.К. Стрижаковым (НИОХ СО РАН) показали, что новые спироциклогексан-замещенные НР пирролинового типа обладают более высокой стабильностью к восстановлению, чем их пиперидиновые и тетраметил-замещенные аналоги.

Для НР 1,2,3, MDSSL были измерены температурные зависимости времён электронной релаксации Tm и T1 в водно-глицериновом растворе 1:1. В отличие от тетраметил-замещенного аналога MTSSL, временной спад спинового эха для НР с двумя спироциклогексановыми фрагментами не является моноэкспоненциальным.

Схема 5. Структуры и заместители 2,5-спироциклогексан-замещённых пирролиновых НР.

MDSSL-GSH – глутатион, спин-меченный тиолспецифичным спироциклогексан-замещённым НР.

Введение громоздких спироциклических фрагментов вместо метильных групп приводит к подавлению механизма электронной фазовой релаксации, связанного с движением CH3 групп и определяющего резкий рост скоростей электронной фазовой релаксации при температурах T80 K для тетраметил-замещенных НР. Измеренные Рис. 7 Характерные спады 2,5- спинового эха для MTSSL и 1 в времена релаксации Tm для НР водно-глицериновых растворах спироциклогексан-замещенных (1:1) при 100 K.

пирролинового типа не зависят от температуры в диапазоне 50 - 120 K. Спинрешеточная релаксация для исследованных НР в диапазоне температур 50 -120 K определяется Рамановским процессом и в пределе высоких температур ее скорость пропорциональна T 2. Это позволяет увеличивать частоту повторения импульсной последовательности с увеличением температуры, и как результат компенсировать снижение интенсивности спинового эха, пропорциональной Больцмановскому фактору ~ 1/T. Таким образом, релаксационные свойства новых 2,5-спироциклогексан-замещённых пирролиновых НР позволяют использовать эти радикалы для измерения межспиновых расстояний методом ДЭЭР, в том числе при азотных температурах 80-120 К.

Рис. 8. Температурные зависимости времён релаксации электронов Tm (a) и T1 (b) в водно-глицериновом растворе (1:1) для MTSSL(), 3(), 2(), 1(), MDSSL() и MDSSL-GSH(). Погрешность измерений ~ 5%.

Для исследования возможности использования новых радикалов в качестве спиновых меток в биологических системах И.А.Кирилюком (НИОХ СО РАН) был синтезирован глутатион, спин-меченный MDSSL. Успешность протекания реакции между меткой MDSSL и цистеиновой группой глутатиона доказывалась по изменению формы стационарного ЭПР спектра в X- и Qдиапазонах для MDSSL-GSH по сравнению со спектром свободной спиновой метки MDSSL. Измерение электронной спиновой релаксации MDSSL-GSH показало, что присоединение спиновой метки к глутатиону с образованием радикала MDSSL-GSH не изменяет параметры релаксации T1 и Tm.

Для тестирования возможности применения новых НР для измерения расстояний в биополимерах в лаборатории Г.Г.Карповой (ИХБиФМ СОРАН) был проведен синтез модельных дуплексов РНК, спин-меченных 2,5спироциклогексан-замещенным НР пирролинового типа (дуплекс 1) и их тетраметил-замещенным аналогам (дуплекс 2). Синтез проводился с использованием оригинальных методов, предложенных Карповой Г.Г. с соавторами (ИХБФМ СО РАН).

Схема 6. Структура модельного дуплекса РНК и используемых спиновых меток.

Для дуплексов 1 и 2 методом ДЭЭР8 в Q-диапазоне были получены близкие функции распределения по расстояниям между радикалами: rДЭЭР=3.81 нм, =0.41 нм и rДЭЭР=3.80 нм, =0.35 нм (для дуплекса 1 и 2, соответственно).

Хорошее согласие между расстояниями, полученными с применением двух разных меток, демонстрирует применимость новых спироциклогексанзамещенных меток для структурных исследований методом ДЭЭР.

Рис. 9 Измерение расстояний в дуплексах 1 и 2 в Q-диапазоне методом ДЭЭР. (A) характерный эхо-детектируемый спектр ЭПР и позиции импульсов накачки и наблюдения. (B) Временные зависимости ДЭЭР после вычитания базовой линии (нормированная интенсивность). (C) Полученные распределения по расстояниям (нормированные на единицу).

В экспериментах ДЭЭР регистрируется только одна осцилляция даже при больших значениях времен эволюции. Мы считаем, что быстрое затухание колебаний связано со свойствами исследуемой системы, а именно с наличием достаточно длинного и подвижного линкера в структуре спин-меченных дуплексов РНК, что в итоге приводит к широкому распределению по расстояниям. Спироциклогексан-замещенная спиновая метка обладает улучшенными релаксационными свойствами (наличие затяжного плато вначале), что потенциально должно улучшить точность определения расстояния за счет регистрации большего числа осцилляций. Но, по всей видимости, наличие различных конформаций для используемого линкера не позволило продемонстрировать данное преимущество новой метки.

Цитируемая литература

1. Rajca, A.; Kathirvelu, V.; Roy, S. K., et al. A Spirocyclohexyl Nitroxide Amino Acid Spin Label for Pulsed EPR Spectroscopy Distance Measurements. Chem-Eur J 2010, 16 (19), 5778-5782.

2. Petrova, S. S.; Kruppa, A. I.; Leshina, T. V. Time-resolved photo-CIDNP of dibenzyl ketone-beta-cyclodextrin inclusion complex. Chem Phys Lett 2004, 385 (1Hayashi, H.; Nagakura, S. Semi-empirical calculations of the zero-field-splitting parameters of the lowest triplet states of aromatic ketones. Mol Phys 1972, 24 (4), 801-807.

4. Sharnoff, M. ESR of the Triplet State of Benzophenone. J Chem Phys 1969, 51 (1), 451-452.

5. Ikoma, T.; Akiyama, K.; Tero-Kubota, S. Twist conformational effects on the excited triplet states of aromatic ketones studied by multifrequency TREPR and pulsed EPR spectroscopy. Mol Phys 1999, 96 (5), 813-820.

6. Milov, A. D.; Samoilova, R. I.; Shubin, A. A., et al. ESEEM Measurements of Local Water Concentration in D(2)O-Containing Spin-Labeled Systems. Appl Magn Reson 2008, 35 (1), 73-94.

7. Bagryanskaya, E. G.; Bardelang, D.; Chenesseau, S., et al. EPR, NMR, and Thermodynamic Evidences for Forced Nuclear Spin-Electron Spin Interactions in the Case of 1-Phenyl-2-Methylpropyl-1,1-Dimethyl-2-Nitroxide (TIPNO) Attached to Permethylated beta-Cyclodextrin. Appl Magn Reson 2009, 36 (2-4), 181-194.

8. Milov, A. D.; Maryasov, A. G.; Tsvetkov, Y. D. Pulsed electron double resonance (PELDOR) and its applications in free-radicals research. Appl Magn Reson 1998, 15 (1), 107-143.

Результаты и выводы

1. Изучено влияние циклодекстрина на механизмы фотолиза ароматических кетонов и на формирование эффектов спиновой поляризации. Показано, что увеличение времени жизни РП в ЦД и обменное взаимодействие в РП являются основными факторами, влияющими на формирование спиновой поляризации.

При фотолизе ДОБ в ЦД происходит как диссоциация молекулы ДОБ, так и перенос атома водорода с ЦД на ДОБ. Наблюдение ХПЯ на продукте перегруппировки свидетельствует о высокой подвижности радикалов внутри полости ЦД. Для БФ основным каналом фотолиза является реакция с ЦД.

2. Методом ВР ЭПР исследована природа триплетного состояния ароматических кетонов и показано, что параметры расщепления в нулевом магнитном поле (D и E) триплетных состояний зависят от структуры комплекса с ЦД и полярности локального окружения CO-группы. Обнаружено, что скорость электронной релаксации в триплетных молекулах при T=30 K уменьшается в комплексе -ЦД по сравнению с гомогенным раствором из-за ограничения мобильности триплетной молекулы.

3. Методами ESEEM и стационарного ЭПР показано, что для ряда новых комплексов нитроксильных радикалов, ковалентно-связанных с ЦД (TRIMEB) наблюдается равновесие между комплексами с радикальным фрагментом вне полости и радикальным фрагментом, прикрывающим полость TRIMEB, с преобладанием той или иной формы в зависимости от структуры нитроксильного радикала и линкера. Ковалентное присоединение pHчувствительного имидазолинового радикала к TRIMEB сохраняет pHчувствительность радикала, но не увеличивает его стабильность.

4. Показано, что времена электронной релаксации новых 2,5спироциклогексан-замещенных нитроксильных радикалов пирролинового типа, обладающих стабильностью по отношению к биогенным восстановителям, позволяют применять метод ДЭЭР в диапазоне температур 50-120 K. Показана применимость новых меток для структурных исследований биополимеров методом ДЭЭР на примере измерений расстояний в модельном РНК дуплексе.

Основные результаты изложены в следующих работах:

1. Krumkacheva, O. A.; Fedin, M. V.; Polovyanenko, D. N.; Jicsinszky, L.; Marque, S. R. A.; Bagryanskaya, E. G., Structural Equilibrium in New Nitroxide-Capped Cyclodextrins: CW and Pulse EPR Study // J Phys Chem B 2013, 117 (27), 8223Kirilyuk I. A., Polienko Y. F., Krumkacheva O. A., Strizhakov R. K., Gatilov Y.

V., Grigor’ev I. A., Bagryanskaya E. G., Synthesis of 2,5-Bis(spirocyclohexane)Substituted Nitroxides of Pyrroline and Pyrrolidine Series, Including ThiolSpecific Spin Label: An Analogue of MTSSL with Long Relaxation Time //J Org Chem 2012, 77 (18), 8016-8027

3. Krumkacheva, O.; Tanabe, M.; Yamauchi, S.; Fedin, M.; Marque, S. R. A.;

Bagryanskaya, E., Time-Resolved and Pulse EPR Study of Triplet States of Alkylketones in beta-Cyclodextrin // Appl Magn Reson 2012, 42 (1), 29-40

4. Krumkacheva, O. A.; Gorelik, V. R.; Bagryanskaya, E. G.; Lebedeva, N. V.;

Forbes, M. D. E., Supramolecular Photochemistry in beta-Cyclodextrin Hosts: A TREPR, NMR, and CIDNP Investigation // Langmuir 2010, 26 (11), 8971-8980

5. Krumkacheva, O. A.; Kirilyuk, I. A.; Polienko, Y. F.; Grigor’ev, I. A.; Strizhakov, R. K.; Babailova, E. S.; Ivanov, A. V.; Vorobjeva, M. A.;.Venyaminova A. G;

Malygin, A. A.; Karpova, G. G.; Fedin, M. V. and Bagryanskaya, E. G., New 2,5bis(spirocyclohexane)-substituted nitroxides of pyrroline and pyrrolidine series as spin labels: advanced properties and applications to distance measurements in RNA // Book of abstracts of Magnetic Resonance Conference “EUROMAR2013”, Hersonissos (Greece), 2013, 327 MO

6. Krumkacheva, O. A.; Gorelik, V. R.; Forbes, M., D., E.; Bagryanskaya, E., G., Supramolecular Photochemistry in –Cyclodextrin Hosts: A TREPR, NMR, and CIDNP Investigation // труды XII Международной школы молодых ученых «Современные проблемы магнитного резонанса и его применения», Казань (Россия), 2009, стр. 169 – 173

7. Krumkacheva O. A., Fedin M. V., Polovyanenko D. N., Marque S. R. A., Plyusnin V. F. and Bagryanskaya E. G., Nitroxides attached to cyclodextrin as selective probes for lumenescence quenching // Book of abstracts of 6th conference on Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides, Marseilles (France), 2011, p.

8. Krumkacheva O., Tanabe M., Forbes M. D. E., Yamauchi S. and; Bagryanskaya E., TREPR, NMR, and CIDNP Investigation of Supramolecular Photochemistry in beta-Cyclodextrin Hosts // Book of abstracts of 12th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena, Noordwijk (The Netherlands), 2011, p.64 Подписано в печать 12.09.2013 г. Печать цифровая.

Бумага офсетная. Формат 60х84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 120 экз. Заказ № 173.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия»

ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07



Похожие работы:

«НАЦИОНАЛЬНЫЙ БАНК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ПОСТАНОВЛЕНИЕ Правления Национального банка Республики Беларусь 16 апреля 2009 г. № 46 г. Минск Об утверждении Инструкции о порядке регистрации сделки и выполнении банками и небанковскими кредитнофинансовыми организациями функций агентов валютного контроля (С учетом изменений и...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Горно-Алтайский государственный университет" МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ для обучающихся по освоению дисциплины: Биогеография уровень основной об...»

«ЗАО "ТУРМАЛИН" Санкт-Петербург Термическое уничтожение и обезвреживание отходов. Инсинераторы ИН-50 2014 г.ЗАО "Турмалин": Более 22 лет работы в области термического уничтожения и обезвреживания отходов Более 200 установок для уничтожения (обезвреживания) бытовых, медицинских, химических и промышленных отходов Установки во...»

«СБОРНИК ТРУДОВ VII МЕЖДУНАРОДНОГО КОНГРЕССА "ЧИСТАЯ ВОДА. КАЗАНЬ" 23-25 НОЯБРЯ, 2016 Казань СБОРНИК ТРУДОВ VII МЕЖДУНАРОДНОГО КОНГРЕССА "ЧИСТАЯ ВОДА. КАЗАНЬ" 23-25 ноября 2016 г. Казань ООО "Новое знание" УДК 574 ББК 26.22 С23 Составитель: Д.С.Ро...»

«8 АНАЛИЗ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ НАМЕЧАЕМОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В соответствии с Приказом Госкомэкологии от 16.05.2000 г. №372 /1/ в настоящем разделе выполнен анализ альтернативных вариантов...»

«Ихтиология. Экология _ _ УДК 591.69-7 В.Н. Казаченко Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет, 690087, г. Владивосток, ул. Луговая, 52б ПАРАЗИТИЧЕСКИЕ КОПЕПОДЫ (CRUSTACEA: COPEPODA) НЕКОТОРЫХ РЫБ СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ ТИХОГО ОКЕАНА Приведены сведения о 18 видах 15 родов 7 семейст...»

«Пояснительная записка Содержание предмета экология позволяет ребенку в содружестве с учителем познавать мир живой природы, себя, закономерности развития органического мира. Данная программа позволит детям расширить свои знания о природе и человеке, как ее части, позв...»

«ТЕКУЧЕВА ДАРЬЯ НИКОЛАЕВНА ПУРПУРНЫЕ НЕСЕРНЫЕ БАКТЕРИИ В ДВУХСТАДИЙНОМ ПРОЦЕССЕ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРОДА ИЗ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ 03.02.03 Микробиология 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федерально...»

«ISSN 0869-3226 МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОХРАНА НЕ ^ ^ 1 ^^ ГЕОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО РИСКА О Б З О Р Н А Я ИНФОРМАЦИЯ РГАСНТИ 38.01.94 УДК 504.75 Б а р а б о ш к и н а...»

«Предварительная Экологическая Оценка KAZ: ЦАРЭС Коридор 2 (участки Мангистауской Области) Жетыбай-Жанаозен 0-73 км Окончательная версия 18 мая 2015г Подготовлен Комитетом Автомобильных дорог...»

«Ланшаков Дмитрий Александрович Эффекты гипоксии и глюкокортикоидов на программируемую гибель клеток неонатального мозга 03.03.01 физиология диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., член-корр. РАН Дыгало Н. Н....»

«7. Kimoto H., Ohmomo S., Okamoto T. Cholesterol removal from media by Lactococci //J. Dairy Sci. – 2002.– 85, N 12. – P. 3182–3188.8. Noh D.O., Kim S.H., Gilliland S.E. Incorporation of cholesterol into the cellular membrane of Lactobaci...»

«Звягинцев Александр Юрьевич (Zvyagintsev Alexander Yu.) родился 16 мая 1949 г. в Москве. В 1971 г. окончил Дальневосточный Госуниверситет. С 1971 г. и по настоящее время работает в Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, ведущий научный сотрудник. Доктор биологических наук,...»

«Б3.В.11 Ветеринарная пропедевтика 1.Цели и задачи освоения дисциплины Целями освоения дисциплины "Ветеринарная пропедевтика" являются научиться правильно, распознавать, обследовать больное животное, обобщать полученные результаты, проводить их анализ, оценивать анатомически...»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.