WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 

«Исследование мехнизмов электронного транспорта в биологических нанообъектах Выпускная квалификационная работа магистра Руководители: к.х.н. Мотовилов К. А. к.ф.-м.н. Дрёмов В. В. Долгопрудный ...»

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Московский физико-технический институт

Факультет общей и прикладной физики

Кафедра физики и технологии наноструктур

На правах рукописи

Гребенко Артём Константинович

Исследование мехнизмов электронного

транспорта в биологических нанообъектах

Выпускная квалификационная работа магистра

Руководители:

к.х.н. Мотовилов К. А.

к.ф.-м.н. Дрёмов В. В.

Долгопрудный, 2015 Содержание Содержание

1. Введение................................... 2

2. Обзор литературы.............................. 4

3. Методологическая часть.......................... 8

3.1. Получение образцов.......................... 8 3.1.1. Изоляция пилей......................... 8 3.1.2. Пробоподготовка........................ 9

3.2. Аналитические исследования..................... 10 3.2.1. Морфология (АСМ, ПЭМ)................... 10 3.2.2. Комбинационное (рамановское) светорассеяние и ГКР(SERS)10 3.2.3. Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС/МС)11 3.2.4. Ядерный магнитный резонанс................. 12 3.2.5. Измерение магнитной восприимчивости и ЭПР....... 12



3.3. СЗМ и транспортные исследования................. 12 3.3.1. УНТ-кантилеверы........................ 13 3.3.2. Метод точечных контактов (Point-Contact)......... 14 3.3.3. Разводка контактов....................... 17 3.3.4. DC и AC измерения....................... 19

4. Результаты и обсуждение.......................... 21

4.1. Аналитическая часть.......................... 21 4.1.1. Морфология (АСМ и ПЭМ).................. 21 4.1.2. Комбинационное рассеяние света............... 22 4.1.3. Масс-спектрометрия...................... 23 4.1.4. Ядерный магнитный резонанс................. 24 4.1.5. Измерения магнитной восприимчивости и ЭПР....... 24

4.2. Транспортные измерения....................... 26 4.2.1. Исследования поперечной проводимости с помощью АСМ 26 4.2.2. Измерение продольн

–  –  –

1. Введение Перенос заряда в живых системах явление интригующее исследователей на протяжении многих лет. Способы осуществления транспорта могут быть самыми разными и включать как, собственно, транспорт электронов, так и транспорт ионов или органических электронных шатлов хиноноидной природы. Электрофизические исследования живых систем являются сложной задачей, т.к. адаптация методов физики твердого тела с учетом особенностей биологии живых систем представляет собой некоторое искусство.

Развитие и коммерциализация лабораторного оборудования привели к тому, что зачастую идеалогия исследования сводится к поиску объекта под приборы, а не наоборот. Следовательно, использование стандартных методик приводит исследователей к наблюдению “желаемого”, а не фактического свойства образца. Данная работа посвящена методологическим проблемам биофизических исследований электропроводности методами атомно-силовой микроскопии, а также организации транспортных измерений.

Предполагая, что транспорт осуществляется по специальным филаментам (пилям), которые используют некоторые бактерии для передачи окружающей среде электронов, данная работа в первую очередь направлена на непосредственное изучение переноса заряда в этих структурах. Химический состав и структурная организация таких филаментов может иметь немало отличий при переходе от одного вида бактерий к другому. Общими свойствами таких филаментов является большая пространственная анизотропия (длина 10µm при сечении 10nm), присутствие в составе белковых компонентов большого количества ароматических аминокислот и/или ароматических простетических групп (гемов), а также способность образовывать разветвленные сети, объединяющие бактерии одного или нескольких видов, составляющих колонию.

Актуальность проведенной работы имеет несколько аспектов. Во-первых, проблема электронного транспорта в применении к биологическим системам остаётся по-прежнему до конца не разрешенной. Острая дискуссия на тему возможности рассмотрения электрон-транспортирующих белков некоторых бактерий в качестве аморфных полупроводников, подпитываемая ежемесячными экспериментальными и теоретическими аргументами оппонентов, говорит о том, что данная тематика является одной из наиболее живых и востребованных в биофизике. Формирование внутри белка локусов, в которых какие-либо заряженные квазичастицы, не только электроны, могли бы иметь

Введение

сплошной спектр энергий, по-прежнему, вызывает у специалистов по классическому твердому телу обоснованный скепсис. Белки значительно отличаются как от известных органических допированных полупроводников, так и, тем более, от проводников и полупроводников с атомарной кристаллической решеткой. Молекулярные кристаллы мультигемовых цитохромов являются объектом, очень далеким от нативного состояния. В этом отношении пили представляются тем самым оптимальным компромиссом, который позволяет иметь достаточно стабильный, однородный и сравнительно простой по составу образец (с точки зрения биологии) и вместе с тем еще не запредельно сложный по количеству свободных параметров (с точки зрения физики конденсированного состояни материи). Большая актуальность работы так же обоснована тем, что транспортные исследования в пилях автоматически заставляют продвинуться в понимании структуры пилей. Мы работали с пилями непатогенных бактерий, однако необходимо понимать, что данный тип органелл является универсальным для множества микроорганзмов, в том числе и для опасных патогенов. Формирование инфекционных бактериальнх матов и их сложная внутреняя регуляция опосредованы пилями. Большой интерес к нашей деятельности со стороны микробиологов связан именно с надеждой на то, что более глубокое понимание транспортных процессов в пилях и динамики их структуры позволит найти принципиально новые пути борьбы с инфекциями, особенно в тех случаях, когда патогенная бактериальная колония уже сформировала мощный полисахаридный и пилевой каркас-экзоскелет, непроницаемый для антибиотиков.

Целью данной работы является адаптация методов исследования зарядового транспорта для биосистем и демонстрация их применения на конкретном примере единичного нанообъекта.

Обзор литературы

2. Обзор литературы Проблема исследования механизмов электронного транспорта в биологических системах впервые сформулирована в работах Сент-Дьёрди 1941[1] года. До этого момента зарядовый перенос рассматривался в живых системах с точки зрения ионных токов, на которых построена работа возбудимых тканей нервов, миокарда. В послевоенный период выполнено цикл важных работ, определивших развитие представлений об электронном транспорте в белках. В 1956 году Р. Маркус[2] предложил свою теорию внешнесферного электронного переноса для простых ионов, координационная сфера которых не претерпевала существенных изменений в результате окислительновосстановительной реакции. Довольно быстро было подмечено, что маркусовскими ионами являются комплексообразователи многих простетических групп белков, участвующих в электронном транспорте в дыхательной цепи митохондрий, хлоропластов и бактерий, такие как гемовые железо и медь, железосерные кластеры и т.д. Опыты Чанса,[3] Нишимуры, де Волта,[4, 5] Вреденберга и Дуйсенса,[6] выполненные в конце 50-х – середине 60-х годов, по оценке скорости переноса электрона между цитохромом с и фотоцентром в пурпурных бактериях показали, что начиная со 100 К и ниже скорость реакции перестаёт зависеть от температуры. Возможным объяснением этого процесса является подбарьерный электронный перенос. В последующие десятилетия стало понятно, что туннельный перенос заряда является весьма распространенным явлением для множества биологических систем, содержащих гемы и железосерные кластеры. Теория локализованных состояний для аморфных полупроводников позволяет рассматривать белок как систему, в которой есть набор локусов, например, ароматических сопряженных систем гемов, в рамках которых часть валентных электронов обобществлены по всему объему сопряженной системы, т.





е. являются квазисвободными. Создание и изучение допированных ароматических полупроводников, типа полианилина и полиацетилена, а в последствие и органических сверхпроводников, привело к пониманию того, что большие классы органических соединений, в том числе и синтезирующихся в биологических системах метаболитам, теоретически, могут в определенных условиях организовываться в проводящие фазы. Направленным поиском подобных структур, по-видимому, не занимались вплоть до открытия феномена дальнего (по меркам микробиологии) зарядового транспорта в некоторых бактериальных колониях. Изначально установлена положительная корреляция количества филаментов у клеток,

Обзор литературы

растущих на аноде, с величиной генерируемого ими тока.

Волна исследований посвященных проводимости белковых нанофиламентов, получивших в дальнейшем название “пили(pili )” или “нанопровода (nanowires)” имела свое начало в 2000 годах, после открытия факультативных или облигатных анаэробных видов, способных востанавливать различных органические и неорганических соединения для обеспечения дыхательного цикла в организме.[7] Особое внимание получили виды Shewanella Oneidensis MRи Geobacter Sulfurreduscens.[9] Способность осуществлять дыхательный цикл на нерастворимом субстрате - биологический “подвиг”, которые ученые начали интенсивно исследовать. Установлено, что первый шаг к успешному восстановлению внеклеточных металлов заключается в формировании пленок бактериями на поверхности окислов. Учеными предложены три основных пути зарядового транспорта: цитохромы на внешней мембране самой клетки, мобильные электронные шатлы (рибофлавин) и проводящие выросты на поверхности мембраны клетки пили, белковые нанопровода и нанофиламенты.

a b

Рис. 1. Респираторные механизмы бактерий Shewanella Oneidensis MR-1. a) Синтез пилей типа IV. Пиля в диаметре около 6 нм, а ее сборка и расборка требует гидролиза нуклеозидтрифосфата во внутренней мембране клетки (изображения взяты из Slonczewski, 2011). б)Мультигемовые цитохромы переносят электрон через межмембранное пространство с хинонов, находящихся во внутренней мембране (M QH2 ), на мультигемовые комплексы в периплазматической мембране (CymA).

Далее электрон движется сквозь внешнюю мембрану (белки MtrA, MtrB) во внеклеточное пространство (MtrC and OmcA), где они могут напрямую контактировать с нерастворимыми окислами металлов непосредственно (правый путь) или с мобильными шатлами (флавины, другие хиноны) к окислителям на больших расстояниях (левый путь). (Изображения взяты из Fredrickson et al.) Впервые Горби и др.[8] с помощью электронной микроскопии установили Обзор литературы наличие этих нанопроводов на культуре Shewanella, выращенной в анаэробных условиях с малыми концентрациями электронных акцепторов, таких как F e3+ или фумараты. В свою очередь бактерии, выращенные в присутствии кислорода(O2 2%), не производили сплошных пленок или длинных нанопроводов. Нанопровода, созданные в анаэробных условиях, были 6-10 nm в диаметре и десятки µm длиной, соединяя бактерии друг с другом(в том числе и с бактериями других видов[10] ) или подложкой. Также нити могли сплетаться в пучки диаметром 50-150 нм.

Ряд работ посвящены исследованию структуры и характеристикам этих нанопроводов.[11, 12] Однако доподлинно организация пили на молекулярном масштабе остается неизвестной.

Через некоторое время, группа Горби продемонстрировала, что эти внеклеточные выросты проводят ток, инкубируя бактерии в водной суспензии слабо-кристаллического Si-HFO. Когда они анализировали культуры с помощью просвечивающего электронного микроскопа, они обнаружили, что Si-HFO был модифицирован в востановленную форму нанокристаллического магнетита вдоль нанопроводов. Позже, когда они визулизировали образец на поверхности среды, они обнаружили, что эти нанопровода могут вытягиваться на большие расстояния от клетки, чтобы восстанавливать растворимый оксид железа, превращая его в кристаллические структуры. В последующих работах[13] авторы смогли напрямую измерить проводимость нанопроводов, формируяы с помощью фокусированного пучка ионов наноконтакты к ним.

Однако использованные в этих исследованиях методов точечной спектроскопии в атомно-силовом микроскопе (АСМ), как и режимы работы фокусированного пучка ионов, вызывают сомнения. Ко всему прочему, во время пробоподготовки образцы нанопроводов фиксированы при помощи глутарового альдегида, что ставит под сомнение сохранение нативной структуры нанопровода.

На основании этих данных и исследований, проведенных на других видах бактерий,[12, 14, 15] разработано множество объяснений механизма проводимости в пилях.[16] Стоит упомянуть, что не существует работ по измерению зависимости удельного сопротивления единичной пили ни у одного вида бактерий в зависимости от температуры, напряженности магнитного и/или электрического поля. Опубликована единственная работа, в которой методом измерения по схеме полевого транзистора попытались качественно установить знак заряда.[17] Все предположения о модели переноса строились по вольтамперным характеристикам, снятым с помощью сканирующего тунельного Обзор литературы микроскопа или по двухточечной схеме контактов.

–  –  –

3. Методологическая часть

3.1. Получение образцов Колонии бактерий для исследований выращивались при условиях созднаия конфлюентного слоя клеток на поверхности металлических электродах в самодельных топливных элементах (см рис. 2). Критерием получения электроактивных культур является наличие тока и напряжения на контаках топливной ячейки.

Рис. 2. Самодельная топливная ячейка для выращивания культуры Shewanella Oneidensis MR-1. Конструкция Сидорука К.В. ФГУП НИИ-Генетики 3.1.1. Изоляция пилей Для отделения белковых нанопроводов от клетки использовалась следующая процедура:[17, 18]

• Колония бактерий смывалась с электрода питательным раствором, в котором происходил их рост

• Клетки переосаждались и бактериальная среда заменялась либо буфером T RIS HCl(pH = 7, 10mM ), либо дистиллированной водой

–  –  –

• Концентрированная суспензия бактерий “взбалтывалась” на вортексмашине (20 min), после чего переосаждались на центрифуге (13200 RPM, 20 min, 4 C)

• Надосадочная жидкость, содержащая пили, сливалась в отдельный контейнер; осадок повторно подвергался процедуре встряски и переосаждения (до трех раз)

• Суспензия пилей разделялась на компоненты методом градиентного центрифугирования с использованием 5 растворов сахарозы разной концентрации (40 %, 20 %, 10 %, 5 %, 2,5 %) • 20 %-ная фракция проходила дальнейшую отчистку путем центрифугирования на 100000-200000 g 1,5 часа.

При отделении нанопроводов от тела бактерий важно минимизировать физико-химическое воздействие, имеющее деструктивный характер, как по отношению к целостности пили, так и по отношению к химическому внутреннему составу пили. Поэтому, в отличие от работ,[17, 18] мы опустили фазу фиксации и прогонки взвеси пилей через уские капиляры.

3.1.2. Пробоподготовка

• Для исследований с помощью сканирующих зондовых микроскопов предявляются следующие требования к образцу:

– Минимальное содержание инородных тел в исходной суспензии.

Это условие достигалось градиентным центрифугированием и многократным последующим переосаждением в дистиллированной воде.

– Оптимальное количество филаментов на поверхности подложки должно быть не менее 1 шт. на 1 µm2.

Для такого нанесения использован пневмо-спрей. Суспензия пилей наносилась на субстрат под давлением около 1-3 атмосфер.

При этом наблюдалась механическая деструкция нанопроводов на обломки в среднем по одному микрону длиной.

• Дополнительным требованием к образцу для транспортных исследований являлось сохранение максимально большой длины нанопроводов.

Для улучшения адгезионных свойств пили к кремниевой подложки, последняя предварительно обрабатывалась цетилтриметиламмоний бро

<

Методологическая часть

мидом в концентрации 0.01 mM, что позволило наносить пили без пневмоспрея, предотвращая механические разрывы нанопровода.

• В случае массивных образцов, например, для изучения магнитной восприимчивости или ЯМР-спектроскопии, процедура выделения пилей масштабировалась и получившийся объем нанопроводов высушивался с помощью лиофилизации в спиртах. Стоит заметить, что в случае наработки больших количеств пилей, полученные партии обладали низкой чистотой.

3.2. Аналитические исследования Процедура выделения пилей сопровождается риском их частичтного разрушения, приводящего к изменению внутреннего химического состава. Поэтому необходима аттестация полученных пилей различными физико-химическими методами и сопоставление этих данных с данными по бактериальным культурам. Подробное описание принципов работы использованных приборов выходит за рамки данной дипломной работы.

3.2.1. Морфология (АСМ, ПЭМ)

Атомно-силовая и просвечивающая электронная микроскопия позволяют установить морфологию нанопроводов. Просвечивающая электронная микроскопия проводилась на приборе Zeiss LEO 912В (ускоряющее напряжение 100кЭв); водная суспензия пилей наносилась на медную сетку, покрытую поликарбонатной мембраной. Затем проводилась негативная фиксация раствором соли фосфорновольфрамовой кислоты. Контрастирующий агент удалялся с поверности сетки по истечении 30 секунд. Атомно-силовая микроскопия проводилась на приборе NTM-DT Smena с использованием стандартных кремниевых кантилеверов (резонансная частота 176 и 330 кГц), модифицированных на острие углеродными нанотрубками. Выбирался бесконтактный АМ-модуляционный режим измерений.

3.2.2. Комбинационное (рамановское) светорассеяние и ГКР(SERS) Раман-спектры зарегистрированы на приборе раман-микроскопе РамМикс М532 R (OOO ИнСпектр, Черноголовка). Длина возбуждения 532 нм, диаметр пучка 2 мкм, мощность 2 мВт. Для осуществления гигантского кобми

–  –  –

национного рассеяения(ГКР/SERS) использовались кремниевые подложки, покрытые наночастицами серебра диаметром 4-5 нм.

3.2.3. Хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-МС/МС) Эксперименты ВЭЖХ-МС/МС проводились на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, США) и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Бремен, Германия) масс-спектрометр ионного циклотронного резонанса (ИЦР), совмещенный с линейной квадрупольной ионной ловушкой, использующейся для накопления ионов и измерения спектров столкновительно индуцированной фрагментации (МС/МС) ионов. Для хроматографического разделения 1 µl образца закалывался на колонку (75 µm x 12 cm, Reprosil-Pur Basic C18, 3µm;

Dr. Maisch HPLC GmbH, Аммербух-Энтринген, Германия), изготовленную в лаборатории способом описанным Манном и др. [Ishihama Y, Rappsilber J, Andersen JS, Mann M. (2002) Journal of Chromatography 979, 233–239]. В качестве подвижной фазы использовались - растворитель А: H2 O–HCOOH (1000 : 1, об.), растворитель В: CH3 CN –HCOOH (1000 : 1, об). Проводилась градиентная хроматография с линейным увеличением относительного содержания растворителя B в потоке от 3% до 50% за 90 минут. Массспектрометрический анализ фракций пептидов осуществлялся программой Xcalibur (Thermo Electron, Бремен, Германия) в 2-х стадийном режиме автоматического измерения спектров. На первой стадии в масс-спектрометре ИЦР ПФ измерялись точные массы пептидов в диапазоне m/z 300-1600 с разрешением R=50000 для m/z 400 (число ионов в ячейке ИЦР 5x106). На второй стадии из ИЦР масс-спектра выбирались три максимальных пика, для которых производилась столкновительно-индуцированная фрагментация (CID).

Фрагментация CID и измерение спектров CID фрагментов происходили в линейной квадрупольной ионной ловушке (число ионов 3x104). В режиме автоматического 2-х стадийного анализа пептиды, для которых фрагментация уже была проведена, динамическое исключались из рассмотрения на 30 секунд. Список из точных масс пептидов и масс их фрагментов использовался для поиска и идентификации белков по базе данных при помощи программы Mascot (Matrix Science, Лондон, Великобритания; version 2.0.04).

–  –  –

3.2.4. Ядерный магнитный резонанс Спектры ЯМР на ядрах 1 H (400МГц) и 13 С (100,6МГц), регистрировали на спектрометре AVANCE III 400MHz (“Bruker”). Для получения спектров высокого разрешения в твердом теле применяли методику вращения под магическим углом. Частота вращения составляла 15-20 кГц. Образец в виде порошка помещали в стандартный керамический ротор с внешним диаметром 3,2 мм. Калибровку шкалы химических сдвигов в спектрах ЯМР проводили по адамантану (1.87 м.д. на ядре 1 H при частоте вращения 5кГц).

ЯМР-спектроскопия по углероду позволила проанализировать разнообразие органических молекул, входящих в состав образца и, соотвественно, получить “паспорт” химического окружения углерода в образце.

3.2.5. Измерение магнитной восприимчивости и ЭПР

Измерения зависимости магнитной восприимчивости от температуры может показать в системе фазовые переходы, связанные с изменением спинового состояния электронов, которые возможно относятся к белковопроводящей части образца. Например переход железа в геме из состояния F e3+ в F e2+.

Тогда бы мы могли по температуре перехода опеделить длину волны света, которая была бы отвественна за этот переход и увидеть влияние такого облучения на транспортные свойства образца. Измерение магнитной восприимчивости проведено на СКВИД-магнитометре (SQUID MPMX 5XL Quantum Design (Германия, 2004 г.)). Дополнительно к этому проведена регистрация спектра электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Измереный спектр от температуры может так же показать от какого элемента мы видим вклад в магнитную восприимчивость и, вновь-таки, при наличии перехода линия, соответствующая элементу в одном спиновом состоянии затухала бы, а в другом, соотвественно, возрастала. Регистрация спектров ЭПР проводилась на спектрометре ELEXSYS-IIE (Bruker).

3.3. СЗМ и транспортные исследования Атомно-силовая[19] и тунельная микроскопия[20] - мощные инструменты для анализа поверхности образца. Особено широкое распространение получили бесконтактные методики АСМ (AM/FM-модуляционные методики, tapping mode и т.д.) ввиду недеструктивного характера по отношению к “мягким” биологическим объектам. Данная методика не дает никаких других сведений об объекте исследования, за исключением его топографии. Проблема Методологическая часть не только в методе измерений, но и в зонде, которым проводятся измерения, и даже в пробоподготовке (см раздел 3.1.2).

3.3.1. УНТ-кантилеверы Стандартные кремниевые кантилеверы, предназначенные для рутинных исследований, обладают рядом недостатков в случае работы с орагническими объектами:

• Низкая износоустойчивость.

• Высокая вероятность загрязнения острия.

–  –  –

Рис. 3. УНТ-зонд для АСМ. а) Пористый алюминий, используемый для модификации b) Нанотрубка, выступающая из пучка на конце иглы кантилевера Помимо этого, для изучения проводящих свойств образца, необходимым требованием является постоянная во времени проводимость металлизированного зонда. Однако, металлическая пленка механически изнашивается за короткое время даже при малых воздействиях. Поэтому мы разработали процедуру создания проводящего, износоустойчивого зонда для сканирующей тунельной спектроскопии с одной многостенной углеродной нанотрубкой на конце.[21] Пучок нанотрубок надежно крепится на кремниевой пирамиде кантилевера с помощью диэлектрофореза из водной суспензии многостенных углеродных нанотрубок (см рис. 3 a). Прикладывая импульсы напряжения между иглой и пористым алюминием можно укорачивать и модифицировать пучок нанотрубок (см рис. 3 b). Разработанные такие иглы покрытые Методологическая часть металлом подходят для сканирующей емкостной микроскопии, метода зонда Кельвина и даже для сканирующей тунельной спектроскопии.

3.3.2. Метод точечных контактов (Point-Contact) Стандартная модуляционная методика позволяет исследовать топографию образца (см рис. 4 a). Двухпроходные методики, в особенности сканирующая емкостная микроскопия и метод зонда Кельвина дают качественную информацию касательно электростатических свойств образца, в виде карт градиента емкости (cм рис.4 b) или карт работ выхода (см рис.4 c).

Однако при н.у. и наличи приповерхностного жидкостно-газового слоя эти

–  –  –

методики не позволяют получить количественные данные по электропроводности объекта. Сканирующая тунельная микроскопия требует проводимости и хорошей адгезии образца к проводящей подложке. Биологические нанообъекты, нанесенные на высокоориентированный пиролитический графит, не обладают этими свойствами, поэтому в большинстве случаев зонд механически смещает/разрушает мягкий образец. Использование контактного режима съемки в атомно-силовом микроскопе и дальнейшая точечная спектроскопия сложны в постановке в случае нанообъекта, ввиду отсутствия однозначного позиционирования зонда на ранее полученном кадре.

Обойти данные трудности позволяет применение “Метода точечных контактов”.[22] При работе мы использовали самодельный прибор АСМ со схемой регистрации смещения отраженного луча света (beam deection). В качестве зондов использовались унт-иглы на конце прямоугольной кремниевой консоли. На рис. 5a показана типичная зависимость силы, действующей на иглу, от расстояния до поверхности образца.

Методологическая часть Рис. 5. Зависимость силы, действующей на иглу, от расстояния до поверхности (а); зависимость сигнала оптической следящей системы (b) Рис. 6. Типичная зависимость x(t) при наличии на поверхности пленки воды.

–  –  –

силы F. Если держатель консоли расположить в точке z1, то под действием сил притяжения консоль изогнется, игла будет находиться в точке z2 пересечение кривой F (z) и прямой из точки z1, с наклоном tg() =, где выполняется условие равенства сил F (z1) = x(z1), где x(z1) = (z2–z1).

Построим качественную зависимость функции x(z) от положения держателя (рис. 5 b) при уменьшении z. В точке А такой, что F = при соблюдении z равенства сил нарушаются условия устойчивого равновесия, так как слева от нее F, поэтому игла вынужденно перейдет в точку А1. На зависимости z x(z) мы получим разрыв функции – скачок. При дальнейшем уменьшении z функция x(z) - почти прямая с единичным наклоном в силу резкой в этой области зависимости F (z), асимптотически приближающейся к оси ординат.

В точке С происходит смена знака. x(z), эту точку можно назвать точкой касания поверхности. При обратном ходе по z, то есть при увеличении z, проявляется неустойчивость в точке В такой, что F =, и мы вновь получим z скачок функции x(z). Такой гистерезис в зависимости отклонения кантилевера от расстояния до поверхности проявляется всегда, когда жесткость кантилевера к меньше максимума производной ( F )max. Сама функция F(z), z а с ней и F, зависит от целого ряда параметров, из которых наиболее сущеz ственным для нас является радиус иглы. Тем не менее, можно утверждать, что если порядка 1 Н/м, для достаточно острых игл вы всегда получите гистерезис при измерении зависимости отклонения кантиливера от расстояния до поверхности Условимся называть максимальную силу притяжения Fmax силой адгезии. Понятно, что в случае, когда поверхность покрыта жидкой подвижной пленкой, поведение x(z) существенно изменится. На рис. 6 приведена типичная зависимость x(t) при наличии на поверхности пленки воды. В этом случае Fmax есть сумма сил адгезии и капиллярных сил, и в таком случае ее лучше назвать силой прилипания (gluing force) Fgl. Точка А на рис. 5 a точка скачка к поверхности, которая характеризуется условием F =. Расстояние от точки А до точки С условимся называть расстояниz ем равного градиента Stap. Обозначение “tap” позаимствовано из названия “tapping mode”, название одного из самых распространённых методов работы АСМ, так как по сути, именно поверхность постоянного F и получают в z этом методе. Как мы уже условились, точка С – точка касания поверхности.

Множество этих точек описывают рельеф поверхности Stch с точки зрения касания (touch). Таким образом, измерив параметры функции x(z), скажем, в квадратной сетке точек NxN на исследуемой поверхности, мы можем построить собственно рельеф Stch, карту высот постоянного градиента Stap, Методологическая часть а так же карту сил прилипания Fgl. Если при этом в NxN точках произвести любое другое X измерение, например проводимость в точках С (рис. 5) функции x(z) или жесткости поверхности, как тангенс наклона функции x(z) в области сил отталкивания (z 0), то мы получим дополнительную карту Sx поверхности по параметру X. Достоинство такого подхода к измерениям свойств поверхности в том, что нет необходимости “тащить” иглу по поверхности, рискуя поломать ее о резкий выступ или “испачкать” в мягкой липкой “грязи” на поверхности. Для контроля движения иглы к поверхности не нужно запоминать всю зависимость x(z), достаточно отметить точку Stap по резкому изменению оптического сигнала, а затем аккуратно произвести подвод иглы к поверхности. Этот метод существенно облегчает борьбу с дрейфом оптического тракта, так как каждый раз, когда игла находится вне действия сил со стороны поверхности, можно переопределить “ноль” оптической схемы. Основной параметр, по которому этот метод уступает всем ранее известным, это время получения информации. В зависимости от сложности образца это время меняется от 5 до 20 минут при кадре 128x128. Быстродействие во многом определяется качеством изготовления всего микроскопа, его резонансной частотой, быстродействием электроники и, главное, радиусом иглы. Если игла тупая (r 10nm), сила прилипания велика, то есть приходится далеко отводить держатель кантилевера от образца, а затем долго ждать пока затухнут колебания после отрыва иглы от поверхности. С другой стороны, все эти требования относятся и к любому другому методу. Но в отличие от всех остальных, метод точечных контактов не позволяет работать с тупыми (r 10nm) иглами.

3.3.3. Разводка контактов

Белковые структуры чувствительны к физическо-химическим воздействиям.

В связи с этим классические методы фото- и электронной литографии не применимы в данном случае, ввиду широкого использования в технологической линии органических растворителей. Например, коммерчески доступный и широко используемый электронный резист полиметилметакрилат (ПММА) растворен в толуоле. После нанесения и засвечивания нужных областей пучком электронов, проявление происходит с помощью смеси метилизобутилкетона и изопропилового спирта (1:3, об.). А снятие пленки после напыления металла производится ацетоном.

Другой подход заключается в направленом переосаждении металлов из Методологическая часть металлорганических перкурсоров. Наиболее распространенной методикой является использование P t(acac)2 и W (CO)6 и фокусированного галлиевого ионного пучка. В условиях эксперимента данный метод позволяет формировать контакты длиной не более 10-15 µm. Однако необходимо изначально подготовить сетку практичных макроскопических фотолитографических контактов на основе, например, золота. Тем не менее и здесь есть подводные камни, связанные с реакционной способностью ионов галлия (они попросту разрезают объект исследования), областью подпыления (вследствие взаимодействия вторичных электроннов, выбитых из подложки, и дальнешего их взаимодействия с прекурсором) и т.д. Не смотря на это, возможно подобрать оптимальные параметры нанесения.

При анализе сформированых контактов в зависимости от параметров напыления выяснилось следующее:

• Низкая проводимость платины (см. таблицу 1), осажденной электронным пучком, практически не зависит от ускоряющего напряжения электронов. Поэтому определяющими значениями ускоряющего напряжения (5kV ) и тока (53pA) являлется условие отчетливой регистрации образца.

• Cвойства контактов, осажденных ионным пучком, весьма чувствительны к параметрам ионного пучка. Оптимальным значением ускоряющего напряжения являлось 30kV, а тока - минимальное ( 5 pA). Наиболее важная информация о проводящих свойствах контактов представлена в таблице № 1.

Таблица 1. Электропроводящие свойства контактов.

–  –  –

• В качестве защитного слоя на расстоянии не менее 2 µm вдоль пили наносились пленки из платины с размерами 200x200x100 nm (x:y:z) с помощью электронного пучка

• Затем производилось сведение электронного и ионного пучка в области, несодержащей объект, и вдали от фотолитографических контаков, чтобы избежать замыкание из-за модификации поверхности. Т.к. ионы галлия имеют высокую реакционную способность, и могут нарезать/загрязнять пилю, получать изображение нанопровода в ионном пучке крайне нежелательно.

• По снимку электронного микроскопа формируются контакты из платины осажденной ионным пучком.

Таблица 2. Реакционные свойства контактов

–  –  –

Формирование подводящих контактов данным способом позволило максимально избежать разрушающего действия прибора.

Принимая во внимание, что наш объект является химически активным использование P tCx Gay и W Cx Gay контактов позволит оценить влияние вклада границы электрод-объект в измерительной ячейке. Забегая вперед стоит отметить, что данные электроды могут реагировать на внешние физикохимические воздействия (см. таблицу №2).

3.3.4. DC и AC измерения

Электрофизические измерения проводились в замкнутом объеме с заданной влажностью (поддерживалась набором гигростатов) при температурах 18-25 C. Схема преобразования и усиления регистрируемого сигнала представленна на рис. 7. Диапазон конвертера ток-напряжение от 108 до 109 в зависимости от сопротивления образца.

Методологическая часть

Рис. 7. Схема измерений по дфухконтактной методике на постоянном токе

Измерения импеданса по двухконтактной схеме проводили в диапазоне частот 2 МГц - 1 Гц с амплитудой напряжения 70-120 мВ. Частотные зависимости сопротивления образцов получены на импедансметре Z-2000 (схему см. на рис. 8 (ООО Элинс, Черноголовка). Графоаналитическая обработка частотного спектра импеданса проводили с помощью программы ZView-2 (Scribner Association, США) набором эквивалентных схем.[23] Все нижепоследующие годографы импеданса представлены в координатах Найквиста.

Метод импедансной спектроскопии является мощным средством изучения электропроводности. Одним из главных преимуществ является возможность разделить вклады поляризационных эффектов (диэлектрические характеристики) и эффектов сквозной (ионной) проводимости. При импедансных измерениях к образцу, прикладывается переменное напряжение с фиксированной частотой f = 2. Амплитуда переменного напряжения, прикладываемого к образцу, должна быть очень малой величиной для предотвращения проявления необратимых электродных изменений, нелинейных процессов, а также значительного нагрева образца.

–  –  –

Рис. 8. Схема устройства импедансметра Z-2000, использованного в работе

4. Результаты и обсуждение

4.1. Аналитическая часть 4.1.1. Морфология (АСМ и ПЭМ) Для исследования морфологии образца пилей Shewanella Oneidensis MR-1 с помощью атомно-силового микроскопа (см рис. 9) использовалась модуляционная методика (“tapping mode”). Дополнительно пили изучены методом ПЭМ (см рис. 10 a). Анализ этих данных показал совпадение геометрических параметров пили, что позволило использовать АСМ в единственном виде для экспресс-аттестации образцов.

Заманчивым представлялось зарегистрировать дифракционную картину с набора пилей в условиях просвечивающей электронной микроскопии (см рис. 10 b), однако, возможностей используемого прибора не хватило для регистрации структурных особенностей. Слабая дифракционная картина соответствует полимерной подложке.[24] Таким образом пили представляют из себя нитевидные структуры. Характерные размеры нанопровода: диаметр в сечении 10 nm, длины от 0.2 до 10 µm

–  –  –

4.1.2. Комбинационное рассеяние света Рамановская спектроскопия (см рис. 11 a) позволяет проанализировать состав образца и тем самым получить своего рода “отпечаток” объекта. Воспроизведимость спектров с различных образцов и частичное совпадение с данными по бактериальным колониям позволила заключить, что методика отделения пилей во многом оставляет нетронутой белковую часть нанопровода. Использование ГКР(SERS) позволило повысить отношение “сигнал-шум” и более достоверно соотнести ряд линий (см рис. 11 b). Анализ спектров показал, что основным компонентом пили оказался гем цитохрома С. Однако ввиду уширенных полос поглощения и незначительных сдвигов от литера

–  –  –

Рис. 11. Спектр комбинационного рассеяния для образца реплики пилей в сплаве золото-палладия. Металл в этом случае выступал в качестве системы охлаждения.

Сверху КР, снизу ГКР. Черным обозначены линии гема,[25] желтым - линии кремния.

турных данных растворов цитохромов С состояние железа однозначно установить данным методом не удалось.

Как результат мы имеем: Пили имеют в своем составе цитохромы С (точнее гемосодержащие белковые структуры).

4.1.3. Масс-спектрометрия Масс-спектрометрический анализ белкового состава пилей представляет собой серьезную проблему в силу крайне низкой чувствительности белков пилей к стандартным методам протеолиза. Литературные данные по протеому пилей очень скудны и ограничиваются несколькими статьями, посвященными пробоподготовке и анализу белкового состава пилей гонококков и нескольких других патогенов. Для S.oneidensis масс-спектрометрия филаментов в литературе не представлена (хотя тотальный протеом исследовался).

001 MMKNTLKVVL LTSMLPLAAS ASQELTPWYV GAGLGVNNYE HIATDNGDDN

051 PYAWDIFAGY MFNDYFGAEI GYRDLGSADW TTGGISNDAG VKGATLGLVG

101 VWPLGNRWSL SAEAGAMYYT LENSQHTGTT SSSYSSNDFA PYVGAGVGYN

151 FTDNLKLQAK YRRYENLDDT DFNTIEADSN YWGLELSYRF GTPAAAAPVA

201 AAVVAAAPVD SDNDGVYDDK DECPATPATH KVDSVGCTLY ENVKKQEDVG

251 SIQFANDSAV VKKEYYKDIE RLANYMNKNP EFTVEIAGHA SNVGKPEYNM

301 VLSDKRADAV AKILVEKYGI SQSRVTSNGY GITKPLVAGN SKEAHAANRR

351 IEAIVTTTEK QPVLK Нам удалось достоверно подтвердить, что в исследовавшихся образцах представлен порин. Это является дополнительным аргументом в пользу модели, рассматривающей пили S.oneidensis в качестве выростов периплазматической мембраны. Кроме того, известно, что порин периплазматической мембраны у данных бактерий осуществляет свою функцию в составе комплекса с мультигемовыми цитохромами.[26]

Результаты и обсуждение

4.1.4. Ядерный магнитный резонанс В данной работе регистрация спектра ЯМР-13 C преследовала скорее получить “паспорт” массивного образца пилей(порядка 30-50 мг) от партии к партии, нежели расшифровку спектров. Однако, беглый анализ также подтвердил наличие цитохрома С и флавиноподобных структур в таблетке.[27] Рис. 12. ЯМР-спектр по углероду. Красным показан область соответствующая цитохрому С, синим - флавину 4.1.5. Измерения магнитной восприимчивости и ЭПР Температурная зависимость магнитной восприимчивость данного образца (см.

рис. 13) имеет парамагнитный характер и полностью соответствует закону КюриВейса (диамагнитная составляющая учтена). Вклад вносят многие структурные элементы нанопровода, в том числе различиные белки, содержащие в себе парамагнитные центры (Fe, Mn, Семихинон и т.д.). Ступенчатый характер перехода в интервале от 70 до 100 К (см. рис. 13 b) возможно связан с некоторыми конформационными изменениями в белковой структуре объекта (см рис. 13 a). Структурные изменения начинают происходить раньше (50 К). Тремоиднуцированные конформационные изменения проявляются на зависимости “свойство-температура” образца (например, теплоемкость) раньше, нежели изменения полного спинового состояния этой же системы. Для ответа на вопрос, какая часть образца ответственна за этот переход, мы зарегистрировали температурную зависимость ЭПР Результаты и обсуждение

–  –  –

Рис. 13. Температурные зависимости а) теплоемкости(калориметрически измерения выполнены Вадимом Гриненко в Дрездене) и b) магнитной восприимчивости образца пилей спектра от температуры (типичный спектр на рис. 14). Из анализа кривой видно три явных вклада в спектр по интенсивности с g-факторами равными 2.003 и 4.3.

Первый соотвествует семихинону, а шесть сопутствующих пиков связаны с марганцем. Именно эти парамагнитные центры[28] отвественны за наличие ступеньки на кривой зависимости магнитной восприимчивости от температуры. Второй пик связан с железом гема цитохрома С. Он соотвествует высокоспиновому сотоянии железа F e3+ в октаэдрическом окружении.

Как результат мы имеем: в пилях Shewanella Oneidensis MR-1 состояние железа в геме находится в степени окисления 3+ и в данной системе нет спинкроссоверного эффекта, по крайней мере под воздействием температуры

–  –  –

4.2. Транспортные измерения Учитывая, что пиля может обладать как поперечной, так и продольной составляющей проводимости были поставлены два принципиально разных эксперимента по регистрации этой проводимости.

4.2.1. Исследования поперечной проводимости с помощью АСМ При использовании методики “point-spectroscopy[13] ” к пиле на поверхности высокоориентированного пиролитического графита удавалось получить любые зависимости тока от напряжения. Поэтому для анализа поперечной проводимости использовалась методика точечных контактов, описанная в секции 3.3.2. Под измерением X в данном случае подразумевалось развертка напряжения в диапазоне [-0.5 В,0.3 В] и регистрация тока (см рис. 15) при н.у.

Таким образом, нам не удалось зарегистрировать сколь-нибудь значимой поперечной проводимости. В связи с этим была выдвинута гипотеза, что поверхность пилей является изолятором.

4.2.2. Измерение продольной проводимости - DC Первоначальные измерения пилей Shewanella Oneidensis MR-1 проводили при темпертаруе 21 C, относительной влажности 18 % на воздухе. При этом было установлено отсутствие распространение потенциала (см рис. 4) по пиле с помощью методов электростатической сканирующей микроскопии. Измерения на постоянном токе по двух и четырех-контактной схеме показали наличие сопротивление образца превышающее 10 ГОм.

Результаты и обсуждение

–  –  –

Рис. 16. Пример типичной разводки контактов (длина до 10 µm, ширина 100 нм, высота 100 нм) для измерения продольной проводимости. Обозначения смотри в подписи таблицы № 1 Известно, что наличие водородных связей в белках способствует организации больших органо-белковых ансамблей, по которым собственно может осуществляться перенос заряда. Естественная среда обитания изучаемых бактерий пресноводные озера. Однако в условиях эксперимента содержание воды в пилях существенно ниже. Поэтому мы предположили, что желательно производить транспортные измерения пилей во влажной атсмофере. Контролировать содержимое воды в пи

<

Результаты и обсуждение

лях можно путем изменения давление насыщеных паров над измерительной площадкой. Вода извне пилей способна переходить во внутрь. Таким образом, может происходить внутренняя реорганизация гемовых или подобных структур для осуществления переноса. На рис. 17 представлена зависимость I-V характеристик двух образцов пилей с платиновыми контактами (см рис. 16) от влажности. Качественно

Рис. 17. Зависимость I-V характеристик образца от влажности окружающей сре-ды

видно, что сопротивление образцов падает от степени обводнения нанопровода.

Однако, интерпретация этих результатов не имеет смысла, т.к. система “образецконтакты-вода” имеет огромное количество различных путей зарядового транспорта. На наш взгляд, анализ импеданса системы “образец-контакт-вода” сможет установить зависимости между электропроводящими параметрами (емкость и сопортивление пили, утечки и границы) и содержанием воды в этой системе.

4.2.3. Импеданс-спектроскопия Все представленные годографы имеют развертку по частоте от большей к меньшей слева направо. В первую очередь исследовалась зависимость вида годографа импеданса от относительной влажности в боксе. Характерными особенностями в поведении годографа (см рис. 18 a) являются:

• Сопротивление образца падает с повышением влажности

• Годограф импеданса состоит из нескольких полуокружностей и, в некоторых случаях, прямых

• Имеется критическая влажность ( 83%), по достижении которой в низкочастотной области происходит выпрямление годографа - начинает доминировать диффузионный вклад.

Результаты и обсуждение

• При низком значении влажности (55%) весь годограф можно описать одной R-C цепочкой. Однако затруднительно говорить о конкретном механизме протекания заряда.

• При низких значениях влажности (меньше 70 %) оцененная по годографу отсечка окружности примерно коррелирует с данными прямотоковых измерений (см рис. 17

–  –  –

Для более детального анализа получаемых годографов импеданса мы также исследовали набор контрольных образцов (все фотолитографические площадки обрабатывались суспензией пилей):

• “Пустышка” участок кремния между ePt+iPt контактами, не содержащий нанопровод. Форма и расположение контактов максимально воспроизводили случай образца пили • “Закоротка” замыкание двух фотолитографических золотых контактов платиной или вольфрамом осажденных галиевым пучком Из рисунка 18 b видно существенное различие в поведении импеданса пили и “пустышек”. В некоторых случаях “пустышки” описывались чистой емкостью (голубая вертикальная прямая на годографе) или же представляли собой чисто ионный проводник (зеленая кривая на рисунке). В большинстве случае диапазоны отсекаемых полуокружностей для образца пилей лежали внутри диапазона высокочастотной (от 2 MHz до 10kHz) полуокружности “пустышки”.

Результаты и обсуждение

На каждой из измеряемых пластинок в качестве реперных точек выступали “пустышки” и “закоротки”, что позволяло нам с большей достоверностью анализировть получаемые данные на пилях. При любой влажности, годографы получаемых импедансов на контрольных образцах и на объектах исследования различались.

Рис. 19. Предложенная эквивалентная схема для образца нанопровода

–  –  –

Рис. 20. a) Фитирование годографа предложенной моделью (85 % RH) b) Зависимость параметров модели от влажности Следует отметить, что в случае образцов пилей на годографе отчетливо наблюдалось две полуокружности и периодически можно было различить третью в узком диапазоне значений относительной влажности (75-85 % RH). Дальнейшее увлажнение (90 %RH) образца приводило к невоспроизводимым годографам, рассмотРезультаты и обсуждение рением которых мы в данной работе заниматься не будем. Для детального анализа годографа импеданса воспользовались методом описания с помощью набора эквивалентных схем (см рис. 19).

В предложеной модели есть три принципиальных блока соединенных последовательно. Один из них, с индексом g, соответствует высокочастотной области (от 2 MHz до 10-ов kHz) спектра и гипотетически описывает ионную подвижность во всей системе и возможную адсорбцию на электродах. Блок с индексом 1 соответствует вкладу от границы. Блок с индексом s отвечает проводимости на низких чистотах (от 1 kHz до 1 Hz) и предположительно описывает электронно-дырочный транспорт в пиле.

Таблица 3. Зависимость резистивных параметров модели от длины пили Параметр Пластинка 1 Пластинка 2 Пластинка 3 L(µm) 3.

489 2.951 7.252 4.3 4.912 4.270 Rg(Oм) 1.1e5 9.7e5 7.6e5 2.4e6 3.2e7 2.9e6 R1(Ом) 842 7604 3.0e5 2.9e5 Rs(Ом) 7.6e6 3.5e6 2.0e6 0.5e6 9.4e6 7.9e6 Обработав большую часть экспериментальных данных этой моделью (напр., рис. 20 a), можно с большой уверенностью сопоставить сопротивление Rs с сопротивлением самого нанопровода заключенного между контактами. Учитывая ограничения прибора по сопротивлению, можно предположить о независимости величины Rs (см рис. 20 b) от влажности (после некоторого “критического” значения) и тем самым убедиться в структурирующей функции воды в белковом нанопровде, приводящей к наблюдению электропереноса. Значения Rg и R1 закономерно уменьшаются с увеличением влажности. Предполагая ионный характер, можно допустить, что с увеличением толщины слоя воды мы увеличиваем подвижность ионов в системе.

Стоит заметить (см таблицу 3), что внутри каждой измерительной ячейки значение Rs почти классически меняется с длиной нанопровода.

Данные абсолютных значений Rs обладают значительным разбросом(в один порядок) от пили к пили, особенно на разных измерительных ячейках.

Это может быть объяснено двумя причинами:

• Различная площадь контакта в попереченом сечении пили с электродом

• Возможное различное физическое повреждение внутри конструкции нанопровода. К сожалению набор имеющихся у нас методов не позволяет устанавливать структурные дефекты внутренней организации пилей Анализ зависимостей емкостей Cs, C1, Cg в эквивалентной схеме от значений влажности показал:

–  –  –

ствует 100µF/cm2 ) и Cg( 1013 F, при учете площадей контактов, соответствует 10µF/cm2 ). Характер этого элемента не является чисто емкостным эквивалентным представлением, а скорее представляет из себя элемент постоянной фазы (constant phase element, CPE) с показателем степени 0.3-0.5 = 0.3 05, число n определяет угол наклона), что характерно (Z = C(iw)n, n для распределенных структур

• В свою очередь C1 и Cg имеют чисто емкостную природу в большом диапазоне значений влажности. По порядку величины они соответсвуют емкости адсобированных тонких слоев

• Сg практически не зависит от влажности

• Значение Cs возрастает с увеличением влажности

• С1 имеет неоднозначный характер зависимости от влажности Полученные электрофизические данные показали наличие проводимости в пилях, но не позволяют однозначно установить мехнизм проводимости в нанопроводах. Предполагая, что электронный транспорт в пилях может осуществляться мультигемовыми цитохромами, мы проверили влияние характеристического (532 nm и 420 nm)[29] для этой простетической группы облучения на поведение годографа. Из рисунка 21 видно изменения форм годографов превышающих точность измерений. Однако для однозначных выводов о вилянии света на проводимости требуются дальнейшие исследования.

–  –  –

Рис. 21. Красный цвет кривой соответствует темновым измерениям, синий облученным a) Эффект от облучения дневным светом. b) Эффект облучения зеленым светом (532 nm)

–  –  –

5. Результаты и выводы

• Разработана методика выделения и нанесения одиночных пилей на кремниевую подложку.

• Предложен способ изготовления проводящих контактов к био-полимерам с помощью фокусированного пучка ионов, исключающим химическую модификацию образца (за исключением, возможно, контактной зоны).

• Методами АСМ изучена морфология и проводящие свойства пилей. Показано отсутствие поперечной проводимости. Разработан способ изготовления острых, проводящих, износоустойчивых зондов для исследования био-объектов.

• Обнаружено и изучено влияние среды(влажности) на транспортные свойства вдоль пили.

• Показана применимость импеданс-спектроскопии для исследования одиночного нанопровода биологической природы.

–  –  –

6. Благодарности Автор выражает благодарность за руководство и поддержку своим научным руководителям Мотовилову Константину Александровичу и Дремову Вячеславу Всеволодовичу.

Так же хотелось бы поблагодарить :

• к.х.н. Черняка А.В. (ИПХФ РАН, г. Черноголовка) за регистрацию ЯМРспектров

• к.ф.-м.н. Акимова А.В. (ИПХФ РАН, г. Черноголовка) за регистрацию ЭПРспектров

• к.т.н. Абрамчука С.С. (МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва) за проведение ПЭМ измерений

• аспиранта Таланцева А.Д. (ИПХФ РАН, г. Черноголовка) за измерение магнитной восприимчивости

• к.ф.-м.н. Храпая В.С. (ИФТТ РАН, г. Черноголовка) за проведение фотолитографии и ценные обсуждения

• Гриненко Вадима (Leibniz Institute for Solid State and Materials Research, Dresden) за калориметрические измерения

• Ванькова А.Б. (ИФТТ РАН, г. Черноголовка) за помощь в измерений КР и ГКР

• Кононихина Алексея и Бугрову Анну (ИБХФ им. Эммануэля РАН, г. Москва) за масс-спектрометрические измерения Отдельные слова благодарности хочется сказать Барзиловичу Петру Юрьевичу за ценные обсуждения, помощь в проведении исследований и решающий вклад в транспортные измерения.

–  –  –

Список литературы [1] A. Szent-Gyrgyi, “The study of energy-levels in biochemistry,” Nature, vol. 3745, o pp. 157–159, 1941.

[2] R. Marcus, “Electron transfer reactions in chemistry. Theory and experiment,” Reviews of Modern Physics, no. 2, 1993.

[3] B. Chance and M. Nishimura, “On the mechanism of chlorophyll-cytochrome interaction: the temperature insensitivity of light-induced cytochrome oxidation in Chromatium,” Proceedings of the National Academy of..., vol. 46, no. 1, pp. 19–24, 1960.

[4] D. Devault, “Quantum mechanical tunnelling in biological systems,” Quarterly reviews of biophysics, vol. 4, no. 1980, pp. 387–564, 1980.

[5] D. Devault, J. Parkes, and B. Chance, “Electron tunnelling in cytochromes,” 1967.

[6] J. Jortner, “Dynamics of electron transfer in bacterial photosynthesis,” Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on..., vol. 594, pp. 193–230, 1980.

[7] J. a. Gralnick and D. K. Newman, “Extracellular respiration.,” Molecular microbiology, vol. 65, pp. 1–11, July 2007.

[8] Y. Gorby and S. Yanina, “Electrically conductive bacterial nanowires produced by Shewanella oneidensis strain MR-1 and other microorganisms,” Proceedings of the..., vol. 106, pp. 9535–9535, May 2006.

[9] G. Reguera, K. D. McCarthy, T. Mehta, J. S. Nicoll, M. T. Tuominen, and D. R.

Lovley, “Extracellular electron transfer via microbial nanowires.,” Nature, vol. 435, pp. 1098–101, June 2005.

[10] V. Watson, “Shewanella oneidensis MR-1 compared to mixed cultures for electricity production in four dierent microbial fuel cell congurations,” no. May, 2009.

[11] S. Pirbadian, “Shewanella oneidensis MR-1 nanowires are outer membrane and periplasmic extensions of the extracellular electron transport components,” Proceedings of the..., vol. 111, no. 35, pp. 12883–12888, 2014.

[12] P. N. Reardon and K. T. Mueller, “Structure of the type IVa major pilin from the electrically conductive bacterial nanowires of Geobacter sulfurreducens.,” The Journal of biological chemistry, vol. 288, pp. 29260–6, Oct. 2013.

–  –  –

[14] N. S. Malvankar, M. Vargas, K. P. Nevin, A. E. Franks, C. Leang, B.-C. Kim, K. Inoue, T. Mester, S. F. Covalla, J. P. Johnson, V. M. Rotello, M. T. Tuominen, and D. R. Lovley, “Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks.,” Nature nanotechnology, vol. 6, pp. 573–9, Sept. 2011.

[15] E. E. Roden, A. Kappler, I. Bauer, J. Jiang, A. Paul, R. Stoesser, H. Konishi, and H. Xu, “Extracellular electron transfer through microbial reduction of solid-phase humic substances,” Nature Geoscience, vol. 3, pp. 417–421, May 2010.

[16] N. S. Malvankar and D. R. Lovley, “Microbial nanowires: a new paradigm for biological electron transfer and bioelectronics.,” ChemSusChem, vol. 5, pp. 1039– 46, June 2012.

[17] K. M. Leung, G. Wanger, M. Y. El-Naggar, Y. Gorby, G. Southam, W. M. Lau, and J. Yang, “Shewanella oneidensis MR-1 bacterial nanowires exhibit p-type, tunable electronic behavior.,” Nano letters, vol. 13, pp. 2407–11, June 2013.

[18] M. Y. El-Naggar, G. Wanger, K. M. Leung, T. D. Yuzvinsky, G. Southam, J. Yang, W. M. Lau, K. H. Nealson, and Y. a. Gorby, “Electrical transport along bacterial nanowires from Shewanella oneidensis MR-1.,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 107, pp. 18127–31, Oct.

2010.

[19] G. Binnig, C. Quate, and C. Gerber, “Atomic force microscope,” Physical review letters, vol. 56, no. 9, 1986.

[20] G. Binnig and H. Rohrer, “Scanning tunneling microscopy,” IBM Journal of research and development, vol. 1165, 2000.

[21] V. Dremov, V. Fedoseev, P. Fedorov, and A. Grebenko, “Fast and reliable method of conductive carbon nanotube-probe fabrication for scanning probe microscopy,” Review of Scientic Instruments, vol. 86, p. 053703, May 2015.

[22] Дремов, Развитие и применение методов сканирующей зондовой микроскопии для исследования свойств точечных контактов. 2001.

[23] Графов and Укше, Электрохимические цепи переменного тока. Москва: Издательство Наука, 1973.

[24] M. Firer-Sherwood, “Solution-based structural analysis of the decaheme cytochrome, MtrA, by small-angle X-ray scattering and analytical ultracentrifugation,” The Journal of..., no. Iii, pp. 11208–11214, 2011.

–  –  –

[25] T. Spiro and T. Strekas, “Resonance Raman spectra of heme proteins. Eects of oxidation and spin state,” Journal of the American Chemical Society, vol. 570, no. 20, pp. 338–345, 1974.

[26] D. Richardson and J. Butt, “The ’porin–cytochrome’model for microbe–to–mineral electron transfer,” Molecular..., vol. 85, no. May, pp. 201–212, 2012.

[27] S. Tuzi and K. Shinzawa-Itoh, “A high–resolution solid–state 13C–NMR study on crystalline bovine heart cytochrome–c oxidase and lysozyme,” European Journal of..., vol. 720, pp. 713–720, 1992.

–  –  –

[29] Z. Wang, C. Liu, and X. Wang, “Kinetics of reduction of Fe (III) complexes by outer membrane cytochromes MtrC and OmcA of Shewanella oneidensis MR-1,” Applied and..., vol. 74, pp. 6746–55, Nov. 2008.





Похожие работы:

«Хабибуллина Наиля Робертовна СООБЩЕСТВА ПОЧВЕННОЙ МЕЗОФАУНЫ АГРОЦЕНОЗОВ ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН 03.02.08. – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Каз...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт...»

«ХУТОРНЕНКО Анастасия Александровна Активация опухолевого супрессора р53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биол...»

«УДК 551.5:633.358 В.В.Иконникова, ас. Одесский государственный экологический университет МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ СРОКОВ СЕВА НА ПРОДУКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС ГОРОХА ПО ОСНОВНЫМ ПРИРОДНОКЛИМАТИЧЕСКИМ ЗОНАМ УКРАИНЫ В работе приведены результаты численных...»

«Применение биологических и синтетических материалов при реконструктивнопластических операциях у больных раком молочной железы 1,2 Д.м.н. Зикиряходжаев А.Д., 1,2 к.м.н. Ермощенкова М.В., 1,2 д.м.н., академик Чиссов В.И., 1 к.м.н. Сухотько А.С., 3 Усов А.В., Тукмаков А.Ю., 1 Трегубова А.В. Московский н...»

«,, ‰ "‡" ‰ 9-„ ‡‡ ··‡‚‡ ‚‰ ‚ ·‡‚‡ ·‡‰‡ · il (‡ № 369 03.06.2016) y e © ‚ ·‡‚‡ ·‡‰‡ · – 2016 d ‚ ‡‚‡ ‡. ‡‚‡ ‰‡ ‡-· „ ‡, ‚‡ ‡‡ ‚ n ‰‚‡ ‡ · ‡„ ‡ ‚‡. "‰‡‚-„‡ " Отзывы, замечания и предложения, связанные с учебником, просим отправлять на электронные адреса: tahsil_az@yahoo.com и p dеrslik@edu.gov.az Заранее благодарим за сотрудничество! a il y e d n p a il y e d n p a il y e d n p a.– 1-‡ ‡. ·‡‰‡ ‡‰ ‡ – ‡ 2-‡ ‡...»

«Научный журнал КубГАУ, №76(02), 2012 года 1 УДК 579+578]:378.096(091) UDC 579+578]:378.096(091) HISTORY OF FORMATION AND DEVELOPИСТОРИЯ СТАНОВЛЕНИЯ И РАЗВИТИЯ MENT OF THE DEPARTMENT OF MICROBIКАФЕДРЫ МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИЗОOLOGY, EPI...»

«Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение "Лицей №38" г. Белгорода РАССМОТРЕНА СОГЛАСОВАНА УТВЕРЖДАЮ на заседании ШМО заместитель директора директор МАОУ Протокол № 6_ Сальникова И.В._/ "Лицей №38" от "25"_июня_2014_г. "25"_июня_2014_г. А.В.Зарубин /_/ "2"_июля_2014_...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, II, 1, 1968 УДК 576.895.77 СЛЕПНИ ( D I P T E R A, T A B A N I D A E ) Ч У Й С К О Й Д О Л И Н Ы И С Е В Е Р Н Ы Х СКЛОНОВ К И Р Г И З С К О Г О А Л А Т О О П. А. Чиров Институт биологии АН Киргизской ССР Приводятся оригинальные данные о видовом составе, экологии и биологии слепней бассейна Чуйской долины. Обнаружено 16 видо...»

«News Biosphere Reserve “Askania Nova”, vol. 4, 2002 УДК 599.323.4 И. В. Загороднюк Институт зоологии им. И. И. Шмальгаузена НАН Украины ул. Б. Хмельницкого, 15, г. Киев, 01601 Украина ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ РЕВИЗИЯ...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, III, 1, 1969 УДК 576.895.421 ИНТЕНСИВНОСТЬ ГАЗООБМЕНА У КЛЕЩЕЙ HYALOMMA ASIATICUM P. SCH. ЕТ Е. SCHL., ЗАРАЖЕННЫХ РИККЕТСИЯМИ COXIELLA BURNETI И DERMACENTROXENUS SIBIRICUS Ю. С. Балашов и А. Б. Дайтер Зоологич...»

«Самарская Лука: проблемы региональной и глобальной экологии. Самарская Лука. 2009. – Т. 18, № 4. – С. 118-124. УДК 581.5 К ИЗУЧЕНИЮ ФЛОРЫ ПРУДОВ НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА "ХВАЛЫНСКИЙ" © 2009 Е.С. Бекренева, М.В. Закурдаева, О.В. Седова* Саратовский государственный университет, г....»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.