WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы «АВИУМ» для выявления возбудителя туберкулеза M. avium методом полимеразной цепной реакции ...»

ИНСТРУКЦИЯ

по применению тест-системы «АВИУМ» для выявления возбудителя туберкулеза

M. avium методом полимеразной цепной реакции

(организация-производитель – ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г.Москва)

Тест система «АВИУМ» (test-system «AVIUM») для выявления ДНК Mycobacterium

в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

avium

выпускается в одном формате.

Формат EPh - для выявления ДНК Mycobacterium avium в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Форматы и формы выпуска тест-системы.

Формат EPh Тест-система «АВИУМ» (test-system «AVIUM») формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в двух формах комплектации:

Форма 1 включает:

«ДНК-сорб-В» вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

«ПЦР-комплект» вариант 50 R - комплект реагентов для амплификации участка ДНК Mycobacterium avium;

«ЭФ» вариант 200 - комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

Форма 2 включает:

«ПЦР-комплект» вариант 50 R - комплект реагентов для амплификации участка ДНК Mycobacterium avium;



Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК Mycobacterium avium и электрофоретическую детекцию.

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК Mycobacterium avium. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК и электрофоретической детекции, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

1.1. Комплект реагентов «ДНК-сорб-В» вариант 50 состоит из следующих компонентов:

1 флакон, 15,0 см3 (мл) Лизирующий раствор 1 флакон, 15,0 см3 (мл) Раствор для отмывки 1 1 флакон, 50,0 см3 (мл) Раствор для отмывки 2 1 пробирка, 1,25 см3 (мл) Сорбент универсальный Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 1 из 11 1 пробирка, 5,0 см3 (мл) ТЕ-буфер для элюции ДНК Комплект реагентов рассчитан на экстракциию ДНК из 50 проб, включая контроли.

1.2. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R состоит из следующих компонентов:

ПЦР-смесь-1-R АВИУМ, раскапана под воск 55 пробирок по 0,005 см3 (мл) в пробирки объемом 0,5 или 0,2 мл 1 пробирка, 0,6 см3 (мл) ПЦР-смесь-2 blue 1 пробирка, 2,0 см3 (мл) Минеральное масло для ПЦР 2 пробирки по 0,1 см3 (мл) ПКО ДНК Mycobacterium avium 1 пробирка, 0,5 см3 (мл) ДНК-буфер Комплект реагентов рассчитан на 55 реакций амплификации, включая контроли.

К комплекту реагентов прилагается контрольный образец этапа экстракции:

1 пробирка, 1,2 см3 (мл) ОКО

1.3. Комплект реагентов «ЭФ» вариант 200 cостоит из следующих компонентов:

Трис-боратный буфер (ТБЕ) концентрированный с 1 флакон, 50,0 см3 (мл) бромидом этидия Агароза для электрофореза ДНК 2 флакона по 1,7 г Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля - 5 рядов по 24 лунки).

Упаковка и маркировка.

2.

На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.

Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение ТУ/СТО и надпись «Для животных». В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.

Транспортирование и хранение.

3.

Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.

Комплект реагентов «ДНК-сорб-В» хранить при температуре от 2 до 25 °С, комплект реагентов «ПЦР-комплект» хранить при температуре от 2 до 8 °С, комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света месте.

Срок годности тест-системы - 12 месяцев с даты изготовления.

4.

II. ПРИНЦИП МЕТОДА

5. Метод обнаружения ДНК Mycobacterium avium основан на амплификации специфического участка ДНК за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы.

Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 2 из 11

III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

6. Тест-система предназначена для выявления ДНК Mycobacterium avium в биологическом материале и культурах микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

7. Отбор материала для исследования.

7.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать как меры личной безопасности, так и меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

7.2. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.

7.3. Для проведения анализа используется следующий материал:

Культуры микобактерий.

Цельная кровь.

Молоко КРС.

Биопсийный материал, в т.ч. лимфатические узлы.

Мокрота.

Фарингеальные смывы.

Моча.

Фекалии.

Носовая слизь.

7.4. Жидкости (кроме крови) для исследования отбирают в объеме 20 мл.

7.5. Из тканей и органов вырезают кусочки размером 111 см (при невозможности размер кусочков может быть меньше). Лимфоузлы берут целиком.

7.6. Цельную кровь в объеме 5-10 мл берут в пробирки типа Vacuette с предварительно добавленным антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или 3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают, чтобы перемешать консервант.

7.7. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при температуре от 2 до 8 °С. Допускается замораживание и длительное хранение материала при температуре не выше минус 16 °С (кроме крови).

8. Подготовка исследуемого материала.

8.1. Пробы культур микобактерий, снятые с косяка, ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе в соответствии с отраслевым стандартным образцом мутности и исследуют в объеме 10 мкл.

8.2. Цельную кровь с антикоагулянтом в объеме 100 мкл используют для экстракции ДНК без предварительной подготовки.

8.3. Пробы мокроты и носовой слизи смешивают с раствором «муколизина» в соотношении 5:1 (5 частей «муколизина» к 1 части образца), ориентируясь по градуировке контейнера. Закручивают крышку, встряхивают содержимое и инкубируют 20-30 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая контейнер (каждые 2-3 мин). После разжижения мокроты, которое определяется визуально, переносят 0,1 мл этой пробы в пробирку объемом 1,5 мл и используют для экстракции ДНК.

8.4. Пробы фарингальных смывов, мочи или молока в количестве 10 мл центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, но не полностью, так, чтобы над осадком оставалось примерно 0,1 мл жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку наливают еще 10 мл материала и повторяют центрифугирование в том же режиме. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости, переносят в пробирку объемом 1,5 мл и используют для экстракции ДНК.





8.5. Кусочек фекалий массой 0,25-0,8 г тщательно суспендируют в 5 мл физиологического Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 3 из 11 раствора (т.е. готовят 5-15% суспензию). Суспензию центрифугируют на низкооборотной центрифуге при 1,5 тыс об/мин в течение 5 мин и 0,1 мл надосадочной жидкости и используют для экстракции ДНК.

8.6. Биопсийный и секционный материал гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл и позволяют отстояться осадку в течение 1-3 мин. Надосадочную жидкость (50 мкл) используют для экстракции ДНК. При необходимости повторного проведения анализа остаток суспензии замораживают при температуре не выше минус 16С.

IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР

9. ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

ЗОНА 1 - для экстракции ДНК из исследуемого материала:

9.1.

стерильный ламинарный шкаф (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).

твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).

вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г.Ульяновск, Россия).

микроцентрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).

вортекс (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 100 мкл, до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, «Axygen», США).

одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).

штативы для микропробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).

холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 С.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

9.2. ЗОНА 2 - для проведения амплификации ДНК:

амплификатор (например «Терцик», «ДНК-технология»).

ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).

отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема (например, «Axygen», США).

штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 С.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

9.3. ЗОНА 3 - для электрофоретического анализа продуктов ПЦР:

камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например, «SEХеликон», Россия).

Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 4 из 11 источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В (например, «Эльф-4», «ДНК– Технология», Россия).

ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например, «Биоком», Россия).

видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов (например, «Биотест-1», «ЦНИИ Эпидемиологии», Россия; «BioRad», США).

аквадистиллятор.

холодильник от 2 до 8 °С для хранения продуктов амплификации.

микроволновая печь для плавления агарозы.

колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы на 250 мл.

мерный цилиндр на 1 литр.

штатив для микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

отдельный автоматический дозатор переменного объема 10 - 40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, «Axygen», США).

пластиковая емкость на 5 литров для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

10. Порядок работы.

10.1. ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция ДНК из исследуемого материала.

Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60-65 °С до полного растворения кристаллов.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный и положительный контроли экстракции). Внести в каждую пробирку по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.

В пробирки с лизирующим раствором внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля экстракции (В-) внести 100 мкл ОКО, используя наконечник с аэрозольным барьером. В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО ДНК Mycobacterium avium, используя наконечники с аэрозольным барьером.

Если подготовка проб велась с использованием физиологического раствора, то приготовить еще один отрицательный контроль экстракции (В- ФР): в пробирку с лизирующим раствором внести 100 мкл физиологического раствора.

Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при температуре 65 °С.

Процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах и использовать для экстракции ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального.

Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.

Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 5 из 11 Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, удалить надосадочную жидкость полностью.

Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе.

Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

Процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

10.2. ЭТАП 2 (зона 2). Проведение амплификации.

Общий объем реакции - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

В комплекте реагентов для амплификации «ПЦР-комплект» применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска.

Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при 95 °С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.

Порядок работы:

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R АВИУМ для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R АВИУМ.

Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не добавлять.

Б. Проведение амплификации.

Взять подготовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с аэрозольными барьерами, внести по 10 мкл ДНК, исследуемых образцов или контролей этапа экстракции.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К–) - вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.

б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК Mycobacterium avium.

Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1). Когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 С, поставить программу на паузу, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

–  –  –

Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 7 из 11 Б. Порядок работы.

Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать изпод слоя масла по 10-15 мкл проб и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.

Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры SE-2 («Хеликон», Россия) и источника питания «Эльф-4» (ЗАО «НПФ ДНК Технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см.

По завершении времени электрофореза (краситель при этом пройдет примерно половину длины геля - 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных.

ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной!

В. Дезактивация буфера и гелей.

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

–  –  –

Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 8 из 11

14. Кроме специфической светящейся полосы в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар.

15. Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:

если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в табл. 2, то соответствующий этап анализа следует переделать.

в дорожке, соответствующей положительному контролю (ПК, К+), отсутствует специфическая светящаяся полоса. Возможные причины: ошибка в подготовке реактивов, постановке ПЦР или сбой программы амплификатора.

в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

если в отрицательных контролях (В–, В– ФР, К–) выявляется специфическая светящаяся полоса, значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб с первого этапа проведения анализа (экстракция ДНК из клинического материала), а также принять меры по выявлению источника контаминации.

VI. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

16. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с аэрозольным барьером.

Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2% раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

17. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз.

18. Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать одноразовые перчатки.

19. Анализ проводится в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), согласно МСХиП РФ 27.01.1997г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующий метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденные Департаментом ветеринарии.

20. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое. Сотрудники, работающие в помещении для детекции продуктов амплификации (зона 3), не должны посещать помещения для обработки клинического материала (зона 1) и проведения ПЦР (зона 2). Смена верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофоретического анализа.

21. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, должны обязательно до начала и после окончания работ облучаться ультрафиолетовым светом.

22. Обеззараживание биоматериалов и реагентов проводят для каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду, колбы-ловушки вакуумных отсасывателей на 20-24 ч в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2% раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

23. Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.

Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 9 из 11 Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).

–  –  –

Формат EPh Форма 2: Кат. №№: VET-18-R0,2-K; VET-18-R0,5-K / Дата изменения: 20.02.13 / стр. 11 из 11



Похожие работы:

«Пояснительная записка Рабочая программа по биологии для 11 класса составлена на основе следующих документов: Закон РФ "Об образовании" № 273-ФЗ от 29.12.2012 г. Федеральный компонент государственного стандарта среднего (полного) общего образования на базовом уровне (пр...»

«Федеральное агентство по образованию Российской Федерации ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра гидрологии и охраны водных ресурсов Е. А. Зилов ГИДРОБИОЛОГИЯ И ВОДНАЯ ЭКОЛОГИЯ: Предмет, методы, цели и задачи, история, терминология...»

«Афонина Екатерина Александровна CTPIrKTYPA И ДИНАМИКЛ ФШТОIUIЛНКТОНА РЕКИ ВЕЛИКОЙ Эколопля 03.02.08,Щиссертачия на соискание ученой степени кандидата биоломческID( наук Научrrый руковолптель: Трифонова Ирина Сергеевна доктор биологически)( н&ук, профессор Санкт-Петер...»

«"Рассмотрено" "Согласовано" "Утверждаю" Руководитель МО Зам. директора по УВР Директор школы Е.Ф. Полетаева Р.А. Сухова Протокол № Приказ № от от МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА С...»

«УДК 339 (075) ББК 65 247 Фонд оценочных средств по дисциплине "Биология" для направления подготовки 38.02.04 "Коммерция (по отраслям)" под общей редакцией Шаихова А.А. – Махачкала: Типография ДГИНХ, 2014.-29с. Фонд оценочных сред...»

«Киров, 2014 г. РПД_3-00.03.00.01_2014_32714 Концепция курса Концепция дисциплины Социальная адаптация и основы социально-правовых знаний основана на необходимости изучения комплекса мер, направленных восстановление умений и навык...»

«84 ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2011. Вып. 2 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ Зоологические исследования УДК 631.468+502.52:504.5 С.Д. Вершинина СТРУКТУРА ПОЧВЕННОЙ МЕЗОФАУНЫ В ГРАДИЕНТЕ УРБАНИЗАЦИИ Проанализированы изменения структуры по...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" Рабочая программа дисциплины "Философия" Направление подготовки 03.03.02 Физика Профиль подг...»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.