WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«РОЛЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК МЫШИ В ОТВЕТЕ НА Т-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА ...»

На правах рукописи

ХОЧЕНКОВ

Дмитрий Александрович

РОЛЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК МЫШИ В ОТВЕТЕ НА

Т-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА

14.03.09 – «Клиническая иммунология, аллергология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Сидорова Екатерина Владимировна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Ахматова Нэлли Кимовна Доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН Ярилин Александр Александрович

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится 15 марта 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН.



Автореферат разослан «____» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Ирина Владимировна Яковлева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Дендритные клетки (ДК) – семейство лейкоцитов костномозгового происхождения. Особенно много их в местах взаимодействия с окружающей средой (кожа и слизистые оболочки). ДК являются основными антигенпрезентирующими клетками [Banchereau, 2000]. Они наделены способностью индуцировать первичный иммунный ответ, участвуют в формировании иммунологической памяти и в поддержании толерантности. Помимо презентации клеткам антигенов (Аг), «встроенных» в МНС, активированные ДК продуцируют цитокины, стимулирующие наивные Т лимфоциты [Villadangos, 2005].

Большая часть касающихся ДК данных получена при изучении их роли в ответе на Т-зависимые антигены (ТЗ Аг). Известно, однако, что многие Аг относятся к Т-независимым (ТН Аг), ответ на которые осуществляется без участия Т хелперов [Mond, 1995]. Это связано с тем, что ТН Аг неспособны встраиваться в МНС и презентироваться таким способом Т лимфоцитам [Defrance, 2011]. В число ТН Аг входит большинство бактериальных поли- и липополисахаридов, а также синтетические полимеры с повторяющимися Агэпитопами (например, поливинилпирролидон с мол. массой 350 кДа, полимеры D-аминокислот) [Bachmann, 1993]. ТН Аг подразделяются на ТН-1 Аг, обладающие митогенной активностью и являющиеся поликлональными активаторами В клеток, и ТН-2 Аг. ТН-2 Аг митогенами не являются.

Иммуногенность ТН-2 Аг относительно невелика [Mond, 1995].

Основными продуцентами антител (Ат) к ТН Аг являются В-1 лимфоциты и клетки маргинальной зоны селезенки (MZ-B клетки). Эти субпопуляции обладают рядом характерных особенностей, отличающих их от «обычных» или конвенциональных В-2 клеток [Сидорова, 2006].

Ответ В-1 и MZ-B клеток на проникшие в организм патогены не требует формирования зародышевых центров и клонов Аг-специфичных Т и В лимфоцитов, поэтому он начинается практически сразу и приводит к образованию IgM Ат [Baumgarth, 2011]. Более специфичный и мощный адаптивный иммунный ответ, обусловливаемый В-2 клетками, развивается позднее, приводя как к образованию IgG Ат, так и к появлению клеток памяти.





Таким образом, В-1 и MZ-B лимфоциты обеспечивают первую линию защиты организма от патогенов и относятся к клеткам, соединяющим врожденный и адаптивный иммунитет [Berland, 2002].

Значительную роль в иммунном ответе играют клеточные взаимодействия. Так, ДК необходимы для активации наивных Т клеток и индукции ответа на ТЗ Аг [Banchereau, 2000]. Клеточные и молекулярные механизмы иммунного ответа на ТЗ Аг хорошо изучены. Механизмы «запуска»

В клеток ТН-2 Аг исследованы значительно хуже. Известно, что для ТН-2 ответа необходимо наличие повторяющихся Аг-детерминант, высокий молекулярный вес, «жесткость» структуры и т.д. [Mond, 1995]. В то же время неясно, какие механизмы обеспечивают пролиферацию и дифференцировку В-1 клеток под влиянием ТН-2 Аг; не исследованы клеточные взаимодействия и факторы, участвующие в процессе; неизвестна роль ДК в ответе и т.д. Ответ на все эти вопросы существенен для развития представлений об иммунитете. Вместе с тем до сих пор этот вопрос даже не ставился. Выяснение роли ДК в ответе на ТН-2 Аг может представлять определенный интерес и с практической точки зрения.

Не исключено, что использование ДК позволит увеличить иммуногенность бактерильных ТН-2 Аг и найдет применение при создании «дендритных вакцин». Все это и определяет актуальность настоящей работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является изучение роли ДК в иммунном ответе мышей на Т-независимые антигены 2 типа.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получить наивные ДК из костномозговых предшественников;

Синтезировать флуоресцентный конъюгат (13) декстрана;

Отработать нагрузку полученных ДК ТН Аг 1-го и 2-го типов;

Охарактеризовать фенотипически наивные ДК, и ДК нагруженные ТН-2 Аг;

Получить и охарактеризовать субпопуляции В-1 клеток перитонеальной полости и В-2 клеток селезенки мышей;

Отработать условия совместного культивирования ДК со спленоцитами, В-1 и В-2 клетками;

Определить число антитело- и иммуноглобулин-образующих клеток в культурах спленоцитов, В-1 и В-2 клеток при инкубации их с ДК, нагруженными ТН-1 и ТН-2 антигенами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показано прямое связывание ТН-2 Аг наивными ДК, выращенными из костномозговых предшественников, Впервые исследовано взаимодействие ДК, нагруженных и не нагруженных ТН-2 Аг, с В-1 и В-2 лимфоцитами мыши в системе in vitro, Впервые продемонстрирована иммуногенность ТН-2 Аг, связанных с ДК, и установлено, что она выше таковой самих Аг, Впервые показано, что ТН-2 Аг, связанные с ДК, индуцируют как появление антитело-образующих клеток, так и увеличение числа клеток, продуцирующих поликлональные иммуноглобулины. При этом поликлональная активация ниже, чем при ответе на нативные ТН-2 Аг, Впервые показано, что xid-мутация не влияет на способность ДК, презентировать ТН-2 Аг, и индуцировать иммунный ответ в системе in vitro, Впервые установлено, что в образовании антитело- и иммуноглобулинпродуцентов, индуцированных ТН-2 Аг, связанными с ДК, существенную роль играют контактные взаимодействия между клетками, Впервые показано, что основными клетками, отвечающими на ТН-2 Аг, связанные с ДК, являются В-1 лимфоциты.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований.

Использован новый подход в изучении механизмов иммунного ответа на ТН-2 Аг – выяснение в этом процессе роли ДК.

Данные об особенностях активации ДК полисахаридными ТН-2 Аг, входящими в состав ряда микроорганизмов, имеют значение для выяснения механизмов взаимодействия патогенов с иммунной системой хозяина.

Выявление влияния ДК на функциональную активность В-1 и В-2 клеток и роли в этом процессе контактных взаимодействий расширяют наши представления о взаимодействиях лимфоидных и миелоидных клеток.

Выявленное повышение иммуногенности полисахаридных Аг при связывании их с ДК, открывает перспективы при разработке ДК-вакцин.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. ТН-2 Аг ((13) декстран, полисахарид S3 и поливинилпирролидон 360 кДа), связанные с ДК, индуцируют иммунный ответ в культуре спленоцитов. Для индукции ответа на ТН-2 Аг, связанные с ДК, требуется непосредственный контакт В лимфоцитов и ДК.

2. Поликлональная активация В лимфоцитов, индуцированная ТН-2 Аг связанными с ДК, ниже таковой при ответе на нативные ТН-2 Аг.

3. ДК, полученные из костномозговых предшественников xid-мышей под действием GM-CSF, по исследованным параметрам не отличаются от ДК, выделенных из костного мозга нормальный мышей.

4. Основными клетками, отвечающими на ТН-2 Аг, связанные с ДК, являются В-1 клетки.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации обсуждены на конференции молодых учёных НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009), международном симпозиуме «B Cells and Protection: Back to basics» (Сан Фелиу-де-Гишольс, Испания, 2010), конференции FOCIS (Бостон, США, 2010), 4-й международной конференции «В клетки и аутоиммунитет» (Осака, Япония, 2010).

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Апробация диссертации состоялась 7 декабря 2011 г. на научной конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И.

Мечникова» РАМН.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 17 рисунками. Библиография включает 122 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Животные. В опытах использовали самок мышей линии СВА весом 16– 18 г, полученных из НЦ биомедицинских технологий РАМН, филиал “Андреевка”. Мыши линии CBA/N (самки 16–18 г) были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории экспериментальной иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН.

Антигены. В качестве ТН-2 Аг использовали: (13) декстран (Декс) из Leuconostoc mesenteroides, любезно предоставленный д.м.н. М.Е.

Преображенской (НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН);

полисахарид Streptococcus pneumoniae type 3 (S3), любезно предоставленный проф. Бейкером (США), и поливинилпирролидон с молекулярной массой 10 и 360 кДа – ПВП-10 и ПВП-360, соответственно (“Sigma”, США). В качестве ТНАг использовали липополисахарид из Escherichia coli (“Sigma”, США).

Флуоресцентный конъюгат Декс с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) получали по ранее описанной методике [de Belder, 1973] с незначительными изменениями.

Получение дендритных клеток. ДК выделяли по методу Lutz M.B. с незначительными модификациями [Lutz M.B., 1999]. Клетки костного мозга мышей культивировали в чашках Петри для суспензионных культур (“Corning”, США), в течение 10 сут в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС и GM-CSF 25 мкг/мл (“Biosource”, США). Исходная концентрация клеток при внесении в культуру составляла клеток/мл. На 3-й день культивирования в чашки добавляли равное количество среды. В дальнейшем каждые 2 дня заменяли 50% среды. На 10 день клетки собирали, осаждали и подсчитывали количество живых и мертвых клеток в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего (“Gibco”, США) в 0,9% растворе NaCl (“Serva”, Германия). Полученные ДК использовались в дальнейших экспериментах, в том числе для нагрузки Аг.

Нагрузка ДК ТН-2 Аг. Для нагрузки ТН-2 Аг наивные ДК инкубировали с Аг в концентрации 100 мкг/106 ДК в CO2-инкубаторе в течение 24 ч при 37C и 5% CO2. Для получения неспецифически активированных ДК клетки инкубировали с ЛПС E. сoli в концентрации 2 мкг/106 ДК в течение 24 час.

Моноклеточную суспензию Получение суспензии спленоцитов.

спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в 5 мл среды RPMI 1640.

Клетки осаждали центрифугированием при +4°С, на 1500 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали и удаляли эритроциты гипотоническим шоком.

После лизиса эритроцитов спленоциты осаждали и дважды отмывали средой RPMI-1640. Подсчет живых и мертвых клеток проводили в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего в 0,9% растворе NaCl.

Получение В-1 и В-2 клеток мыши. В-1 клетки выделяли из брюшной полости мышей, а В-2 клетки – из селезенки. Для получения перитонеальных В-1 клеток использовали метод позитивной иммуноселекции с помощью магнитных бус фирмы Miltenyi Biotec (“Miltenyi”, США), покрытых антителами крысы к CD19 мыши.

Перитонеальные клетки получали, вымывая содержимое брюшной полости 7 мл ФСБ с 0,5% БСА (“Serva”, Германия) и 2 мМ ЭДТА (“Serva”, Германия). Клетки инкубировали с магнитными бусами, покрытыми крысиными Ат к CD19 мыши (15 мин при +4С). Перитонеальные В лимфоциты (смесь В-1 и В-2 клеток) выделяли на MACS® колонке. В-2 популяцию отделяли последовательно инкубируя перитонеальные В-клетки вначале с биотинилированными Ат к CD23 мыши (20 мин при +4С), а затем со стрептавидиновыми магнитными бусами (“Dynal”, Дания) (30 мин при +4С при постоянном перемешивании). В результате такой обработки получали В-1 лимфоциты.

В-2 лимфоциты выделяли из суспензии спленоцитов при помощи магнитных бус, покрытых Ат к CD19. После этого, последовательно инкубируя полученную В клеточную популяцию с биотинилированными Ат к СD5 и CD43 мыши (20 мин при +4оС) и стрептавидиновыми магнитными бусами (30 мин при +4оС), удаляли из суспензии В-1 лимфоциты.

Культивирование клеток in vitro. Для определения иммуногенной активности ТН-2 Аг, связанных с ДК, в лунки 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов (“Nunc”, Дания) вносили по 10 105 спленоцитов и 2 105 ДК (соотношение 5 : 1) и культивировали клетки при +37°С, 5% CO2 в течение 4 сут в полной среде RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС. По окончании инкубации клетки собирали и дважды отмывали средой RPMI 1640 с 2% ЭТС.

В полученных суспензиях определяли число антитело- и иммуноглобулинобразующих клеток (АОК и ИГОК, соответственно) методом клеточного иммуноферментного анализа (ELISPOT). В качестве контроля использовали культуры, содержащие только спленоциты, спленоциты и ТН-2 Аг, ненагруженные ДК и спленоциты.

При изучении клеточных взаимодействий аналогичным образом культивировали ДК с В-1 клетками перитонеальной полости и В-2 клетками селезенки.

Для раздельного культивирования ДК со спленоцитами использовали поликарбонатные мембранные вставки Millicell (“Millipore”, США) и 24луночные плоскодонные планшеты (“Nunc”, Дания). В лунки 24-луночного планшета вносили по 60 105 спленоцитов в объеме 1900 мкл полной среды RPMI-1640, а в мембранные вставки – 12 105 ДК в объеме 600 мкл полной среды. Вставки помещали в лунки планшета и культивировали смесь клеток в полной среде при +37°С, 5% CO2 в CO2-инкубаторе в течение 4 суток.

Определение числа АОК и ИГОК с помощью ELISPOT. Количество антитело-образующих клеток (АОК) и иммуноглобулин-образующих клеток (ИГОК) определяли с использованием нитроцеллюлозных планшетов (“Millipore”, США), которые сенсибилизировали ТН-2 Аг (для выявления АОК) в концентрации 100 мкг/мл или козьими Ат к иммуноглобулинам (IgA, IgM, IgG) мыши (“Caltag”, США) (для выявления ИГОК) в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл в течение 18 часов. Сенсибилизацию Декс и S3 проводили в цитратно-фосфатном буфере при +20°С. Сенсибилизацию ПВП-10, ПВП-360 и козьими Ат проводили в карбонат-бикарбонатном буфере при +4°С.

После сенсибилизации планшеты отмывали ФСБ. Свободные сайты связывания, блокировали 1% раствором БСА в ФСБ. Клетки (105 для выявления АОК и 104 – для ИГОК) культивировали в среде RPMI-1640 с 2% ЭТС, 24 ч. По окончании инкубации клетки удаляли, нитроцеллюлозные фильтры отмывали и последовательно добавляли усиливающую кроличью антисыворотку к -цепям IgM мыши, пероксидазный конъюгат Ат к IgG кролика и субстратный буфер, содержащий 1,4-хлорнафтол, этанол, трис-буферный раствор и H2O2. Число окрашенных зон (ИГОК и АОК) подсчитывали на фильтрах под микроскопом и пересчитывали на 106 клеток.

Фенотипирование клеток при помощи проточной цитометрии.

Фенотип клеток определяли методом проточной цитометрии после окрашивания клеток флуоресцентными конъгатами Ат к поверхностным маркерам.

В опытах были использованы Ат к поверхностным маркерам:

ФИТЦ-I-Ak и PE-CD11c (“BD Pharmingen”, США), PE-CD80 и PE-CD86 (“Caltag”, США) – для ДК; ФИТЦ-CD5, ФИТЦ-CD3, PE-CD19, ФИТЦ-CD23 (“BD Pharmingen”, США), ФИТЦ-F4/80 (“Caltag”, США) – для В-1 и В-2 клеток.

Анализ фиксированных окрашенных клеток проводили на проточном цитометре Beckman Coulter EPICS XL. Результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (“Beckman Coulter”, США) и FCS Express 3.0 (“de Novo software ”, США).

Статистическая обработка результатов экспериментов. Результаты экспериментов представлены в виде среднего арифметического и его стандартного отклонения (М ± s). Проверка нормальности распределения производилась при помощи метода Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий результатов опытов по совместному культивированию различных клеток исследовали при помощи дисперсионного анализа. Множественное сравнение средних проводили при помощи критерия Даннета. Различия рассматривались как значимые при p0,001. Статистическая обработка проводилась при помощи программы Graph Pad Prism v.5.0 (Graph Pad Software Inc, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ОБСУЖДЕНИЕ

Нагрузка ДК ФИТЦ-конъюгатом Декс. Для выявления прямого взаимодействия ТН-2 Аг с ДК использовали культуру ДК на 10 день культивирования. К ДК добавляли ФИТЦ–Декс в концентрациях 15, 25, 50, 75, 100 и 125 мкг/мл (на 1 млн ДК). Культивирование ДК с ФИТЦ–Декс производили в течение 24 ч при +4оС. Взаимодействие ФИТЦ–Декс c ДК оценивали по количеству ФИТЦ-позитивных клеток методом проточной цитометрии. Результаты приведены на рис.1.

Как и следовало ожидать, с увеличением концентрации внесенного в культуру конъюгата, пропорционально увеличивалось и количество ФИТЦпозитивных клеток, т.е. ДК, связавших Аг. При концентрации конъюгата 75– 100 мкг/мл увеличение числа ДК, связавших конъюгат, выходило на стационар ный уровень, достигая максимума при 100 мкг/мл, поэтому в дальнейших опытах было решено использовать ТН-2 Аг в концентрации 100 мкг/млн.

Рис.1. Зависимость количества ФИТЦ+-ДК от концентрации ФИТЦ-Декс

Активация ДК ТН-2 Аг. Для определения иммуногенных свойств ТН-2 Аг ДК нагружали Декс, S3 и ПВП-350 в концентрации 100 мкг/млн ДК.

Показано, что если исходно культуры ДК содержали 96, 84, 13 и 46% клеток (рис.2А), позитивных по MHC-II, CD11c, CD80 и CD86, соответственно, то после добавления Декс количество позитивных по этим маркерам клеток составило 93, 82, 22 и 96% (рис.2Б).

Экспрессия маркеров MHC-II и CD11c под влиянием Декс не менялась.

Очевидно, что характерным маркером активации ДК в опытах с Декс является CD86, поскольку наиболее значительные изменения при нагрузке клеток ТН-2 Аг наблюдаются именно в увеличении числа CD86+ ДК.

Рис.2. Влияние разных ТН-2 Аг на созревание ДК. (По оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс – интенсивность флуоресценции.Темный контур – изотипический контроль, светлый контур – экспрессия характеристических маркеров) В опытах с нагрузкой ДК S3 количество позитивных по MHC-II, CD11c, CD80 и CD86 клеток составило 95, 83, 62 и 97% (рис.2В). Следует отметить, что в отличие от Декс, S3 вызывает более сильную активацию ДК, что выражается в значительном увеличении экспрессии не только CD86, но и CD80.

Увеличение числа CD80- и CD86-позитивных клеток более чем в 2 раза свидетельствует об активации ДК. Активация ДК при нагрузке ПВП-360 была менее значительной; число CD80- и CD86-позитивных клеток не превышало 20% и 57% соответственно (рис.2Г). Таким образом, активация ДК при нагрузке ПВП-360 была значительно ниже, чем под действием микробных полисахаридов.

Установлено также, что чем сильнее активированы клетки, тем больше снижена экспрессия F4/80 по сравнению с таковой на ненагруженных ДК. Так, в норме в ДК выявляется около 83% F4/80+ клеток, а при нагрузке ДК Декс и S3 количество F4/80+ клеток составляет 71% и 63%, соответственно. ПВП-360, стимулирует ДК слабее, и количество F4/80+ клеток оказывается сравнимо с таковым в норме – 80%.

Индукция иммунного ответа in vitro Декс и S3, связанными с ДК. Для выявления иммуногенных свойств ТН-2 Аг, связанных с ДК, клетки, нагруженные Декс в концентрации 100 мкг/млн и 125 мкг/млн культивировали с нормальными спленоцитами мышей в соотношении 1 : 5 в течение 4 сут в полной питательной среде. Контролем служили культуры, содержащие наивные ДК, спленоциты и Декс, наивные ДК и спленоциты, а также только спленоциты. Иммуногенные свойства ТН-2 Аг, связанных с ДК выявляли по количеству АОК (специфическая стимуляция) и ИГОК (неспецифический поликлональный ответ) в культурах спленоцитов (рис.3).

Пик ответа на Декс при внесении в культуру спленоцитов, нагруженных им ДК, достигается на 4-е сутки культивирования. При этом достоверно увеличивается как число АОК – в 2,5 раза (с 121 ± 12 до 310 ± 21 на 106 спленоцитов), так и общее число ИГОК (~на 40%). Важно, что повышение Рис.3. Индукция образования АОК (А) и ИГОК (Б) спленоцитами, под действием Декс, связанного с ДК. Достоверность различий между контрольной и экспериментальными группами: р 0,001 * * * Рис.4. Индукция образования АОК (А) и ИГОК (Б) спленоцитами, под действием S3, связанного с ДК. Достоверность различий между контрольной и экспериментальными группами: р 0,001; (Б) * р 0,001 концентрации Декс при нагрузке ДК до 125 мкг/млн, не влечет существенного увеличения числа АОК (330 ± 8 на 106 спленоцитов). Это может быть связано с ограниченным количеством В клеток, способных к активации или предельной способностью В клеток к активации. Иммунный ответ специфичен: ДК, нагруженные Декс, ответа на другие ТН-2 Аг (S3 и ПВП-360) не вызывают.

Интересно, что иммунный ответ на Декс обеспечивают только предварительно нагруженные им ДК. Простое внесение в культуру спленоцитов наивных ДК увеличивает ответ не более чем на 34% (162 ± 10 на 106 спленоцитов).

Нативный Декс вызывает достоверное двукратное увеличение числа АОК (227 ± 17 на 106 спленоцитов). Это означает, что иммуногенность ТН-2 Аг, связавшихся с ДК, выше, чем иммуногенность только ДК или нативных ТН-2 Аг.

Поликлональная активация В-клеток при этом относительно невелика – число ИГОК, значительную часть которых, очевидно, составляют АОК, возрастает не более чем на 40% (с 5126 ± 389 в норме до 7175 ± 770 на 106 спленоцитов). Это отличает ответ спленоцитов на Декс-ДК от ответа на нативный Декс (9960 ± 1070 на 106 спленоцитов). Ранее было показано, что иммунизация ТН-2 Аг индуцирует не только появление АОК, но и значительно повышает число ИГОК, т.е. приводит к поликлональной стимуляции Влимфоцитов [Kato, 2000]. В настоящих опытах также показано, что нативный Декс вызывает почти двукратное увеличение числа ИГОК. По-видимому, механизм “запуска” В-лимфоцитов ДК, связавшими Декс, более специфичен и эффективен, чем активация В-клеток только нативным ТН-2 Аг.

Иммуногенная активность разных ТН-2 Аг, связавшихся с ДК, неодинакова и может определяться химической природой Аг. Так, S3-ДК индуцируют появление АОК, число которых по сравнению с нормой достоверно возрастает примерно в 2,7 раза (с 73 ± 10 до 196 ± 9 на 106 спленоцитов) (Рис.4).

S3-ДК, индуцировали также поликлональный ответ – прирост числа ИГОК составил 40% (9140 ± 1284 против 6440 ± 512 на 106 спленоцитов в норме).

Установлено, что индукция иммунного ответа ТН-2 Аг, связанными с ДК, требует непосредственного контакта с В-клетками. Разделение ДК и В-клеток полупроницаемой мембраной приводит к снижению числа АОК (112 ± 20 на 106 спленоцитов) и ИГОК (6514 ± 388 на 106 спленоцитов) в культурах, по сравнению с числом АОК и ИГОК при непосредственном взаимодействии ТН-2 Аг, связанных с ДК и спленоцитов. Следовательно, в индукции иммунного ответа на ТН-2 Аг, связанные с ДК принимают участие не только растворимые стимулирующие факторы (цитокины), но и контактные взаимодействия (через клеточные рецепторы).

Индукция иммунного ответа in vitro на ПВП-360, связанный с дендритными клетками. Несмотря на то, что ПВП слабо активирует ДК, проверили, не повысится ли иммуногенность ПВП-360 при связывании его с ДК. Результаты, полученные при совместном культивировании ПВП-360–ДК со спленоцитами, представлены на рис.5.

ПВП-360, связанный с ДК, вызывал образование АОК; их количество возрастало примерно в 2 раза по сравнению со спленоцитами (451 ± 22 против 230 ± 16 на 106 спленоцитов) и было сходно с таковым при прямой стимуляции спленоцитов ПВП-360 (432 ± 21 на 106 спленоцитов) (Рис.5А).

Число ИГОК при этом возрастало на 60% по сравнению с числом ИГОК у чистых спленоцитов (6672 ± 798 против 4200 ± 275 на 106 спленоцитов).

Разделение спленоцитов и ДК, полупроницаемой мембраной снижало образование АОК, как и в ранее описанных опытах (Рис.5).

Как и в предыдущих опытах, ПВП-360, связанный с ДК, индуцировал меньший поликлональный ответ, чем нативный ПВП-360.

Одной из причин более низкого иммунного ответа на ПВП-360, связанный с ДК, по сравнению с таковым на полисахариды, связанные с ДК, может являться отсутствие на ДК специфических рецепторов к ПВП-360. Как известно, на ДК имеется ряд рецепторов к полисахаридам, представленных семейством лектинов С-типа, маннозным рецептором [Tzianabos, 2001, Zamze, 2002]. Захват Аг, посредством рецепторов, происходит более эффективно по сравнению с неспецифическим эндоцитозом. Возможно, в случаях с полисахаридными ТН-2 Аг захват Аг происходит не только посредством неспецифического эндоцитоза, но и с помощью рецепторов.

Рис.5. Индукция образования АОК (А) и ИГОК (Б) ПВП-360, связанным с ДК.

Достоверность различий между контрольной и экспериментальными группами: р 0,001 Сравнение иммунного ответа in vitro на ПВП-10 и ПВП-360, связанные с дендритными клетками. ТН-2 Аг обычно имеют очень большой молекулярный вес, более 100 кДа [Mond, 1995]. Молекулы меньшего размера значительно менее иммуногены. Известно, однако, что ДК могут увеличивать иммуногенность небольших полимерных молекул. Мы сравнили иммуногенность ДК, нагруженных ПВП-360 и ПВП-10 (мол. вес 360 кДа и 10 кДа). Спленоциты, культивированные со свободными Аг, использовались в качестве контроля. Полученные результаты, выраженные в виде прироста числа АОК над их количеством в норме, представлены на рис.6.

% Рис.6. Относительный прирост числа АОК, индуцированный нативными ПВП-10 и ПВП-360, а также ПВП-10 и ПВП-360, связанными с ДК, Число АОК нормальных спленоцитов принято за 100% Внесение в культуру спленоцитов ПВП-10 увеличивало число АОК по сравнению с АОК спленоцитов не более, чем на 40%, в то время как при иммунизации ПВП-360 это увеличение было в 1,8 раза. В то же время при культивировании спленоцитов с ПВП-10, связанным с ДК, увеличение числа АОК оказалось, таким же, как при ПВП-360, связанным с ДК, т.е. также двукратным. Это свидетельствует о том, что связывание с ДК может увеличивать иммуногенность низкомолекулярного Аг. Механизм этого процесса пока неясен.

Активация ДК при совместной нагрузке ТН-2 Аг и ЛПС. Известно, что ЛПС является классическим неспецифическим активатором ДК, поэтому важно, было выяснить как влияет на экспрессию характеристических маркеров одновременное связывание ДК ТН-2 Аг (S3, ПВП-360) и ЛПС. Для этого ДК одновременно нагружали ТН-2 Аг в концентрации 100 мкг/млн и ЛПС E.coli в концентрации 2 мкг/млн (оптимальная концентрация установленная ранее).

Полученные результаты представлены в табл.1.

Согласно полученным данным, ЛПС вызывает сильную активацию ДК.

Это выражается в значительном увеличении экспрессии костимулирующих молекул CD80 (67% против 13% в норме) и CD86 (94% против 43% в норме).

ЛПС также увеличивает экспрессию MHC-II (среднее геометрическое флуоресценции увеличивается более чем в 2 раза, число MHC-II+ клеток 95% во всех образцах).

Табл.1. Экспрессия поверхностных маркеров ДК, при нагрузке ТН-2 Аг и ЛПС

–  –  –

ДК (ЛПС + ПВП-360) 97% 78% 68% 94% Одновременная нагрузка ДК ЛПС и S3 увеличивала экспрессию маркеров по сравнению с ненагруженными ДК еще больше: экспрессия CD80+ – 77%, CD86+ – 95% (среднее геометрическое флуоресценции увеличивается более чем в 1,5 раза). Совместная нагрузка ДК ПВП-360 и ЛПС, однако, такого эффекта не давала: экспрессия CD80 и CD86 оставалась сравнимой с таковой под действием одного ЛПС. Количество CD11+ клеток было 80% во всех образцах, независимо от ЛПС.

Взаимодействие ДК с В-1 и В-2 клетками. В предыдущих разделах были представлены опыты по индукции образования антител ТН-2 Аг, связанными с ДК в спленоцитах мышей СВА. В то же время спленоциты представляют смесь клеток, продуцентами Ат в которой являются В лимфоциты. Основной субпопуляцией В лимфоцитов в селезенке являются В-2 клетки (около 95% В-лимфоцитов). В-1 клетки составляют минорную субпопуляцию, не превышающую 2%. В составе перитонеальных клеток мышей СВА преобладают В-1 лимфоциты. Ранее было показано, что основную роль в специфическом и поликлональном иммунном ответе на ТН-2 Аг играют CD5+ В-1 клетки селезенки [Sidorova, 2003, Whitmore, 2003].

Полученные нами перитонеальные В-1 клетки экспрессировали:

CD19 95%, CD5 ~30%, CD3 5%, CD23 5%, F4/80 5%. В-2 лимфоциты характеризовались поверхностными маркерами CD19 94%; CD5 и CD3 1%;

F4/80 3% (Рис.7.).

Рис.7. Цитометрическая характеристика перитонеальных В-1 клеток (А) и В-2 клеток селезенки (Б). (По оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс – интенсивность флуоресценции) Чтобы выяснить, какая субпопуляция В клеток мышей СВА участвует в ответе на ТН-2 Аг S3, связанный с ДК, смешивали с В-1 и В-2 клетками в соотношении 1 : 5 и культивировали в полной среде в течение 4 дней.

Результаты эксперимента представлены на рис.8.

Под влиянием S3, связанным с ДК, в культурах В-1 клеток число АОК увеличивалось в 2,8 раза (с 116 ± 20 в норме до 327 ± 52 на 106 В клеток); в то же время в культурах В-2 клеток, прирост числа АОК был незначителен – на 18% (с 76 ± 11 в норме до 90 ± 14 на 106 В клеток).

Число ИГОК при совместном культивировании увеличивалось в обоих случаях; однако, прирост числа ИГОК был выше в культурах В-2 клеток – 37% (14256 ± 890 против 10370 ± 1950 на 106 В клеток), тогда как в культурах В-1 клеток – 17% (10274 ± 1360 против 8740 ± 2180 на 106 В клеток). Таким образом, данные полученными нами, подтверждают ранее сделанный вывод о ведущей роли В-1 клеток в ответе на ТН-2 Аг.

* * Рис.8. Иммунный ответ В клеток индуцированный S3, связанным с ДК, * р 0,001 Всё вышеизложенное свидетельствует о том, что ТН-2 Аг, связанные с ДК, вызывают иммунный ответ спленоцитов при непосредственном контакте с ними. При взаимодействии с ДК, нагруженными ТН-2 Аг, основной отвечающий популяцией являются В-1 клетки.

Индукция образования АОК при помощи ТН-2 Аг, связанного с xidДК. ДК, выделенные из костного мозга CBA/N мышей, нагружали Декс и культивировали с нормальными спленоцитами мышей CBA в соотношении 1 : 5 в течение 4 сут в полной питательной среде. На 4-е сутки в культурах определяли число АОК и ИГОК (Рис.9).

Рис.9. Индукция образования АОК Декс, связанным с xid-ДК, р 0,001

Полученные данные показывают, что Декс, связанный с xid-ДК, вызывает образование АОК (329 ± 25 против 132 ± 15 на 106 спленоцитов). Эти числа полностью сопоставимы с таковыми в опытах с ДК, выделенными из костного мозга СВА мышей. Очевидно, что наличие xid-мутации не влияет на способности ДК к связыванию ТН-2 Аг и стимуляции иммунного ответа на ТНАг. По-видимому, xid-мутация, функции миелоидных клеток не меняет.

ВЫВОДЫ

1. ДК, выращенные из костно-мозговых предшественников, способны связывать ТН-2 Аг.

2. Показано, что полисахаридные ТН-2 Аг, связанные с ДК, обладают иммуногенностью. При этом в культуре спленоцитов, ТН-2 Аг, связанные с ДК, вызывают более сильный и специфичный иммунный ответ, чем нативные ТН-2 Аг.

3. Поликлональная активация В клеток ТН-2 Аг в составе ДК, меньше, чем под действием нативных ТН-2 Аг.

4. Для индукции иммунного ответа на ТН-2 Аг требуется непосредственный контакт нагруженных Аг ДК и В лимфоцитов.

5. ДК, полученные из костномозговых предшественников хid-мышей, не отличаются по способности связывать ТН-2 Аг и индуцировать иммунный ответ от ДК, полученных от нормальных мышей.

6. При индукции иммунного ответа in vitro на ТН-2 Аг, связанные с ДК, основными продуцентами Ат являются В-1 лимфоциты.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор сердечно благодарит коллектив лаборатории биосинтеза иммуноглобулинов за помощь и поддержку при постановке экспериментов и написании настоящей работы.

Особо следует отметить неоценимый вклад научного руководителя проф.

Е.В. Сидоровой в обсуждение результатов и написание диссертации.

Автор выражает признательность Рубаковой Э.И., сотруднице лаборатории экспериментальной иммуногенетики ЦНИИ туберкулеза РАМН, за помощь в освоении метода получения дендритных клеток.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (Грант № 08-04-00233-а).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хоченков Дм.А. Биология дендритных клеток. // Биол. Мембраны. 2008.

Т.25. С.403–419.

2. Khochenkov D.A. Biology of dendritic cells. // Biochemistry (Moscow) Suppl. Series A: Membrane and Cell Biology. 2008. V.2. P.296–311.

3. Хоченков Дм.А. Роль дендритных клеток в иммунном ответе на Тнезависимые антигены типа 2. // Биол. Мембраны. 2010. Т.27. С.307– 313.

4. Khochenkov D.A. Role of dendritic cells in the immune response on Tindependent antigens type 2. // Biochemistry (Moscow) Suppl. Series A:

Membrane and Cell Biology. 2010. V.4. P.257–261.

5. Khochenkov D.A., Gavrilova M.V., Sidorova E.V. Role of dendritic cells in the immune response on T-independent antigens type 2. ESF Research Symposium B Cells and Protection: Back to basics. 2010. Sant Feliu de Guixols, Spain.

6. Khochenkov D.A., Gavrilova M.V., Sidorova E.V. Do dendritic cells participate in the immune response to T-independent antigens type 2. FOCIS.

2010. Boston, Massachusetts, USA.



Похожие работы:

«ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2008. №4. С. 119–123. УДК 577.112.083; 577.152.321 ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗ ASPERGILLUS NIGER И PENICILLIUM DIERCKXII А.А. Шубаков1*, А.Г. Донцов2, Т.И. Челпанова1, Е.А. Елькина1 © Институт физиологии Коми научного центра Уральского отдел...»

«Общие вопросы Юг России: экология, развитие. №4, 2013 General problems The South of Russia: ecology, development. №4, 2013 УДК 595.733 ЗООГЕОГРАФИЧЕСКОЕ РАЙОНИРОВАНИЕ СРЕДИЗЕМНОМОРЬЯ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ТЕРРИ...»

«ВОСПОМИНАНИЯ И ИНТЕРВЬЮ Юрий Александрович Орлов Воспоминания об Aнатомо-гистологическом кабинете Петроградского университета1 ПОДГОТОВКА К ПЕЧАТИ, ВСТУПИТЕЛЬНАЯ СТАТЬЯ И КОММЕНТАРИИ С.И. ФОКИНА Университет Пизы, Пиза, Италия; sifokin@mail.ru Публикуемые воспоминания Ю.А. О...»

«Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты № 08-04гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-2329.2008.4), программ Президиума РАН "Биоразнообразие и динамика генофондов" и "Происхождение и эволюция биосферы" и программы ОБН...»

«98 ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2016. Т. 26, вып. 2 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ УДК 581.9(571.651-37) М.Г. Хорева ОСОБЕННОСТИ ВИДОВОГО СОСТАВА ФЛОРЫ НИВАЛЬНО-ЭРОЗИОННОГО ЛАНДШАФТА В БЕРИНГОВСКОМ РАЙОНЕ ЧАО Обсуждаются особенности флоры нивальных и нивально-эрозионных местоположений в водосборном бассейне лагуны...»

«И.В. Челышева Развитие критического мышления и медиакомпетентности студентов в процессе анализа аудиовизуальных медиатекстов Учебное пособие для педагогических вузов по специальности 03.13.00 "Социальная педагогика", специализации 03.13.30 "Медиаобразование" Таганрог Челышева И.В. Развитие критического мышления и мед...»

«Научный совет ОБН РАН по гидробиологии и ихтиологии Программа фундаментальных исследований Президиума РАН “Биологическое разнообразие” Учреждение Российской академии наук Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН ВОПРОСЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО НОРМИРОВАНИЯ И РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ВОДОЕМ...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Тульский государственный университет В.А. Хромушин, К.Ю. Китанина, О.В. Хромушин, С.Ю. Федоров СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ АЛГЕБРАИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ КОНСТРУКТИВНОЙ ЛОГИКИ Монография Тула 2015 УДК 510.635 Авто...»

«Н.Н. Шилова зав. кафедрой коммерции Тюменской государственной архитектурностроительной академии, кандидат экономических наук, доцент МОНИТОРИНГ ВТОРИЧНЫХ РЕСУРСОВ КАК СОСТАВНОЙ ЭЛЕМЕНТ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ РЕГИОНА (НА ПРИМЕРЕ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ) Загрязнение окружающей среды отр...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.