WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 

«ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции ...»

ИНСТРУКЦИЯ

по применению тест-системы «БИГ» для определения видовой принадлежности

тканей жвачных животных методом полимеразной цепной реакции

(организация-производитель – ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва)

Тест-система «БИГ» для выявления ДНК митохондриального генома жвачных

животных рода Bos (Настоящие быки) и рода Ovis (Бараны) в биологическом материале

методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух форматах:

Формат EPh – для выявления ДНК митохондриального генома жвачных животных в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

Формат FRT – для выявления ДНК митохондриального генома жвачных животных в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Форматы и формы выпуска тест-системы.

Формат EPh Тест-система «БИГ» формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в 2 формах комплектации:

Форма 1 включает:

«ДНК-сорб-С» вариант 50 – комплект реагентов для экстракции ДНК из биологического материала, продуктов питания и кормов для животных;

«ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК митохондриального генома жвачных животных;



«ЭФ» вариант 200 – комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

Форма 2 включает:

«ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК митохондриального генома жвачных животных.

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК митохондриального генома жвачных животных и электрофоретическую детекцию.

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК митохондриального генома жвачных животных. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, электрофоретической детекции, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 1 из 23 Формат FRT.

Тест-система «БИГ» формат FRT, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в 2 формах комплектации:

Форма 1 включает:

«ДНК-сорб-C» вариант 50 – комплект реагентов для экстракции ДНК из биологического материала, продуктов питания и кормов для животных;

«ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для амплификации ДНК митохондриального генома жвачных животных с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма 2 включает:

«ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F – комплект реагентов для амплификации ДНК митохондриального генома жвачных животных с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала и амплификацию ДНК митохондриального генома жвачных животных с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК митохондриального генома жвачных животных с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

–  –  –

II. ПРИНЦИП МЕТОДА

Формат EPh. Метод обнаружения ДНК митохондриального генома жвачных животных основан на экстракции ДНК из биологического материала совместно с ДНК экзогенного неконкурентного внутреннего контрольного образца (ВКО) и проведении Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 3 из 23 амплификации полученной ДНК. Детекция продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле.

Формат FRT. Метод обнаружения ДНК митохондриального генома жвачных животных основан на экстракции ДНК из биологического материала совместно с ДНК экзогенного неконкурентного внутреннего контрольного образца (ВКО) и проведении амплификации полученной ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени». Результат амплификации ДНК Bos spp.

регистрируется на канале JOE/Yellow, результат амплификации ДНК Ovis spp. регистрируется на канале флуоресценции FAM/Green, результат амплификации ДНК экзогенного ВКО регистрируется на канале флуоресценции ROX/Orange.

Использование экзогенного ВКО позволяет контролировать основные этапы ПЦР-анализа (экстракцию ДНК и проведение амплификации ДНК).

–  –  –

Аналитическая специфичность Отсутствует положительная реакция в тестах с ДНК животных, не принадлежащих к родам Bos и Ovis.

IV. ПОРЯДОК ОТБОРА И ПОДГОТОВКИ ПРОБ

Тест-система «БИГ» предназначена для выявления ДНК митохондриального генома животных рода Bos и рода Ovis в кормах для животных и продуктах питания:

кормах, подвергшихся термической обработке (рыбной муке и др.);

комбикормах для племенной птицы;

сухих и консервированных кормах для животных;

сырых мясных продуктах (частях туши, фарше и т.д.) и в мясных продуктах, подвергшихся кулинарной обработке.

Взятие, транспортирование и хранение материала для исследования.

Пробы рыбной муки, сухого корма для животных, комбикорма, находящихся в 7.1 мешках или небольших насыпях на складе, отбирают по ГОСТ 13496.0 «Комбикорма, сырье. Методы отбора проб».

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 4 из 23 Консервированные корма отбирают по ГОСТ 8756.0 «Продукты пищевые 7.2 консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию».

Каждый образец отбирают отдельным набором инструментов.

7.3 Образцы сырья, продуктов питания и кормов для животных транспортируют и хранят 7.4 согласно условиям хранения, указанным производителем. Образцы скоропортящихся продуктов рекомендуется хранить при температуре не выше минус 16 C. Длительность транспортирования не должна превышать срока годности продукта.

Подготовка исследуемого материала.

Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые 8.1 пробирки, стерильные инструменты – пинцеты, скальпели, ножницы. Гомогенизацию образцов проводят с использованием стерильных ступок и пестиков или автоматических гомогенизаторов.

Пробы плотных продуктов, сухих гранулированных и сыпучих продуктов отбирают 8.2 по 5 – 10 г и растирают до гомогенного состояния.

Пробу мясных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 1– 8.3 2 г, измельчают ножницами, затем растирают до гомогенного состояния.

V. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА

Формат EPh: ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).

Формат FRT: ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

ЗОНА 1 – для экстракции ДНК из исследуемого материала:

9.1 ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).

твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).

вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», Россия).

микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, MiniSpin, Eppendorf, Германия).

центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

отдельный набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).





одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, Axygen, США).

одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл (например, Axygen, США).

штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, Axygen, США).

холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

емкость для сброса наконечников.

комплект средств для обработки рабочего места.

ЗОНА 2 – для проведения амплификации:

9.2 Формат EPh: амплификатор для пробирок 0,5 мл (например, «Терцик», «ДНКТехнология», Россия, или эквивалентный); для пробирок 0,2 мл (например, GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), США, или Maxygene, (Axygen), США или эквивалентный).

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 5 из 23 Формат FRT: амплификатор (например, RotorGene 3000/6000, Corbett Research, Австралия, Rotor-Gene Q, QIAGEN GmbH, Германия или iCycler iQ или iQ5, Bio-Rad, США).

ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).

центрифуга/вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 мкл (например, Axygen, США).

одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 (0,5) мл (например, Axygen, США).

штативы для наконечников (например, Axygen, США) и пробирок (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

емкость для сброса наконечников.

комплект средств для обработки рабочего места.

9.3 Формат EPh: ЗОНА 3 – для детекции продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле:

камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например, SE-2, «Хеликон», Россия).

источник постоянного тока с напряжением 150–460 В (например, «Эльф-4», «ДНКТехнология», Россия).

ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например, «Биоком», Латвия).

видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов (например, «Биотест-1», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия; BioRad, США).

аквадистиллятор.

холодильник от 2 до 8 °С.

микроволновая печь для плавления агарозы.

колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления агарозы на 250 мл.

мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).

штатив для пробирок на 0,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

отдельный дозатор объемом 10–40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, Axygen, США).

пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

Порядок работы.

10.1 ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция ДНК из исследуемого материала.

Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 °С до 8 °С) прогреть при температуре 64 °С до полного растворения кристаллов. Проверить сорбент – при отстаивании он должен занимать половину объема суспензии.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл (включая отрицательный контроль экстракции).

В пробирки, предназначенные для исследуемых проб, внести по 10-30 мг исследуемых проб. В пробирку отрицательного контроля экстракции ДНК (ОК) внести 100 мкл ОКО.

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 6 из 23 Отдельными наконечниками с фильтром внести в каждую пробирку по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента. Тщательно перемешать содержимое пробирок.

Инкубировать пробирки при температуре 64 °С в течение 1 ч, периодически встряхивая на вортексе (не менее 5 раз).

Осадить нерастворенные частицы образцов центрифугированием при 12–14 тыс об/мин в течение 5 мин.

Надосадочную жидкость в объеме 200–350 мкл очень аккуратно (так, чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира) отобрать отдельными наконечниками с фильтром и перенести в новые пробирки.

Формат EPh: Отдельными наконечниками с фильтром внести в каждую пробирку по 20 мкл ВКО комплексного. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе.

Формат FRT: Отдельными наконечниками с фильтром внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО-FL. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе.

Пробы прогреть 5 мин при температуре 64 °С. Еще раз перемешать и процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для сброса капель с крышки пробирки.

Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, оставить в штативе на 10–15 мин, перемешивая через каждые 2 мин.

Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 1 мин. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 1 мин. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 1 мин при 10-12 тыс об/мин на микроцентрифуге. Отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, отобрать надосадочную жидкость полностью.

Поместить пробирки в термостат при температуре 64 °С на 5–10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 64 °С на 5–8 мин, периодически (1 раз в мин) встряхивая на вортексе.

Процентрифугировать пробирки при 12–14 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК (ДНК-проба).

Указанный материал готов к постановке ПЦР.

Очищенную ДНК можно хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 С.

10.2 ЭТАП 2 (зона 2). Проведение амплификации.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант 50 R и электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле с использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200 см. приложение 1.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант FRT-50 F см. приложения 2, 3.

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 7 из 23

VI. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Работа должна проводиться согласно правилам МСХиП РФ 27.01.1997г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения», утвержденным Департаментом ветеринарии.

Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое. Запрещается перемещение персонала из помещения для электрофореза в другие рабочие помещения лаборатории.

Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реактивами.

Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром.

Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

Посуда (ступки и пестики) и металлические инструменты (скальпели, ножницы, пинцеты), использованные для гомогенизации, выдерживаются в растворе дезинфицирующего средства (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты в течение одного часа или в растворе хромовой смеси в течение 30 мин), моется водопроводной водой с поверхностно-активными моющими средствами и, после отмывания в проточной и деионизованной воде, высушиваются в сухожаровом шкафу в течение 4 часов при температуре 180 С.

Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также использованные реактивы (включая буфер и гели) следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

П. п. 18 выполняется только для формата EPh При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или защитной маской.

Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 8 из 23 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Формат EPh

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И УЧЕТ

РЕЗУЛЬТАТОВ

I. ЭТАП 2 (зона № 2). Проведение амплификации.

В комплекте реагентов для амплификации «ПЦР-комплект» вариант 50 R применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при температуре 95 °С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.

Общий объем реакции – 25 мкл, объем пробы ДНК – 10 мкл.

Порядок работы:

А. Подготовка пробирок для амплификации Подготовить необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R БиГ и ПЦРсмесью-1-R ВКО для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R БиГ или ПЦР-смесью-1-R ВКО.

Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не добавлять.

В подготовленные пробирки под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с фильтрами, внести по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контроля этапа экстракции.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К–) – вместо пробы ДНК внести в пробирку с ПЦРсмесью-1-R БиГ и в пробирку с ПЦР-смесью-1-R ВКО 10 мкл К–;

б) положительный контроль (К+Bos) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R БиГ 10 мкл К+ Bos taurus;

в) положительный контроль (К+Ovis) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R БиГ 10 мкл К+ Ovis aries;

г) положительный контроль (К+ВКО) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-1-R ВКО 10 мкл ВКО комплексного, разведенного в 10 раз в К–.

Б. Проведение амплификации Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1). Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (при использовании амплификатора GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems)), поставить программу на паузу, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1–3 с).

–  –  –

II. ЭТАП 3 (зона № 3). Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле.

Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2.

А. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.

Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трисборатного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.

Бромид этидия – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке (см. раздел «Дезактивация буфера и гелей»).

Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл готового рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой – 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65–70 С.

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 10 из 23 Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры.

Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга.

Толщина геля должна быть около 0,6 см.

После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре) осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.

Б. Порядок работы Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать из-под слоя масла по 10–15 мкл проб и внести в лунки геля (необходимо использовать новый наконечник для каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.

Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры SE-2 («Хеликон», Россия) и источника питания «Эльф-4» (ЗАО «НПФ ДНК Технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза – 18–20 мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см.

По завершении времени электрофореза (краситель при этом пройдет примерно половину длины геля – 1,5 см) выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных.

ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены маской или стеклянной пластиной!

В. Дезактивация буфера и гелей.

Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также использованные реактивы (включая буфер и гели) следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

III. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

Длина амплифицированных специфических фрагментов ДНК:

– 350 п.н.

Ovis spp.

– 680 п.н.

Bos spp.

ВКО комплексный – 750 п.н.

В образце обнаружена ДНК Ovis spp., если в дорожке, соответствующей этой пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R БиГ присутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 350 п.н. большей или меньшей интенсивности, независимо от наличия полосы внутреннего контроля на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО.

В образце обнаружена ДНК Bos spp., если в дорожке, соответствующей этой пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R БиГ присутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 680 п.н. большей или меньшей интенсивности, независимо от наличия полосы внутреннего контроля на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО.

В образце не обнаружены ДНК Ovis spp. и Bos spp., если в дорожке, соответствующей этой пробе на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R БиГ отсутствуют специфические светящиеся полосы на уровне 350 и 680 п.н. и присутствует полоса внутреннего контроля на уровне 750 п.н. на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО.

Если в дорожке какого-либо образца отсутствуют все полосы (350, 680 и 750 п.н.), то Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 11 из 23 результат анализа по данной пробе считается невалидным. Требуется повторно провести исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК. Допускается отсутствие полосы внутреннего контроля 750 п.н. в отрицательном контроле экстракции (ОК).

–  –  –

Если для положительного контроля ПЦР (К+Ovis) отсутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 350 п.н., необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК Ovis spp.

Если для положительного контроля ПЦР (К+Bovis) отсутствует специфическая светящаяся полоса на уровне 680 п.н., необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК Bos spp.

Появление специфической полосы (350 или 680 п.н.) на электрофореграмме с ПЦРсмесью-1-R БиГ в любом из отрицательных контрольных образцов (ОК, К–) или 750 п.н. на электрофореграмме с ПЦР-смесью-1-R ВКО в отрицательном контроле ПЦР (К–) указывает на контаминацию реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам с соответствующей ПЦР-смесью-1-R считаются недействительными. Требуется повторить ПЦР-исследование всех проб, начиная с этапа экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 12 из 23 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Формат FRT

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ

АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ

Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия).

А. Подготовка пробирок для амплификации Общий объем реакции – 25 мкл, объем пробы ДНК – 10 мкл.

- Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-FL БиГ разморозить, перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

- Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке 10*(N+1) мкл ПЦР-смесиFL БиГ, 5*(N+1) мкл ПЦР-буфера-E и 0,5*(N+1) мкл полимеразы (TaqF).

- Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в пробирки на 0,2 мл.

- Используя наконечник с фильтром в подготовленные пробирки добавить по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контроля этапа экстракции. (Необходимо избегать попадания сорбента универсального в реакционную смесь).

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К–) – внести в пробирку 10 мкл К–.

б) положительный контроль (К+Bos) – внести в пробирку 10 мкл К+ Bos taurus;

в) положительный контроль (К+Ovis) – внести в пробирку 10 мкл К+ Ovis aries;

г) положительный контроль амплификации (К+STI) – внести 10 мкл К+ STI-88.

Б. Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ротор амплификатора Rotor-Gene (ячейки ротора пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения проб в амплификаторе). Запрограммировать прибор.

Программирование амплификатора:

Для работы с прибором Rotor-Gene 3000 следует использовать программу Rotor-Gene версии 6, с прибором Rotor-Gene 6000 и Rotor-Gene Q – программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build 67) или выше.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора Rotor-Gene 3000 / для англоязычной версии программы Rotor-Gene 6000 (Rotor-Gene Q) / для русскоязычной версии программы Rotor-Gene 6000.

- Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.

- Выбрать тип ротора. Поставить отметку в окошке рядом с надписью No Domed 0.2 ml Tubes/Locking ring attached/Кольцо закреплено.

- Нажать кнопку Next/Далее.

- Выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции – 25 мкл. Для Rotor-Gene 6000 должно быть отмечено окошко 15 l oil layer volume/15 L объем масла/воска.

- Нажать кнопку Next/Далее.

- В верхней части окна нажать кнопку Edit profile/Редактор профиля.

- Задать следующие параметры эксперимента:

–  –  –

- Нажать дважды кнопку OK/Да.

- В нижней части окна нажать кнопку Calibrate/Gain Optimisation/Опт.уровня сигн..

В открывшемся окне нажать кнопку Calibrate Acquiring/Optimise Acquiring/Опт. Детекмых, выбрать функцию: Perform Calibration Before 1st Acquisition/Perform Optimisation Before 1st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции. Для красителей JOE/Yellow и ROX/Orange установить параметры Min Reading/Миним. Сигнал – 5Fl и Max Reading/Максим. Сигнал – 10Fl. Окно закрыть, нажав кнопку Close/Закрыть. Для красителя FAM/Green установить параметры Min Reading/Миним. Сигнал – 15Fl и Max Reading/Максим. Сигнал – 20Fl. Окно закрыть, нажав кнопку Close/Закрыть.

- Нажать кнопку Next/Далее, запустить амплификацию кнопкой Start run/Старт.

- Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку Edit samples/Правка образцов (в нижней правой части основного окна). Все исследуемые образцы и контроли обозначить как Unknown/Образец.

В. Анализ результатов амплификации ВКО (канал ROX/Orange):

- Нажать в меню кнопку выбрать режим анализа Analysis/Анализ, Quantitation/Количественный, нажать кнопку Cycling A. ROX/Cycling A. Orange, Show/Показать.

- Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

- В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должна быть активирована кнопка Dynamic tube/Динамич.фон и Slope Correct/Коррект.уклона.

- В меню основного окна More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов.

- Установить значение NTC threshold /Порог Фона – ПФ (NTC) – 10 %.

- Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала видна кнопка Log scale/Лог.шкала).

- В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.1.

- В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты) появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации специфического участка ДНК Bos spp.

(JOE/Yellow):

- Нажать в меню кнопку выбрать режим анализа Analysis/Анализ, Quantitation/Количественный, нажать кнопку Cycling A. JOE/Cycling A. Yellow, Show/Показать.

- Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

- В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должна быть Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 14 из 23 активирована кнопка Dynamic tube/Динамич.фон и Slope Correct/Коррект.уклона.

- В меню основного окна More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов.

- Установить значение NTC threshold /Порог Фона – ПФ (NTC) – 10 %.

- Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала видна кнопка Log scale/Лог.шкала).

- В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.1.

- В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты) появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации ДНК Ovis spp. (канал FAM/Green):

- Нажать в меню кнопку выбрать режим анализа Analysis/Анализ, Quantitation/Количественный, нажать кнопку Cycling A. FAM/Cycling A. Green, Show/Показать.

- Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

- В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ должна быть активирована кнопка Dynamic tube/Динамич.фон и Slope Correct/Коррект.уклона.

- В меню основного окна More settings/Outlier Removal/Устранение выбросов.

- Установить значение NTC threshold /Порог Фона – ПФ (NTC) – 10 %.

- Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала видна кнопка Log scale/Лог.шкала).

- В меню CT Calculation/Вычисление CT (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.05.

- В таблице результатов (окно Quant. Results/Количественные Результаты) появятся значения Ct.

Г. Учет результатов Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на нужном уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).

В образце обнаружена ДНК Bos spp., если значение Ct на канале JOE /Yellow менее 37.

В образце обнаружена ДНК Ovis spp., если значение Ct на канале FAM /Green менее 37.

В образце не обнаружены ДНК Bos spp. и Ovis spp., если по каналам FAM/Green и JOE/Yellow для него значение Сt отсутствует или превышает 37, а по каналу ROX/Orange для него определено значение Ct, не превышающее 37.

Результат анализа невалидный, если для данной пробы не определено (отсутствует) значение порогового цикла Ct как по каналу ROX/Orange, так и по каналам FAM/Green и JOE/Yellow, или получено значение Сt по каналу ROX/Orange более 37. В этом случае требуется повторно провести ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

–  –  –

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 16 из 23 ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Формат FRT

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ

АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРОВ

iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США) А. Подготовка пробирок для амплификации Общий объем реакции – 25 мкл, объем пробы ДНК – 10 мкл.

Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-FL БиГ, перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке 10*(N+1) мкл ПЦР-смесиFL БиГ, 5*(N+1) мкл ПЦР-буфера-E и 0,5*(N+1) мкл полимеразы (TaqF).

Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в пробирки на 0,2 мл.

Используя наконечник с фильтром, в подготовленные пробирки добавить по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контроля этапа экстракции. (При работе с комплектом реагентов «ДНК-сорб-С» необходимо избегать попадания сорбента универсального в реакционную смесь).

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К–) – внести в пробирку 10 мкл К–.

б) положительный контроль (К+Bos) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-FL БиГ 10 мкл К+ Bos taurus;

в) положительный контроль (К+Ovis) – внести в пробирку с ПЦР-смесью-FL БиГ 10 мкл К+ Ovis aries;

г) положительный контроль амплификации (К+STI) – внести в пробирку с ПЦРсмесью-FL БиГ 10 мкл К+ STI-88.

Б. Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.

Открыть программу iCycler.

Задать схему планшета – расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала.

Для прибора iCycler iQ5 в окне Selected Plate Setup модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме Whole Plate loading. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM, JOE и ROX. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.

Для прибора iCycler iQ в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM, JOE и ROX. Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением.pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана).

Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.

–  –  –

Для прибора iCycler iQ5 в окне Selected Protocol модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы протоколов сохраняются в папке Users).

Для прибора iCycler iQ выбрать опцию Edit Protocol модуля Workshop. Задать параметры амплификации, а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (BIG.tmo) и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.

Поместить предварительно подготовленные для проведения ПЦР пробирки в модуль в соответствии с заданной схемой.

Запустить выполнение выбранной программы BIG с заданной схемой планшета.

Для прибора iCycler iQ5 перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

Для прибора iCycler iQ перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source.

Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

После окончания программы приступить к анализу результатов.

В. Анализ результатов.

–  –  –

Если для положительного контроля ПЦР (К+ovis) значение Сt отсутствует или превышает 35, необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК Ovis spp.

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 19 из 23 Если для положительного контроля ПЦР (К+Bos) значение Сt отсутствует или превышает 35, необходимо повторить амплификацию для всех образцов, в которых не обнаружена ДНК Bos spp.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного образца (на канале FAM или JOE) и для отрицательного контроля ПЦР (К–) (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

–  –  –

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 22 из 23 Проведение ПЦР- п. 9 для зоны 2 в перечисление амплификаторов добавлен 30.06.16 анализа прибор Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH, Германия) ChA Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-14-FRT(RG,iQ)-K / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 23 из 23





Похожие работы:

«ПРОТОКОЛ заседания Ученого совета Биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета от 13 марта 2014 г. №4 Председатель Ученого совета: декан, профессор А.Д. Харазо...»

«Таныгина Елена Сергеевна ВОЗДЕЙСТВИЕ БИГУАНИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ ПРИ КАРДИОВАСКУЛЯРНОЙ ПАТОЛОГИИ Специальность 03.01.04. – Биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель доктор биол...»

«Э КОЛ О Г И Я РЕЧНЫХ Б АС С Е Й Н О В KA N ECOLOGY OF RIVER`S BASINS III Международная научно-практическая конференция The Third International Scientific Conference Владимир Vladimir ЭКОЛОГИЯ РЕЧНЫХ БАССЕЙНОВ ЭРБ – 20...»

«ГБУ "Республиканская имущественная казна" (специализированная организация) руководствуясь ст. 448 Гражданского кодекса Российской Федерации, ст.18 Федерального закона от 14.11.2002г. № 161-ФЗ "О государственных и муниципальн...»

«ТИТОВ СЕРГЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА (NICOTIANA TABACUM L.), ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ АНТИСМЫСЛОВОЙ СУПРЕССОР ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ 03.00.15 ГЕНЕТИКА АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическ...»

«РОЛЬ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ НИШИ В ФОРМИРОВАНИИ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ (НА ПРИМЕРЕ ВИДОВ СЕМ. И CANIDAE MUSTELIDAE ТВЕРСКОЙ ОБЛАСТИ) П.Н. Кораблёв 1, н.п. КораБЛёв 2, м.п. Кораблёв з,I, А.В. 3иновьев 4, ИЛ. Туманов, Н.А. Седова6 I ФГБУ Центрально-Лесноil государственный заповедник. Тверска...»

«ТЕХНОЛОГИЯ ПРОВЕДЕНИЯ СЕРТИФИКАЦИИ СИСТЕМ МЕНЕДЖМЕНТА Сертификация систем менеджмента в системе сертификации проводится в соответствии с действующим законодательством, требованиями стандартов, и регламентирующих документов системы сертификаци...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, 41, 6, 2007 УДК 574.34: 595.121 СУКЦЕССИОННЫЕ ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ ЧИСЛЕННОСТИ И СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИИ ЦЕСТОДЫ PROTEOCEPHALUS LONGICOLLIS (ZEDER, 1800) (CESTODA: PROTEOCEPHALIDAE) © Л. В. Аникиева, Е. П. Иешко, О. П. Стерлиг...»

«Выпуск от 25.05.12 ИНФОРМАЦИОННОЕ АГЕНТСТВО REX Выпуск от 25.05.2012 Информационное агентство REX Телефон: +7 (495) 972-49-27 Сайт: http://www.iarex.ru Email: info@iarex.ru Выпуск от 25.05.12 Содержание: Материалы агентства • На фес...»

«БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ УДК 614 : 616.4 Иванова Н. В., Кузьмина Т. В. ОСНОВНЫЕ ТЕНДЕНЦИИ ОПТИМИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 2 ТИПА Введение Сахарный диабет (СД) — од...»

«Стрельцова Дарья Александровна ИЗУЧЕНИЕ НОВОЙ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ОКСИДА АЗОТА – РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА aidB Ada-РЕГУЛОНА Escherichia coli 03.01.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва — 2013 Работа выполнена в Фед...»

«ВЕСТНИК ЮГОРСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА 2016 г. Выпуск 1 (40). С. 130–138 УДК 101 ЖИЗНЬ КАК КАТЕГОРИЯ ГУМАНИТАРНЫХ НАУК Т. В. Козырева Категория "жизнь" меняет свое содержание в зависимости от област...»

«Паразиты растений УДК 632.934:1/5.03 К ВОПРОСУ ИЗУЧЕНИЯ ЭПИФИТОТИЙНОЙ ОБСТАНОВКИ НА ПЛОДОВЫХ И ЯГОДНЫХ КУЛЬТУРАХ В ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РФ Н.Д. РОМАНЕНКО доктор биологических наук С.Б. ТАБОЛИН кандидат биологических наук Центр пар...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.