WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 

«Тест-система «БРУ-КОМ» для выявления ДНК микроорганизмов рода Brucella в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух ...»

ИНСТРУКЦИЯ

по применению тест-системы «БРУ-КОМ» для выявления возбудителя бруцеллеза

методом полимеразной цепной реакции

(организация-производитель - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва)

Тест-система «БРУ-КОМ» для выявления ДНК микроорганизмов рода Brucella в

биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в

двух форматах:

Формат EPh – для выявления ДНК микроорганизмов рода Brucella в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

Формат FRT – для выявления ДНК микроорганизмов рода Brucella в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационнофлуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Форматы и формы выпуска тест- системы.

1.

Формат EPh Тест-система «БРУ-КОМ» формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в двух формах комплектации:

Форма 1 включает:

- «ДНК-сорб-В» вариант 50 – комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

- «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella;

- «ЭФ» вариант 200 – комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.



Форма 2 включает:

- «ПЦР-комплект» вариант 50 R – комплект реагентов для амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella.

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала, амплификацию ДНК микроорганизмов рода Brucella и электрофоретическую детекцию.

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, электрофоретической детекции, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Формат FRT.

Тест-система «БРУ-КОМ» формат FRT, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в двух формах комплектации:

Форма 1 включает:

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 1 из 19 «ДНК-сорб-В» вариант 50 – комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

- «ПЦР-комплект» вариант FRT – комплект реагентов для амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»;

Форма 2 включает:

- «ПЦР-комплект» вариант FRT – комплект реагентов для амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала и амплификацию ДНК микроорганизмов рода Brucella с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

–  –  –

4. Срок годности тест-системы – 12 месяцев с даты изготовления.

II. ПРИНЦИП ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ

5. В основе метода лежит многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента.

В данной тест-системе используется неконкурентный внутренний стандарт (фрагмент ДНК фага ), позволяющий контролировать эффективность протекания всего процесса для каждой исследуемой пробы.

III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тест-система предназначена для выявления ДНК возбудителей бруцеллеза 6.

(микроорганизмов рода Brucella: B.melitensis, B.abortus, B.suis, B.ovis, B.canis) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

6.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

6.2. Материал от каждого животного отбирают отдельным инструментом.

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 3 из 19

6.3. Для исследования используют следующий клинический материал:

содержимое брюшной полости и желудка, селезенка, печень абортированного плода;

плацента и плодовые оболочки от абортировавших животных;

содержимое бурс, гигром;

кровь и молоко от абортировавших животных и (или) от животных, в сыворотке которых обнаружены агглютинины и (или) комплементсвязывающие антитела.

7. Отбор материала для исследования.

7.1. Жидкости (кроме крови) для исследования отбирают в объеме 10-20 мл, из тканей и органов вырезают кусочки размером 111 см (при невозможности толщина кусочков может быть меньше). Лимфоузлы берут целиком.

Формат EPh.

Цельную кровь в объеме 5-10 мл берут в пробирки с предварительно добавленным антикоагулянтом (3 % раствор ЭДТА из расчета 10:1).

Формат FRT.

Цельную кровь берут в пробирки с 3 % ЭДТА из расчета 10:1.

7.3. В случае убоя животных для исследования отбирают парные лимфатические узлы с обеих сторон туши целиком (парааортальные, надвыменные, паховые, тазовые) и кусочки паренхиматозных органов (печень, селезенка), от самцов с признаками орхита или эпидидимита отбирают семенники с придатками.

7.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при температуре от 2 до 8 °С. Допускается хранение материала при температуре не выше минус 16 °С в течение 30 дней (кроме крови).

8. Подготовка исследуемого материала.

8.1. Пробы исследуемых жидкостей, кроме крови, в объеме 10 мл (при необходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора), центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 мл материала и повторяют центрифугирование. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 100 мкл суспензии используют для экстракции ДНК.

8.2. Пробы цельной крови, консервированной ЭДТА, синовиальной жидкости, пунктаты из лимфоузлов, содержимое бурс и гигром, культуры микроорганизмов используют для экстракции ДНК без предварительной подготовки.

8.3. Пробы паренхиматозных органов, семенников, плодовых оболочек, плаценты (каждую отдельно) размером 1х1х1cм, а лимфатические узлы целиком, тщательно растирают в отдельных фарфоровых ступках с пестиками или в стеклянных гомогенизаторах, добавляют 1 мл стерильного физиологического раствора (т.е.

примерно равный объем) и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин, затем верхнюю фазу переносят в пробирки вместимостью 1,5 мл и 100 мкл ее используют для экстракции ДНК.

IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР

Формат EPh: ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).

9.

Формат FRT: ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

9.1. ЗОНА 1 – для экстракции ДНК из исследуемого материала:

ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия, класс биологической безопасности II тип А).

твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).





Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 4 из 19 вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).

микроцентрифуга для микропробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).

вортекс (например «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, «Axygen», США).

одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).

штативы для микропробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).

холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 С.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

емкость с дезинфицирующим раствором.

ЗОНА 2 – для проведения амплификации ДНК:

Формат EPh: амплификатор (например «Терцик», «ДНК-технология»).

Формат FRT: амплификатор (например «RotorGene 3000/6000», «Corbett Research», Австралия «Rotor-Gene Q», «QIAGEN GmbH», Германия или «iQ iCycler», «iQ5», «BioRad», США).

ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).

набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).

одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, «Axygen», США).

штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 С.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

Формат EPh: ЗОНА 3 – для электрофоретического анализа продуктов ПЦР:

камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например, «SE-2», «Хеликон», Россия).

источник постоянного тока с напряжением 150-460 В (например, «Эльф-4», «ДНКТехнология», Россия).

ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например, «Биоком», Россия).

видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов и передачи изображения «Биотест-1», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии (например, Роспотребнадзора, Россия; «BioRad», США).

аквадистиллятор.

холодильник от 2 до 8 °С для хранения продуктов амплификации.

микроволновая печь для плавления агарозы.

колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления агарозы на 250 мл.

мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 21400-75).

штатив для микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 5 из 19 отдельный механический или электронный дозатор переменного объема 10-40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, «Axygen», США).

пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

10. Порядок работы.

10.1. ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция ДНК из исследуемого материала.

Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 60-65 °С до полного растворения кристаллов.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок (включая отрицательный и положительный контроли экстракции).

Формат EPh: внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО Brucella spp. и по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.

Формат FRT: внести в каждую пробирку по 10 мкл ВКО STI-704 и по 300 мкл лизирующего раствора. Промаркировать пробирки.

В пробирки с лизирующим раствором и ВКО внести по 100 мкл пробы, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля экстракции (В–) внести 100 мкл ОКО.

Пробы тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при температуре 65 °С.

Процентрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, процентрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах и использовать для экстракции ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.

Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.

Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

Повторить процедуру отмывки раствором для отмывки 2, удалить надосадочную жидкость полностью.

Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе.

Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.

Процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 °С.

10.2. ЭТАП 2 (зона 2). Проведение ПЦР-амплификации.

Общий объем реакции – 25 мкл, объем ДНК-пробы – 10 мкл.

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 6 из 19 В комплекте реагентов для амплификации «ПЦР-комплект» применяется «горячий старт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит только при 95 °С, что значительно снижает количество неспецифически затравленных реакций.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант 50R и электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле с использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200 см. Приложение 1.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант FRT и приборов «Rotor-Gene» 3000/6000, «Rotor-Gene Q»см. Приложение 2.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант FRT и прибора «iQ iCycler»/«iQ5» см. Приложение 3.

VI. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

11. Все работы по сбору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала осуществлять в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.

1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».

12. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для дозаторов с аэрозольным барьером.

Одноразовую пластиковую посуду необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2 % раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

13. Формат EPh: анализ проводится в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), согласно МСХиП РФ 27.01.1997 г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующий метод полимеразной цепной реакции.

Основные положения», утвержденные Департаментом ветеринарии.

Формат FRT: анализ проводится в два этапа в двух отдельных помещениях (зонах), согласно МСХиП РФ 27.01.1997 г. № 13-7-2/840 «Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующий метод полимеразной цепной реакции.

Основные положения», утвержденные Департаментом ветеринарии.

14. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое. Сотрудники, работающие в помещении для детекции продуктов амплификации (зона 3), не должны посещать помещения для обработки клинического материала (зона 1) и проведения ПЦР (зона 2). Смена верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при выходе из помещения для электрофоретического анализа.

15. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, должны обязательно до начала и после окончания работ облучаться ультрафиолетовым светом.

16. Обеззараживание биоматериалов и реагентов проводят для каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду, колбы-ловушки вакуумных отсасывателей на 20-24 ч в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2% раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

17. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз.

18. Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать одноразовые перчатки.

19. Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 7 из 19 Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).

–  –  –

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ.

I.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R Brucella spp. для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R Brucella spp.

Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). При использовании амплификатора с термостатируемой крышкой минеральное масло можно не добавлять.

В подготовленные для ПЦР пробирки внести по 10 мкл ДНК, исследуемых образцов или контролей этапа экстракции.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К-) – вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.

б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК Brucella.

в) внутренний контроль (ВК+) – внести в пробирку 10 мкл ВКО Brucella spp.

разведенного в 10 раз ДНК-буфером.

Б. Проведение амплификации.

Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 1, 2). Когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 С, поставить программу на паузу, поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

Таблица 1 Программа для амплификации ДНК микроорганизмов рода Brucella

–  –  –

ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

II.

В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ (ЭТАП 3, проводится в зоне 3).

Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2.

А. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.

Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трисборатного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.

ВНИМАНИЕ! Бромид этидия – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке (см. раздел «Дезактивация буфера и гелей»).

Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой – 1,5 мин.

Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до 65-70 С.

Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры.

Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга.

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 10 из 19 Толщина геля должна быть около 0,6 см.

После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.

Б. Порядок работы.

Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать изпод слоя масла по 10-15 мкл проб и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК.

Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры «SE-2»

(«Хеликон», Россия) и источника питания «Эльф-4» («ДНК-Технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза

– 18-20 мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см.

По завершении времени электрофореза (краситель при этом пройдет примерно половину длины геля – 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных.

ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены маской или стеклянной пластиной!

В. Дезактивация буфера и гелей.

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

III. УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК (см. табл. 3).

Длина амплифицированных специфических фрагментов ДНК:

Микроорганизмов рода Brucella – 460 п.н.

Внутреннего контрольного образца – 770 п.н.

Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов амплификации положительных и отрицательных контролей (см. табл. 2) Таблица 3 Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-анализа Специфическая полоса на Контролируемый электрофореграмме Контроль этап ПЦР-анализа полоса 460 п.н. полоса 770 п.н.

В– Экстракция ДНК Нет Есть К- ПЦР Нет Нет К+ ПЦР Нет Есть ВК+ ПЦР Нет Есть В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа экстракции ДНК (В–), должна быть только полоса внутреннего контроля на уровне 770 п.н.

В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), должна быть только полоса положительного контроля – 460 п.н., полоса внутреннего контроля Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 11 из 19 770 п.н. должна отсутствовать. Возможно присутствие полос праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.

В дорожке, соответствующей положительному контролю амплификации ВКО (ВК+), должна быть только полоса внутреннего контроля 770 п.н. Возможно присутствие полос праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.

В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа ПЦР (К–), не должно быть никаких полос, за исключением возможных праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н.

Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 460 п.н. большей или меньшей интенсивности независимо от наличия полосы внутреннего контроля. Полоса внутреннего контроля может отсутствовать в пробах с высокой концентрацией ДНК микроорганизмов рода Brucella.

Отрицательными считаются образцы, в дорожках которых отсутствует специфическая полоса 460 п.н. и присутствует полоса внутреннего контроля 770 п.н.

большей или меньшей интенсивности (за исключением отрицательного контроля этапа ПЦР

– К–).

Кроме полос на уровне 460 или 770 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар.

Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:

если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в таблице 3, то соответствующий этап анализа следует переделать.

если в дорожках, соответствующих отрицательным контролям (В– и «К–) или положительному контролю амплификации ВКО («ВК+») выявляется специфическая полоса 460 п.н., значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб с первого этапа проведения анализа (экстракция ДНК из клинического материала), а также принять меры по выявлению источника контаминации.

если в дорожке какой-либо из исследуемых проб отсутствуют обе полосы, и 460 п.н. и 770 п.н. Результат анализа по данной пробе считается недействительным, необходимо повторить исследование этой пробы с этапа экстракции ДНК. Возможная причина:

ошибка в процедуре подготовки исследуемого материала, приведшая к потере ДНК или ингибированию ПЦР.

в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 12 из 19 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Формат FRT.

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия) и «Rotor-Gene Q» («QIAGEN GmbH», Германия).

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Brucella spp.

для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 7 мкл ПЦР-смеси-2-FL, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Brucella spp.

В подготовленные для ПЦР пробирки внести по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контролей этапа экстракции.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К–) – вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.

б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК Brucella.

в) внутренний контроль (ВК+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО STI-88.

Б. Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала.

Поместить пробирки в карусель амплификатора Rotor-Gene.

Запрограммировать прибор.

Программирование амплификатора.

Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу RotorGene версии 6, с приборами «Rotor-Gene» 6000 и «Rotor-Gene Q» – программу RotorGene 6000 версии 1.7 (build 67) или выше.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene»

3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 /Q / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000/Q.

Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.

В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)». Нажать кнопку «New»/«Новый».

Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окошке рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».

Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции – 25 мкл. Для Rotor-Gene 6000 должно быть отмечено окошко «15 l oil layer volume»/«15 L объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с помощью мышки).

Нажать кнопку «Next»/«Далее».

В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».

Задать следующие параметры эксперимента:

1. Hold/Удерж. темп-ры 95 °С – 5 мин 95 °С– 10 с

2. Cycling/Циклирование 65 °С – 25 с 72 °С – 10 с Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз.

3. Cycling2/Циклирование2 95 °С – 10 с 56 °С – 25 с – Детекция 72 °С – 10 с Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 13 из 19 Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз.

Флюоресценцию измеряют при 56 °С (во втором блоке циклирования) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow.

Нажать кнопку «OK»/«Да».

В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation…»/«Опт.уровня сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для обоих красителей нужно указать в графе Min Reading/Миним.

Сигнал значение 5, а в графе Max Reading/Максим. Сигнал значение 10. В графе «Tube position/Позиция Пробирки» указан номер пробирки, по которой будет автоматически выбран параметр «gain»/«усиление сигнала», по умолчанию это 1-я пробирка в роторе.

Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с реакционной смесью.

Пометить галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before 1st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1st Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции».

Закрыть окно «Auto Gain Calibration Setup/Авто-оптимизация уровня сигнала», нажав кнопку «Close»/«Закрыть». Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Запустить амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».

Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо запрограммировать положение пробирок в карусели. Для этого надо использовать кнопку «Edit samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и контроли обозначить в меню Samples/Образцы как Unknown/Образец.

В. Анализ результатов Анализ результатов амплификации ДНК Brucella.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE»/«Cycling A. Yellow», «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор «Threshold»/«Порог».

Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale видна кнопка Log scale).

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) 10 %.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» выставить Threshold/Порог = 0.1.

В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты») появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации ВКО.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM»/«Cycling A. Green», «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор «Threshold»/«Порог».

Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale видна кнопка Log scale).

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold/Порог Фона – ПФ (NTC) 0 %.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление CT» (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.1.

–  –  –

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 15 из 19 ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Формат FRT.

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ «iQ iCycler» и «iQ5» («BioRad», США).

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Brucella spp.

для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 7 мкл ПЦР-смеси-2-FL, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Brucella spp.

В подготовленные для ПЦР пробирки внести по 10 мкл ДНК исследуемых образцов или контролей этапа экстракции.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контроль (К–) – вместо ДНК-пробы внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера.

б) положительный контроль (К+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК Brucella.

в) внутренний контроль (ВК+) – внести в пробирку 10 мкл ПКО STI-88.

Б. Проведение амплификации и детекции флуоресцентного сигнала.

Программирование амплификатора.

Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не менее чем через 30 мин после включения оптической части прибора.

Открыть программу iCycler.

Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала.

Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме Whole Plate loading. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.

Для прибора «iQ iCycler» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением.pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно редактировать уже использованную ранее схему планшета, для этого в окне Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением.pts) и нажать кнопку Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед использованием. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.

Задать программу амплификации.

Программа «Brucella»:

95 °С – 5 мин 10 циклов: 95 °С – 10 с / 65 °С – 25 с /72 °С – 25 с 35 циклов: 95 °С – 10 с / 56 °С – 25 с (детекция) /72 °С – 25 с детекция флуоресценции на 2-м шаге (56 °С) второго блока циклирования Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы протоколов сохраняются в папке Users).

Для прибора «iQ iCycler» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 16 из 19 (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (BRUCOM.tmo) и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.

Запустить выполнение выбранной программы «Brucella» с заданной схемой планшета.

Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup).

Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

Для прибора «iQ iCycler» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

После окончания программы приступить к анализу результатов.

В. Анализ результатов Накопление продукта амплификации участка ДНК Brucella детектируется по каналу JOE, а накопление продукта амплификации ВКО – по каналу для детекции флуорофора FAM.

Анализ результатов амплификации ВКО.

Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iQ iCycler» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyze Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала FAM-490.

При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Threshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации ДНК Brucella:

Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу JOE, отключив кнопку FAM. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iQ iCycler» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала JOE-530. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши.

Формат Eph Форма 2: Кат. №№: VET-9-R0,5-К; VET-9-R0,2-К;

Формат FRT Форма 2: Кат. №: VET-9-FRT-К / Дата изменения: 30.06.16 / стр. 17 из 19 Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.

Г. Учет и интерпретация результатов Полученные данные интерпретируются с помощью программного обеспечения прибора по наличию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК (см. табл. 5).

Таблица 5 Оценка результатов анализа контрольных образцов Результат (значение Сt) Контроли Контролируемый этап Канал «FAM» Канал «JOE»

В– Экстракция ДНК Нет значений К– ПЦР Нет значений Нет значений ПЦР Нет значений K+ 33 ВК+ ПЦР Нет значений Положительными считаются образцы, для которых значение Ct на канале JOE менее 33.

Отрицательными считаются образцы, для которых по каналу JOE значение Сt отсутствует, а по каналу FAM определено значение Ct, не превышающее 31.

Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:

Отсутствие положительного сигнала в пробах с положительными контролями ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

Если значение Ct на канале JOE больше 33, а значение Ct по каналу FAM не превышает 31, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале JOE менее 33.

Образцы, для которых отсутствует значение Ct как по каналу JOE, так и по каналу FAM, или получено значение Сt по каналу FAM более 31 требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае если повторно получен аналогичный результат, требуется повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции (на канале JOE) и для отрицательного контроля этапа ПЦР (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов.

В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными.

Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

–  –  –





Похожие работы:

«Минский университет управления УТВЕРЖДАЮ Ректор Минского университета управления _ Н.В. Суша 201 г. Регистрационный № УД-_/р. Основы экологии Учебная программа учреждения высшего образования по учебной дисциплине для специальности: Транспортная логистика 1-27 02 01-01 2015 г...»

«Серия 4. Химическое машиностроение и инженерная экология Очистка сточных вод, содержащих ПАВ, и их повторное использование к.б.н. доц. Миташова Н.И., Грибач Е.А., Назарова Е.А., д.х.н. проф. Волков В.А.1, Смирнова В.А.1 Университет м...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" Биологический факультет Кафедра биохимии и физиологии растений УТВЕРЖД...»

«РОЩИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНЫХ И АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕРНОМОРСКИХ РЫБ (НА ПРИМЕРЕ МОРСКОГО ЕРША) Специальность экология– 03.00.16 Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2010 Работа выполнена на базе Государствен...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ СК РГУТИС УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТУРИЗМА И СЕРВИСА" Лист 2 из 25 © РГУТиС ...»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2011, Том 20, Экспресс-выпуск 715: 2535-2539 Осенние перемещения московки Parus ater и пухляка Parus montanus в Барабинской лесостепи (юг Западной Сибири) В.М.Чернышов Вячеслав Михайлович Чернышов. Институт систематики и экологии животных СО РА...»

«Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Каталог Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов 21.06.2016 версия от Белорусская коллекция непатогенных ми...»

«Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова Биологический факультет Звенигородская биологическая станция Сравнение ихтиофауны рек Островня и Сетунька Работу выполнили: Научный руководитель Спасская Д.С....»

«ПОЛЕЖАЕВА Анастасия Николаевна ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОГО ПЕСЕННОГО ТЕКСТА: ЛИНГВОЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ Специальность 10.02.01 русский язык АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата филологических наук Иваново – 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО "Ивановский государственный университет" Научный руководитель: доктор филологических наук, профессор Фархутдинов...»

«Экология растений Юг России: экология, развитие. №2, 2012 Ecology of plants The South of Russia: ecology, development. №2, 2012 Bibliography 1. Vladimirov V.V., Yarigina Z.N. The city and the landscape. M.: Publishing house Idea,1986. – P.240 2. Gorchakovskii P.L. Trends of anthropogenic changes in ve...»

«Управление образования администрации МО МР "Корткеросский" Муниципальное общеобразовательное учреждение "Средняя общеобразовательная школа" с. Корткерос (МОУ "СОШ" с. Корткерос) Рассмотрена Согласована "Утверждаю" мето...»

«Известия ТИНРО 2016 Том 186 БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕСУРСЫ УДК 591.9:574.587(265.5) В.П. Шунтов, И.В. Волвенко* Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4 ДОПОЛНЕНИЯ К ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ КОЛИЧЕСТВЕННЫМ ОЦЕНКАМ МАКРОФАУНЫ БЕНТАЛИ В ДАЛЬНЕВОСТО...»

«МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды (Росгидромет) Р РЕКОМЕНДАЦИИ 52.24.809МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ТОКСИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ ФИТОЦЕНОЗОВ ПЛАНКТОНА НА Ф...»

«ISSN 0869-3226 МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОХРАНА НЕ ^ ^ 1 ^^ ГЕОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО РИСКА О Б З О Р Н А Я ИНФОРМАЦИЯ РГАСНТИ 38.01.94 УДК 504.75 Б а р а б о ш к и н а Т А. Геологические факторы экологического риска. М., 2 0 0 1. 4 8 с. // Геоэ...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.