WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

Pages:   || 2 |

«ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ АНОКСИГЕННЫХ НИТЧАТЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук ...»

-- [ Страница 1 ] --

2

Федеральное государственное учреждение «Федеральный

исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии»

Российской академии наук

»

На правах рукописи

Гайсин Василь Анварович

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ

ТЕРМОФИЛЬНЫХ АНОКСИГЕННЫХ НИТЧАТЫХ ФОТОТРОФНЫХ

БАКТЕРИЙ

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук 03.02.03 – Микробиология

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Кузнецов Б. Б.

Москва – 2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ)

1.1 Систематика и краткая характеристика представителей

1.2 Морфологические, физиологические и генетические свойства................. 27 1.2.1 Морфология и ультратонкое строение

1.2.2 Использование энергии света

1.2.3 Ассимиляция неорганического углерода

1.2.4 Метаболизм серы и азота

Глава 2. Филогенетическое и функциональное разнообразие АНФБ в гидротермальных источниках

2.1 Филогенетическое разнообразие

2.2 Функциональное разнообразие

2.2.1 Превращение углерода



2.2.2 Превращение серы

Глава 3. Филогеография прокариот

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 4. Материалы исследования

Глава 5. Микробиологические методы исследования

5.1 Состав питательной среды и условия культивирования

5.2 Изучение морфологии клеток

5.3 Определение пигментов клеток

5.4 Получение чистой культуры

5.5 Изучение физиологии штамма isl-2

5.6 Изучение хемотаксономических свойств штамма isl-2

Глава 6. Молекулярно-генетические методы исследования

6.1 Выделение ДНК

6.2 Амплификация фрагментов исследуемых генов

6.3 Детектирование продуктов ПЦР

6.4 Очистка ПЦР-фрагментов

6.5 Секвенирование ДНК

6.6 Клонирование ПЦР-фрагмента

6.7 Выделение плазмидной ДНК

6.8 Секвенирование геномной ДНК

6.9 Анализ полученных последовательностей

6.10 Географические, физические данные и корреляционный анализ............ 67 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 7. Разнообразие термофильных АНФБ в гидротермах Байкальской рифтовой зоны (БРЗ)

7.1 Гены pufLM - генетические маркеры для АНФБ

7.2 АНФБ в цианобактериальных матах гидротерм БРЗ

Глава 8. Roseiflexus-содержащие фототрофные сообщества

8.1 Roseiflexus-содержащий мат источника Алла

8.2 Roseiflexus-содержащий мат источника Ценхер

Глава 9. Филогеография бактерий рода Roseiflexus

Глава 10. Новые бактерии рода Chloroflexus

10.1 Chloroflexus аggregans из источника Термофильный (Камчатка).......... 104

10.2 Chloroflexus islandicus – новая аноксигенная нитчатая фототрофная бактерия из гейзера Строккур (Исландия)

10.2.1 Морфологическая характеристика





10.2.2 Пигменты клеток

10.2.3 Физиологические свойства

10.2.4 Хемотаксономические признаки.

10.2.5 Генетические свойства

10.2.6 Таксономическое описание Chloroflexus islandicus sp. nov.............. 118

–  –  –

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СОКРАЩЕНИЯ И АББРЕВИАТУРЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г.

Приложение Д

ВВЕДЕНИЕ

Представители аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ) являются важным компонентом фототрофного микробного сообщества цианобактериальных матов в экстремальных местах обитания, в частности в гидротермальных источниках (Горленко, 1977; Ward et al., 1998; Hanada, 2003;

Klatt et al., 2007; Kim et al., 2015). Считается, что подобные цианобактериалые маты являются архаичным типом сообщества, доминировавшим на ранних этапах развития биосферы Земли (Заварзин, 2004). Эта концепция согласуется с результатами ряда теоретических эволюционных построений, согласно которым АНФБ рассматриваются как группа, являющаяся ключевой для понимания ранних этапов эволюции фототрофии (Cavalier-Smith, 2014). В связи с этим изучение термофильных АНФБ важно для реконструкции эволюционных сценариев развития микробных сообществ и самих АНФБ, являющихся важным компонентом этих сообществ.

Первая бактерия этой группы была выделена в культуру и описана 45 лет назад, как вид Chloroflexus aurantiacus, являющийся типичным обитателем горячих источников национального парка Йеллоустон (Сев. Америка) и Японских островов (Pierson, Castenholz, 1971, 1974а). Тем не менее, группа АНФБ остается «бедной на виды». Большинство известных в литературе родов как термофильных, так и мезофильных включает один или два законно описанных вида (Hanada, 2014).

При рассмотрении работ, посвященных термофильным АНФБ видно, что еще одной научной проблемой является диспропорция в изученности гидротермальных областей, источники которых являются пригодными для развития АНФБ. Объектами большинства исследований, посвященных экологии и разнообразию АНФБ, служат источники Йеллоустона (Ward et al., 1998; Boomer et al., 2002; Meer et al. 2005, 2007, 2010; Klatt et al. 2007; Liu et al.,

2011) Однако требуется расширение географии исследования АНФБ. Вопервых, эта необходимость обусловлена перспективами выделения культур новых АНФБ из ранее не изученных источников. Во-вторых, обращение к материалу по гидротермальным источникам всего мира дает богатый материал для сравнительного анализа глобального филогенетического разнообразия термофильных АНФБ. Последнее особенно актуально и заключает значительную научную новизну, так как до сих пор не было проведено анализа глобального распространения АНФБ.

Цель данного исследования: Изучение разнообразия термофильных аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий в гидротермальных экосистемах с применением комплекса микробиологических и молекулярногенетических методов.

В задачи исследования входило:

1. Исследовать филогенетическое разнообразие АНФБ в цианобактериальных матах из термальной зоны гидротермальных источников Байкальской рифтовой зоны (БРЗ).

2. Описать состав и структуру фототрофного микробного сообщества Roseiflexus-содержащих матов из термальной зоны гидротермальных источников БРЗ.

3. Проанализировать закономерность распределения термофильных АНФБ в географически удаленных гидротермальных регионах.

4. Выделить термофильные АНФБ из природных мест обитания, изучить их морфологические и физиологические свойства.

Провести молекулярно-генетическую идентификацию выделенных 5.

АНФБ, а также изучить их генетические свойства и провести филогенетический анализ.

Научная новизна. Ранее видовое разнообразие аноксигенных фототрофных бактерий в источниках БРЗ исследовали только посредством бактериологических методов. В результате выполнения данной работы впервые изучено филогенетическое разнообразие термофильных АНФБ в гидротермальных источниках Байкальской рифтовой зоны (БРЗ) с помощью комплексного подхода, включающего микробиологические и молекулярногенетические методы. Впервые в гидротермах БРЗ было описано развитие бактерий рода Roseiflexus и образование Roseiflexus-содержащего мата. Также впервые было подробно описано фототрофное микробное сообщество гидротермальной системы источника Алла и проведено его сравнение с сообществом Roseiflexus-содержащего мата источника Ценхер.

На основании сравнения последовательностей гена 16S рРНК была впервые описана филогеографическая структура глобального разнообразия термофильных бактерий рода Roseiflexus.

Сделано полное таксономическое описание нового вида термофильных хлоросом-содержащих АНФБ Chloroflexus islandicus.

Практическая значимость. В ходе выполнения данной работы было отработано использование серии новых группоспецифических праймерных систем, которые могут быть использованы в работах по микробной экологии АНФБ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференциях «Актуальные аспекты микробиологии» (Москва), «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва), 10th International Congress on Extremophiles, Saint Petersburg (Russia), 14th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes (Portugal) и 15th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes (Germany).

Публикации.

По материалам диссертации было опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 5 тезисов конференций:

Опубликованные статьи:

1. Gaisin V. A., Kalashnikov, A. M., Sukhacheva, M. V., Namsaraev, Z. B., Barhutova, D. D., Gorlenko, V. M., Kuznetsov, B. B. Filamentous anoxygenic phototrophic bacteria from cyanobacterial mats of Alla hot springs (Barguzin Valley, Russia) // Extremophiles. – 2015. – Т. 19. – №. 6. – С. 1067-1076.

2. Gaisin V. A., Grouzdev, D. S., Namsaraev, Z. B., Sukhacheva, M. V., Gorlenko, V. M., Kuznetsov, B. B. Biogeography of thermophilic phototrophic bacteria belonging to Roseiflexus genus // FEMS Microbiology Ecology. – 2016. – Т. 92. – №. 3. – С. fiw012.

3. Gaisin V. A., Ivanov T. M., Kuznetsov B. B., Gorlenko V. M., Grouzdev D. S.

Draft Genome Sequence of Chloroflexus sp. Strain isl-2, a Thermophilic Filamentous Anoxygenic Phototrophic Bacterium Isolated from Geyser Strokkur (Iceland) // Genome Announcements. – 2016. – Принята к печати.

Тезисы конференций:

1. Gorlenko V. M., Kalashnikov A. M., Sukhacheva M. V., Namsaraev B. B., Barhutova D. D., Panteleeva F. N., Gaysin V. A. Kuznetsov B. B. The diversity of anoxygenic phototrophic bacteria in the Buryat and Mongolian thermal springs. 14th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes, Porto (Portugal), 5-10 August, 2012., Book of abstracts – P. 29

2. Гайсин В. А., Калашников А. М., Сухачева М. В. Особенности разнообразия аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий в термофильных источниках ряда географически отдаленных гидротерм.

VIII Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». г. Москва (Россия), 29-31 октября, 2012, Сборник тезисов – С. 55-59

3. Gaisin V. A., Gorlenko V. M., Kuznetsov B. B. Chloroflexus islandicus sp.

nov., the New Thermophilic Phototrophic Bacterium. 10th International Congress on Extremophiles, Saint Petersburg (Russia), 7-11 September, 2014.

Book of abstracts – P. 58

4. Гайсин В. А., Калашников А. М., Сухачева М. В. Разнообразие аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий в гидротермах Байкальской рифтовой зоны. Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов», Москва (Россия), 24-27 декабря, 2014.

5. Gaisin V. A., Gorlenko V. M., Kuznetsov B. B. Phylogeographic pattern of filamentous anoxygenic phototrophic bacteria belonging to Roseiflexus species.

15th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes, Tbingen (Germany), 2-6 August, 2015. Book of abstracts – P. 212 Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Текст работы изложен на 164 страницах, содержит 30 рисунков, 7 таблиц и 5 приложений. Список литературы содержит 220 наименований.

Место выполнения работы и благодарности.

Работа была выполнена на базе Федерального государственного учреждения «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии»

Российской академии наук» в Лаборатории молекулярной диагностики (заведующий лабораторией — к.б.н. Б.Б. Кузнецов) и Лаборатории экологии и геохимической деятельности (заведующий лабораторией — д.б.н. Т.В.

Хижняк). Все оригинальные нуклеотидные последовательности, опубликованные в ходе выполнения данной работы, были определены с помощью оборудования ЦКП «Биоинженерия» Института Биоинженерии.

Отдельную благодарность автор выражает Т. В. Колгановой и Р. В. Баслерову за обеспечение высококачественного определения нуклеотидных последовательностей. Автор выражает глубокую признательность М.В.

Сухачевой, А.М. Калашникову, Д.С. Груздеву, а также З.Б. Намсараеву за практическую помощь и ценные рекомендации. Автор также выражает искреннюю благодарность всем сотрудникам Лаборатории молекулярной диагностики Института Биоинженерии и Лаборатории экологии и геохимической деятельности. Кроме того, автор благодарит коллектив Лаборатории микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН (Улан-Удэ) и в особенности Д.Д. Бархутову за организацию экспедиции на гидротермальные источники Бурятии и Монголии.

Автор выражает огромную благодарность профессору, д.б.н. Владимиру Михайловичу Горленко за ценнейшие советы и помощь в выполнении всех этапов данной работы, от планирвоания экспериментов до написания публикаций и текста диссретации.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Эволюция органического мира и планетарных процессов», а также при поддержке гранта РФФИ № 12-04-00249-а «Филогенетическое и функциональное разнообразие аноксигенных нитчатых фотосинтезирующих бактерий в умеренных и экстремальных экосистемах» и гранта Президента РФ на поддержку ведущих научных школ 14.120.14.6150-НШ.

Защищаемые положения.

1. Аноксигенные нитчатые бактерии являются важным компонентом микробных сообществ цианобактериальных матов в гидротермальных источниках Байкальской рифтовой зоны (БРЗ).

2. В источниках БРЗ обитают хлоросом-содержащие и бесхлоросомные АНФБ.

3. Структура филогенетического разнообразия АНФБ отражает географическое распределение филотипов.

4. Хлоросом-содержащие и бесхлоросомные АНФБ имеют разный характер географического распределения филотипов.

5. Выделенный из гейзера Строккур штамм isl-2 является представителем нового вида, который относится к роду Chloroflexus.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

–  –  –

1.1 Систематика и краткая характеристика представителей В 1971 году B. K. Pierson и R. W. Castenholz описали новых бактериофилл-содержащих нитчатых скользящих прокариот, выделенных из горячих щелочных источников (Pierson, Castenholz, 1971). Это было первое описание особой группы фототрофных бактерий, впоследствии названной авторами - аноксигенными нитчатыми фототрофными бактериями (filamentous anoxygenic phototrophs, FAPs), сокращенно АНФБ (Pierson, Castenholz, 1995). В различных публикациях можно встретить другие варианты названия, такие как «зеленые несерные бактерии» и «нитчатые зеленые бактерии». Однако по мере открытия новых представителей, биомасса которых не имеет зеленой окраски, актуальность этих названий была утрачена. В свою очередь, в названии — АНФБ отражены самые общие свойства данной группы прокариот. Так, у всех представителей наблюдали способность к аноксигенной фототрофии и, соответственно, присутствие бактериохлорофилла в клетках. Также клетки всегда собраны в трихомы (нити).

Представителей АНФБ выявляют в различных природных условиях с помощью микроскопирования, методов хемосистематики и молекулярной экологии. Так, было показано, что АНФБ распространены в микробных сообществах термальных источников (Pierson, Castenholz, 1974а, Weller et al., 1992; Hiraishi et al., 1999; Nbel et al., 2002), присутствую в составе пикопланктона пресноводных озер (Gich et al., 2001) и в микробных матах из гиперсоленых озер (Nbel et al., 2001; Bachar et al., 2007). Несмотря на широкое филогенетическое разнообразие АНФБ, выявляемое с помощью методов молекулярной экологии, относительно мало описано этих бактерий в чистых культурах. Это во многом обусловлено трудностью получения чистой культуры нитчатых бактерий. Так, в международных коллекциях доступны только три вида: Chloroflexus aurantiacus DSM 635, Cfl. aggregans DSM 9485, Roseiflexus castenholzii DSM 13941.

На конец 2015 года все описанные представители АНФБ были объединены в порядок Chloroflexales, который входит в класс Chloroflexia (Gupta et al., 2012). В состав класса включены еще два порядка Herpetosiphonales и Kallotenuales, представленные нефототрофными нитчатыми бактериями.

Класс Chloroflexia, в свою очередь, входит в состав филума Chloroflexi.

Название филума происходит от названия рода первой АНФБ — Chloroflexus.

Это название филума являлось до недавних пор общепринятым, но в 2015 году было предложено новое имя этого филума — Chloroflexaeota (Garrity et al., 2015). Сегодня состав филума значительно расширился за счет описания новых нефототрофных бактерий, образующих отдельные классы: Anaerolineae (Yamada et al., 2006), Ardenticatenia (Kawaichi et al., 2013), Caldilineae (Yamada et al., 2006), Dehalococcoidia (Lffler et al., 2013), Ktedonobacteria (Cavaletti et al., 2006), Thermoflexia (Dodsworth et al., 2014), Thermomicrobia (Zillig, Stetter, 1982).

В порядке Chloroflexales выделены два подпорядка (Gupta et al., 2012).

Первый подпорядок, Roseiflexineae, включает семейство Roseiflexaceae (род Roseiflexus и Heliothrix). Второй подпорядок, Chloroflexineae, включает семейства Chloroflexaceae (Trper, 1976) (род Chloroflexus) и Oscillochloridaceae (Keppen et al., 2000) (род Oscillochloris, Chloronema). Всего на сегодняшний день в группу АНФБ входит шесть родов: Chloroflexus, Oscillochloris, Chloronema, Heliothrix, Roseiflexus (Hanada, 2014) и две бактерии с неопределенным таксономическим положением, описанные в качестве кандидатов на новые рода «Candidatus Chlorothrix halophila» (Klappenbach, Pierson, 2004) и «Candidatus Chloroploca asiatica» (Gorlenko et al., 2014). Схема филогенетических связей внутри порядка приведена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема филогенетических связей внутри порядка Chloroflexales.

Обозначения над стрелками: С — семейства, ПП — подпорядки. Дендрогаммы построены с помощью метода Maximum Likelihood на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК (проанализированы 1319 позиции).

Единственная доступная последовательность (L04675) из бактерии Heliothrix oregonensis имеет длину 873 п.н., что вынуждает сокращать длину общего выравнивания, и, как следствие, поневоле искажает адекватную схему ветвления внутри кластера бактерий подпорядка Chloroflexineae. Поэтому положение H. oregonensis показано во врезке, оконтуренной пунктиром.

Деление на два подпорядка, Roseiflexineae и Chloroflexineae, основано на результатах анализа геномных данных и морфо-физиологических характеристик (Gupta et al., 2012). В первом подпорядке собраны так называемые «бесхлоросомные» АНФБ (в англоязычной литературе «chlorosome-less» (Hanada, 2003)). В клетках этих бактерий не образуются специальные внутриклеточные образования — хлоросомы, выполняющие функцию периферического светособирающего комплекса у так называемых «хлоросом-содержащих» АНФБ (Madigan, Brock, 1977). Последние собраны во второй подпорядок — Chloroflexineae.

Хлоросомы представляют собой внутриклеточные высокомолекулярные структурированные агрегаты, состоящие из белково-пигментных комплексов, в которых сконцентрировано большое количество бактериохлорофилла с. В большом количестве этот пигмент определяет зеленую окраску биомассы хлоросом-содержащих бактерий. Биомасса бактерий родов Heliothrix, Roseiflexus имеет красно-оранжевый цвет, обусловленный каротиноидами, не замаскированными бактериохлорофиллом с.

Результаты анализа генов путей синтеза бактериохлорофиллов у АНФБ, а также филогенетический анализ на основании гена 16S рРНК, указывают, что бактериохлорофилл с и хлоросомы являются поздним эволюционным приобретением (Grouzdev et al., 2014). Группа бесхлоросомных АНФБ является более древней, поэтому деление АНФБ на две группы хлоросом-содержащих и бесхлоросомных и соответствующее деление на два подпорядка, судя по всему, отражает порядок эволюции АНФБ. Стоит отметить, что в свете вышеизложенного, предложенный Hanada термин «chlorosome-less» (Hanada,

2003) не совсем логичен, т.к. они не утратили хлоросомы, а, похоже, никогда их и не имели.

Как было отмечено выше, в группу бесхлоросомных АНФБ (подпорядок Roseiflexineae) включено два рода: Roseiflexus и Heliothrix. Род Heliothrix был предложен исторически первым на основании описания вида Htr. oregonensis (Pierson et al., 1985). Эта бактерия была выделена из горячих источников штата Орегон (США) как изолят F-1 в со-культуре с бактерией Isosphaera pallida (Pierson, Castenholz, 1971). Нитчатая бактерия получила родовое название — Heliothrix, что значит «солнечный волос», и видовое название — oregonensis, которое отражает место выделения бактерии — штат Орегон (Pierson et al., 1985). Характеристика H. oregonensis была сделана на основании изучения бактерии в природной среде и в со-культуре. Впоследствии культура была утеряна и на сегодня недоступна для изучения. До сих пор не было описано других представителей этого рода.

В щелочных горячих источниках H. оregonensis образует ярко-оранжевый поверхностный слой в цианобактериальном мате, который получает обильное развитие в наиболее солнечные летние месяцы (Pierson et al., 1985).

Оптимальная температура роста 40-55°С. Было установлено, что природная популяция H. оregonensis обладает фотогетеротрофным метаболизмом и осуществляет свето-зависимую утилизацию ацетата (Pierson et al., 1984).

Пигментный состав клеток включает набор каротиноидов и бактериохлорофилл а в качестве единственного хлорофильного пигмента. Максимумы поглощения бактериохлорофилла а в препарате разрушенных клеток (in vivo) — 795 и 865 нм.

Род Roseiflexus был предложен на основании описания бактерии, которая тоже была выделена из цианобактериальных матов щелочных термальных источников. Первый представитель этого рода был выделен в чистую культуру из японского термального источника Nakabusa префектуры Nagano и описан как штамм HLO8 (DSM 13941) (Hanada et al., 2002а). На основании описания этого штамма был предложен род Roseiflexus, название которого значит — имеющий розовую окраску и изгибающийся, и предложен вид Rfl. castenholzii.

Видовое название предложено в честь американского микробиолога R.W.

Castenholz, который внес большой вклад в изучение фотосинтезирующих прокариот и первым вместе с B.K. Pierson описал АНФБ.

Еще два изолята Roseiflexus sp. RS-1 и Roseiflexus sp. RS-2 были выделены из источника Octopus в природном парке Yellowstone в США (van der Meer et al., 2010). Эти изоляты не получили валидированые видовые имена, несмотря на то, что отличаются по нуклеотидному составу генов, кодирующих 16S рРНК, более чем на три процента и в цитируемой статье van der Meer с соавторами было приведено их подробное морфофизиологическое описание.

Также они не представлены в международных коллекциях микроорганизмов.

Бактерии рода Roseiflexus осуществляют фотогететрофный рост на свету и способны к дыханию в темноте при аэробных условиях и наличии органики (van der Meer et al., 2010). Автотрофный рост отсутствует. Нитрогеназная активность отсутствует (van der Meer et al., 2010). Оптимальная температура роста для Rfl. castenholzii — 50С, для Roseiflexus sp. RS1 — 55-60С.

Максимумы поглощения бактериохлорофилла а в препарате разрушенных клеток (in vivo) — 801, 878 нм для Rfl. castenholzii и 795, 900 нм — для Roseiflexus sp. RS1.

Бесхлоросомные АНФБ описаны исключительно как термофильные бактерии, обитающие в гидротермальных источниках. Это согласуется с представлением о том, что это более древняя реликтовая группа АНФБ, не занявшая мезотермальные экологические ниши, которые считаются геологически более молодыми в сравнении с термальными экосистемами.

Принято считать, что эволюция микроорганизмов канализируется эволюцией экологической ниши (Gorlenko, 1988).

Хлоросом-содержащие АНФБ, объединенные в подпорядок Chloroflexineae, представлены как термофилами (семейство Chloroflexaceae), так и мезофилами (семейство Oscillochloridaceae). В первое семейство включен один род Chloroflexus, который был предложен на основании описания вида C.

aurantiacus, типовой штамм которого — J-10-fl (DSM 635), был выделен из термального источника Hakone (Япония) (Pierson, Castenholz, 1974а). Родовое название «Chloroflexus» означает — зеленный и гибкий. Видовое название «aurantiacus» означает — оранжевый. Видовое название отражает то, что бактерия приобретает окраску биомассы от желто-оранжевой до красно-бурой при увеличении концентрации кислорода, уменьшении температуры окружающей среды или сильного увеличения интенсивности света. Эти факторы ингибируют синтез бактериохлорофилла с клетками, что приводит к проявлению каротиноидной окраски (Pierson, Castenholz, 1974б). Это — обратимая адаптивная реакция, основанная на снижении концентрации бактериохлорофилла с в хлоросомах, но не приводящая к их исчезновению. В клетках всегда образуются реструктуризованные хлоросомы ("chlorosome bags"), которые быстро превращаются в полноценные хлоросомы при смене условий (Schmidt et al., 1980). Адаптивная реструктуризация хлоросом была показана только для бактерий рода Chloroflexus.

Основные данные о хлоросомах в клетках АНФБ были получены при изучении C. aurantiacus. Тем ни менее Хлоросомы есть у всех представителей семейства Chloroflexaceae Oscillochloridaceae, в том числе у «Candidatus Chlorothrix halophila» (Klappenbach, Pierson, 2004) и «Candidatus Chloroploca asiatica» (Gorlenko et al., 2014).

В хлоросомах бактерия C. aurantiacus сосредоточен бактериохлорофилл с клеток, который в пигментных спектрах in vivo дает максимум поглощения около 740 нм. Также в клетках присутствует бактериохлорофилл а (максимум поглощения in vivo около 802 и 865 нм), но в значительно меньшем количестве.

Бактериохлорофилл а у бактерии C. aurantiacus, как в общем и у остальных АНФБ, входит в состав хлоросом, B806-866 комплекса и реакционных центров.

Каротиноиды в клетках C. aurantiacus представлены -каротином и каротином с соответствующими производными в соотношении 1:2 (Halfen et al., 1972).

На свету C. aurantiacus растет фотогетеротрофно, в темноте в аэробных условиях — хемогетеротрофно, в обоих случаях используя широкий спектр субстратов (Madigan et al., 1974; Красильникова и др., 1986). Для некоторых штаммов показано использование сульфида как источника электронов для фотоавтотрофного роста (Madigan, Brock, 1975; Madigan, Brock, 1977). Также было показано, что фиксация углерода у этой бактерии происходит с помощью 3-гидроксипропионатного цикла (Holo, 1989; Strauss, Fuchs, 1993), который впервые был открыт именно у этого вида.

Второй термофильный вид рода Chloroflexus — C. aggregans. Эта бактерия выделена из термальных источников Японии (Hanada et al., 1995б).

Типовым штаммом является DM-66 (DSM 9485). Бактерия получила свое видовое название «aggregans» из-за способности трихомов быстро образовывать агрегаты при выращивании в жидкой среде. Было установлено, что процесс образования агрегатов является энергозатратным (Hanada et al., 2002б). Показано, что переход из анаэробных условий в микроаэрофильные увеличивает скорость агрегации. Возможно, агрегация является защитным механизмом, благодаря которому в плотной зоне агрегата создаются анаэробные условия. Бактерия способна к фотогетеротрофному росту на свету и к аэробному хемогетеротрофному росту в темноте.

Оба вида C. aurantiacus и C. aggregans имеют одинаковую оптимальную температуру роста (около 55С), схожие оптимальные значения рН, одинаковый состав бактериохлорофиллов и очень схожую цитоморфологию (Pierson, Castenholz, 1974; Hanada et al., 1995б). Однако эти виды имеют разный состав каротиноидов и хинонов. Так, в клетках C. aurantiacus содержится один вид хинона – МК-10, тогда как в клетках C. aggregans — МК-10 и МК-4. Также бактерии имеют значительные генетические отличия. Гомология со штаммами вида C. aurantiacus, согласно ДНК-ДНК гибридизации, составляет до 18%, а разница в составе последовательностей гена 16S рРНК составляет около 5% (Hanada et al., 1995б). Несколько отличается спектр утилизируемых субстратов.

В середине 70-х годов была описана еще одна бактерия, для которой было предложено имя C. aurantiacus var. misophilus. Эта бактерия была выделена в чистую культуру из пресноводных озер и росла при температуре 20 - 25С (Горленко, 1975; Пивоварова, Горленко, 1977). Таксономическая принадлежность была установлена на основании морфологических признаков.

К моменту вхождения в обиход молекулярно-генетических методов, культура оказалась недоступна для исследования. Сегодня есть основания полагать, что C. aurantiacus var. misophilus не относится к роду Chloroflexus, а представляет отдельную группу мезофильных АНФБ.

На текущий момент большинство описанных мезофильных представителей определено в семейство Oscillochloridaceae (Gupta et al., 2012), которое включает рода Oscillochloris и Chloronema, а также бактерию «Candidatus Chloroploca asiatica». Галофильная бактерия «Candidatus Chlorothrix halophila», растущая при мезофильных значениях температур, остается без определенного таксономического статуса, но ее можно отнести к условной группе мезофильных хлоросом-содержащих бактерий.

История изучения мезофильных АНФБ началась с работ отечественных микробиологов, выполненных в Институте микробиологии РАН им. С.Н.

Виноградского. Первым в вышеупомянутой группе АНФБ был предложен род Chloronema («зеленая нить») на основании описания в крупных нитчатых зеленых бактерий Cln. giganteum и Cln. spiroideum, наблюдаемых в образцах воды из верхнего слоя хемоклина пресного озера (Дубинина, Горленко, 1975).

Ни один из видов не удалось выделить в культуру, однако авторы получили достаточно подробную характеристику бактерии Cln. giganteum. Клетки имеют диаметр от 2 до 2,5 мкм, один из самых крупных среди АНФБ на тот момент, на основании чего и возникло видовое имя «giganteum». В клетках большое количество хлоросом, но основным пигментом является не бактериохлорофилл с, а бактериохлорофилл d (максимум поглощения in vivo 770 нм), что является уникальным среди АНФБ. Впоследствии появились новые описания бактерий рода Chloronema в хемоклине озер Северной Америки (Gich et al., 2001). В работе Gich и др были получены первые последовательности гена 16S рРНК этой бактерии и установлено ее филогенетическое положение, как самостоятельной филогенетической линии. Позже была получена со-культура Cln. giganteum UdG9001, которую удавалось поддерживать некоторое время (Gich et al., 2003). На основании изучения этого изолята было установлено, что бактериохлорофилл d выполняет роль антенного пигмента и локализован в хлоросомах, в которых также присутствует бактериохлорофилл с (Gich et al., 2003). Также накопительная культура Chloronema-подобной АНФБ была получена из испанского голомиктического озера (Baeras et al., 2009). Этот изолят также содержал бактериохлорофилл d, но филогенетически был отдален от Cln. giganteum UdG9001.

Среди мезофильных АНФБ наиболее изучены бактерии рода Oscillochloris, а точнее вид Osc. trichoides. Однако история рода начинается с описания бактерии Osc. chrysea на основании изучения в природных условиях микроорганизма, который ранее был описан как нитчатая цианобактерия Oscillatoria coerulescens (Горленко, Пивоварова, 1977). В результате исследования Горленко и Пивоваровой было доказанно, что Oscillatoria coerulescens не цианобактерия. Выяснилось, что эта бактерия является очень крупной АНФБ. Длина трихомов составляла около 2,5 мм, а толщина достигала 4,5 — 5.5 мкм. Отдельные клетки отделялись по типу гормогоний, а на концах трихомов образовывались слизистые колпачки для прикрепления к твердому субстрату (Горленко, Пивоварова, 1977). Суммируя эти признаки, можно понять, почему изначально этот микроорганизм был принят за цианобактерию.

Описанная бактерия получила видовое название «chrysea», что значит «золотистый» в переводе с латыни. Родовое название «Oscillochloris» в переводе с латыни означает «колеблющийся» и «зеленый», что отражает способность трихомов бактерии к осцилляторному движению.

Только у этого вида АНФБ были описаны длинные впячивания цитоплазматической мембраны вовнутрь клетки, вдоль которых в обилии расположены хлоросомы. Таким образом, значительно увеличивается площадь мембраны, вовлеченной в фотосинтез. Основным пигментом клеток является бактериохлорофилл с с максимумом поглощения in vivo – 760 нм. Также присутствует бактериохлорофилл а (поглощение in vivo 810 и 850 нм). Бактерия проявляет фототрофию, устойчива к сульфиду и в природе развивается на поверхности сероводородного ила. Развитие происходило при температуре 10 — 20С и значении рН 8,5 (Горленко, Пивоварова, 1977).

Osc. trichoides был выделен из микробных обрастаний на поверхности сероводородного ила пресного озера (Горленко, Коротков, 1979). Клетки имеют диаметр 1.2 — 1.4 мкм, собраны в трихомы, которые способны к скользящему движению. Важный морфологический признак вида — газовые вакуоли, расположенные вдоль межклеточных перегородок. Хлоросомы обильно представлены в клетках. Основной пигмент клеток — бактериохлорофилл с (максимум поглощения in vivo 750 нм). Также в клетках присутствует бактериохлорофилл а (максимумы поглощения in vivo 805 и 850 нм), - и каротины (Горленко, Коротков, 1979). Позднее в чистую культуру был выделен неотип этого вида (Кеппен и др. 1993; Keppen, 1994). На основании изучения культуры нетипа Osc. trichoides (штамм DG-6) были проведены все основные работы по изучению биологии рода. Штамм DG-6 признан типовым. На основании исследования ДНК этого штамма расшифрована полная последовательность генома Osc. trichoides (Kuznetsov et al., 2011).

Штаммы Osc. trichoides обнаруживают в богатых сероводородом эконишах, таких как сульфидный источник, прибрежный ил Белого моря, микробные обрастания из содового озера и пресноводных водоемов (Кеппен, 2010), мезофильный цианобактериальный мат в щелочных гидротермах Бурятии (Калашников и др., 2013). Оптимальная концентрация сульфида — 500 мг/л. Сульфид используется как донор электронов и окисляется до молекулярной серы, которая откладывается вне клеток (Горленко, Коротков, 1979). Бактерия является облигатным анаэробом и растет как фотогетеротрофно, так и фотоавтотрофно. Для наилучшего роста нужно присутствие дрожжевого экстракта. Оптимальная температура роста около 30С. Оптимальное значение рН 7.5 — 8.0.

В 2014 году была описанная новая мезофильная АНФБ «Candidatus Chloroploca asiatica». Бактерия была описана в статусе «Candidatus» на основании изучения смешанной культуры (монокультуры) и не получила валидированного таксономического статуса. Однако результаты филогенетического анализа и морфофизиологические особенности дают основания отнести ее к семейству Oscillochloridaceae (Gorlenko et al., 2014).

Четыре штамма этой бактерии были выделены из содово-соленых озер юга Восточной Сибири и один штамм - из сульфидного источника Умхей (Бурятия). В клетках, имеющих диаметр 0.5–0.7 мкм, наблюдается большое количество газовых вакуолей. Однако в отличие от Osc. trichoides, трихомы стабильно короткие. Основным пигментом клеток является бактериохлорофилл с с максимумом поглощения in vivo – 742 нм. Также присутствует бактериохлорофилл а (поглощение in vivo 805 и 863 нм), - и -каротины.

Культура росла в фотогетеротрофных анаэробных условиях. Также культура выдерживала культивирование в фотоавтотрофных условиях в течение шести месяцев. Температура роста составляла 25 — 32С. Оптимальное значение составляло рН 8.0 (Gorlenko et al., 2014). Оптимальная соленость для культуры «Candidatus Chloroploca asiatica» штамм B7-9 составила 5 г/л NaCI. Четыре штамма выделено из экониш с минерализацией 3-6 г/л. Один штамм был выделен из озера Доронинское, в котором концентрация NaCI составляла около 12 г/л, а общая минерализация около 24 г/л.

Истинно галофильной культивируемой АНФБ является «Candidatus Chlorothrix halophila», который был описан 2004 году в статусе «Candidatus»

(Klappenbach, Pierson, 2004). Бактерия «Candidatus Chlorothrix halophila»

является представителем галофильной группой АНФБ, ранее описанной в гиперсоленых матах и выделенной в отдельную группу как морские и гипергалофильные Chloroflexus-подобные бактерии (в англоязычной литературе встречается аббревиатура MCLOs — Marine Chloroflexus-Like Organisms) (Pierson et al., 1994; Nbel et al., 2001; Ley et al., 2006). В данный момент «Candidatus Chlorothrix halophila» остается бактерией без определенного таксономического статуса. Низкая достоверность кластеризации вместе с Osc. trichoides при филогенетическом анализе последовательностей генов 16S рРНК, отдельная ветвь на дендрограмме последовательностей генов фотосинтетического аппарата (Grouzdev et al., 2015), а также набор уникальных морфофизиологических признаков дают основание предполагать, что в дальнейшем при описании новых представителей группы MCLOs будет предложен новый таксон ранга семейства.

Клетки «Candidatus Chlorothrix halophila» имеют диаметр 2.5 мкм, собраны в трихомы различной длины. Цитоплазматическая мембрана образует впячивания, широкие и неглубокие, в отличие от узких впячиваний у Osc.

chrysea, уходящих глубоко во внутренний объем клетки и часто образующих межклеточную перегородку. Хлоросомы в клетках «Candidatus Chlorothrix halophila» расположены как вдоль этих впячиваний, так и вдоль основной цитоплазматической мембраны. Бактериохлорофилл с (максимумы поглощения 753 нм) значительно преобладает над другими хлорофилами, так что не было ясно присутствие бактериохлорофилла а (Klappenbach, Pierson, 2004). Анализ пигментного состава с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии показал, что в клетках «Candidatus Chlorothrix halophila», кроме бактриохлорофилла с и - и -каротина, присутствует этерифицированное производное бактериохлорофилла а (BChl aTHGG), которое ранее не было описано у АНФБ (Olson et al., 2007).

В 2015 году появилось сообщение с описанием новой мезофильной АНФБ, выделенной из мезофильной зоны (35 – 40°C) стока сульфидных гидротермальных источников Кучигер и Умхей (Баргузинская долина, Бурятия) (Gaisin et al., 2015). Культура бактерий развивалась при температуре 28°C и при значении рН среды 7.0 на свету. Диаметр клеток составлял 0.8 кмк. Бактерия образовывала колонии зеленого цвета. По результатам спектрального анализа было установлено наличие в клетках бактериохлорофилла с, имеющего максимум поглощения in vivo равный 740 нм. На основании филогенетического анализа было предположено, что эту новую АНФБ можно отнести к семейству Oscillochloridaceae.

Вышеизложенные данные о выделенных и описанных в культуре АНФБ суммированы в сравнительной таблице 1.

Таблица 1. Основные свойства описанных представителей АНФБ.

–  –  –

Самым общим типичным морфологическим признаком АНФБ является объединение клеток в трихомы (нити), что отражено в названии группы.

Толщина трихомов варьирует в зависимости от вида бактерии от 0.5 мкм, как у C. aurantiacus, и до 5.5, как у Osc. chrysea (Pierson, Castenholz, 1974; Горленко, Пивоварова, 1977). При нормальных условиях культивирования нити могут быть очень длинными и объединять десятки клеток, как у бактерий рода Chloroflexus (Pierson, Castenholz, 1974). Однако размеров трихомов в культуре варьируют. В стрессовых условиях и при продолжительном культивировании наблюдается фрагментация трихомов на фрагменты по 2-4 клетки, что было показано при исследовании Chloroflexus islandicus в данной работе. В более ранних работах было предположено, что отторжение отдельных клеток от трихома обеспечивает распространение («размножение») АНФБ в среде. У бактерии Candidatus «Chloroploca asiatica» трихомы короткие вне зависимости от стадии роста (Gorlenko et al., 2014). Для бактерий рода Chloronema, обитающей в хемоклине стратифицированных озер, характерно образование трихомов спиралевидной формы при повышении концентрации сероводорода в среде (Abella, Garcia-Gil, 1992). Однако у большинства представителей трихомы прямые. На рисунке 2 приведены фотографии трихомов различных АНФБ.

У некоторых видов образуется внешний слой материала, покрывающий трихом как трубка — так называемый «чехол» (в англоязычной литературе «sheath») (Pierson, Castenholz, 1974; Keppen et al., 1994). У бактерии Candidatus «Chloroploca asiatica» в чехле может находиться сразу несколько нитей (Gorlenko et al., 2014). Очевидно, функция чехла заключается в защите клеток от механического воздействия и фагов. Кроме того, можно предположить, что он играет роль ионообменного барьера. Так, было замечено, что, при высокой концентрации железа в среде, чехол бактерии Candidatus «Chloroploca asiatica»

приобретает темную окраску, что, возможно, связано с накоплением в его толще сульфида железа (Gorlenko et al., 2014).

Рисунок 2. Форма трихомов некоторых АНФБ: 1 — Heliothrix oregonensis (толстые нити, стрелкой показана межклеточная перегородка) и Chloroflexus aurantiacus J-10fl.

Бактерии показаны в одном препарате для сравнения. 2 — Oscillochloris chrysea. 3 – Chloronema giganteum. 4 – Oscillochloris trichoides RS-1. Микрофотографии цитируются по: 1 — Pierson et al., 1985; 2 - Горленко, Пивоварова, 1977; 3 — Дубинина, Горленко, 1975; 4 — Горленко, Коротков, 1979.

Клетки АНФБ красятся грамотрицательно (Pierson, Castenholz, 1974;

Hanada et al., 1995б, 2002а). С помощью электронной микроскопии установлено, что клеточная стенка грамотрицательного типа. Однако уникальной особенностью, выделяющей АНФБ среди других бактерий, является отсутствие внешней мембраны (Sutcliffe, 2011). Данные электронной микроскопии подтверждаются результатами химического анализа, указывающими на отсутствие липополисахаридов, характерных для внешней мембраны грамотрицательных бактерий (Meissner, 1988; Sutcliffe, 2010). Кроме этого, отличается состав пептидогликановой клеточной стенки (Chloroflexus aurantiacus), в которой содрежится L-орнитин вместо диаминопимелиновой кислоты (Jurgens et al., 1987). Единственная АНФБ, которая красится грамположительно, — Oscillochloris chrysea (Горленко, Пивоварова, 1977).

У термофильных АНФБ цитоплазматическая мембрана прилегает непосредственно к клеточной стенке. Для бактерий Osc. chrysea было описано образование длинных впячиваний цитоплазматической мембраны. (Горленко, Пивоварова, 1977). Впячивания, но менее значительные, наблюдали у «Candidatus Chlorothrix halophila» (Klappenbach, Pierson, 2004). У зеленых или хлоросом-содрежащих АНФБ вдоль цитоплазматической мембраны расположены хлоросомы, которые подробней рассматриваются в следующем разделе (1.2.2 Использование энергии света).

У многих АНФБ в цитоплазме встречаются включения поли-оксимасляной кислоты, которая играет роль запасного вещества (Pierson, Castenholz, 1974; Keppen et al., 1994). Газовые вакуоли присутствуют у бактерий рода Oscillochloris и Chloronema (Дубинина, Горленко, 1975;

Горленко, Коротков, 1979; Keppen et al., 1994). Для последней газовые вакуоли могут иметь важное экологическое значение, т.к. могут способствовать плавучисти в верхней чзоне хемоклина в водной толще озер. Крупные газовые вакуоли образуются у бактерии Candidatus «Chloroploca asiatica» (Gorlenko et al., 2014). Для бактерии Oscillochloris trichoides расположение вакуолей вдоль межклеточных перегородок считается видоспецифичным признаком. В ряде случаев наблюдаются гранулы полифосфата (Pierson, Castenholz, 1974; Gorlenko et al., 2014). Для бактерии Chloroflexus aurantiacus показано образование внеклеточной серы за счет окисления сульфида при фотоавтотрофном росте (Madigan, Brock, 1975). Образование внутриклеточной серы не было описано, что нашло отражение в старом названии группы «зеленые несерные бактерии».

Образование жгутиков у АНФБ не наблюдали, и движение осуществляется за счет скольжения. В исследовании этого года с помощью микроскопических стеклянных бус было показано, что скользящее движение происходит за счет поверхностных клеточных структур (Fukushima et al., 2016).

1.2.2 Использование энергии света

Одной из главных особенностей группы АНФБ, в отличие от других филогенетических линий бактерий филума Chloroflexi, является способность к фототрофии. Этот физиологический процесс осуществляется за счет уникальной «химерной» фотосистемы АНФБ, сочетающей свойства фотосистем зеленых серных и пурпурных бактерий.

Все АНФБ можно разделить на бесхлоросомных и хлоросом-содержащих (зеленых) бактерий, на основании отсутствия или наличия светособирающей антенны — хлоросомы. Таким образом, хлоросома является вариативным элементом фотосистемы АНФБ. Базовая часть, т. е. представленная у всех изученных АНФБ, включает фотореакционный центр (РЦ), коровую антенну реакционного центра, называемую «LH-комплексом» (LH – от английского названия «light-harvesting»), и переносчики электронов. В деталях фотосистема АНФБ была изучена главным образом на штаммах вида Chloroflexus aurantiacus, который стал модельным объектом для изучения биологии этой группы в целом.

Хлоросомы представляют собой высокомолекулярный белковопигментный комплекс, выполняющий функцию периферической светособирающей антенны, которая улавливает фотоны для передачи энергии в фотосинтетические реакционные центры (Orf, Blankenship, 2013). В ранних публикациях можно встретить уже не употребляемое название хлоросом — «Chlorobium везикузы» (Schmid, 1980), возникшее вследствие того, что эти образования впервые были описаны у представителей рода Chlorobium. На сегодня известно, что хлоросомы встречаются у трех крупных филогенетических групп фототрофных бактерий: АНФБ (филум Chloroflexi) (Madigan, Brock, 1977), зеленых серных бактерий (филум Chlorobi) (CohenBazire et al., 1964) и хлороацидобактерий (филум Acidobacteria) (Bryant et al., 2007). У всех АНФБ хлоросомы имеют форму продолговатого овала, размеры которого варьируют у разных представителей. Так для бактерии C. aurantiacus длина хлоросомы составляет 106 ± 24 нм, а ширина — 32 ± 10 нм (Staehelin et al., 1978). У бактерии Oscillochloris trichoides длина хлоросомы составляет 164 ± 18 нм, а ширина 58 ± 9 нм (Taisova et al., 2002).

Хлоросома состоит из поверхностного липидно-белкового монослоя, центральной пигментной части и базовой пластинки (белок CsmA и бактериохлорофилл а) (Staehelin et al., 1978; Oostergetel et al., 2010; Orf, Blankenship, 2013). Центральная часть хлоросомы формируется в результате самосборки молекул бактериохлорофиллов и каротиноидов в пигментный агрегат. При этом основным пигментом является бактериохлорофилл с, но у разных групп бактерий в состав хлоросом может входить бактериохлорофилл e и d. (Frigaard, Bryant, 2006). Так, среди АНФБ бактериохлорофилл d присутствует у бактерий рода Chloronema (Дубинина, Горленко, 1975).

У зеленых серных бактерий хлоросома соединена с фотореакционным центром через специальный пигментно-белковый комплекс образованный FMO-белком (Fenna-Matthews-Olson protein), который осуществляет передачу энергии в РЦ (Blankenship et al., 1995). У АНФБ отсутствует FMO-белок.

Энергия от бактериохлорофиллов хлоросомы передается в пигмент-белковый комплекс базальной пластинки (B798 light-harvesting baseplate) (Montano et al., 2003), от которого уже поступает на LH-комплекс (Frigaard, Bryant, 2006).

От хлоросомы энергия передается в LH-комплекс, который передает энергию непосредственно в реакционные центры фотосистемы. LH-комплекс также называют антенной реакционного центра, или коровой антенной. У бактерий рода Roseiflexus и, очевидно, у всех бесхлоросомных АНФБ это единственная светособирающая антенна.

В обеих группах АНФБ принципиальное устройство LH-комплекса одинаково. Комплекс представляет собой группу трансмембранных белков, прилегающих к реакционному центру в виде кольца (Tang et al., 2010; Xin et al., 2005). Каждый белок состоит из двух субъединиц (- и -полипептиды), которые несут молекулу бактериохлорофилла а, определяющего спектральные характеристики комплекса (Bina et al., 2014; Majumder et al., 2016). LHкомплекс бактерии Chloroflexus aurantiacus (в литературе часто используется название “B806-866 комплекс”) имеет бактериохлорофилл со спектром поглощения 806 и 866 нм (Feick, Fuller, 1984). LH-комплекс у бактерии Roseiflexus castenholzii имеет сдвинутый спектр поглощения бактериохлорофилла — максимумы поглощения 802 и 880 нм (Xin et al., 2012).

LH-комплекс передает энергию непосредственно на реакционный центр.

АНФБ имеют РЦ хинонового типа (Q-тип), т. к. в качестве вторичного акцептора электронов выступает молекула хинона (Blankenship et al., 1983).

Всего выделяют два типа реакционных центров. Первый тип (РЦ-I) использует железо-серный кластер в качестве вторичного акцептора. Он функционирует у гелиобактерий (филум Firmicutes) и зеленых серных бактерий (филум Chlorobi), а также в составе первой фотосистемы оксигенных фототрофов.

Реакционный центр второго типа (РЦ-II), хинонового типа, кроме АНФБ, функционирует у пурпурных бактерий (филум Proteobacteria) и в составе второй фотосистемы (Hillier, Babcock, 2001).

Реакционный центр АНФБ представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из двух полипептидов (Lсубъединицей («L» от английского слова «Light») и M-субъединицей («M» от английского слова «Medium»), трех молекул бактериохлорофилла, трех молекул бактериофеофитина, двух молекул хинона и одного цитохрома (Ovchinnikovt et al., 1988аб; Pierson, Thornber, 1983; Freeman, Blankenship, 1990;

Collins et al., 2011). Белковый компонент реакционного центра очень похож на таковой в реакционном центре пурпурных бактерий, как в структурной организации, так и в аминокислотном составе последовательностей L- и Мсубъединиц (Shiozawa et al., 1989). Однако у АНФБ, в отличие от пурпурных бактерий в РЦ, отсутствует третья субъединица, называемая «Н-субъединица»

(«Н» от английского слова «Heavy», т. е. тяжелая субъединица).

Особенностью АНФБ является отсутствие bc1 цитохрома, поэтому, в отличие от пурпурных бактерий, у АНФБ хинон (менахинон) передает электрон в так называемый «альтернативный комплекс III» (ACIII, от английского названия Alternative Complex III), который выполняет функцию bc1 (Gao et al., 2009; Majumder et al., 2013). От ACIII электрон передается на периплазматический переносчик электронов – аурацианин (англ. auracyanin), который возвращает электрон в ЦР через связанный с ним цитохром с-554 (McManus et al., 1992; Majumder et al., 2013; Tang et al., 2011).

Гены белков фотореакционного центра и LH-комплекса собраны в опероны, которые у фототрофных протеобактерий и АНФБ получили название «puf опероны». В разных публикациях встречаются разные расшифровки этого названия: photosynthetic formation unit (Vermglio, Joliot, 2002), photosynthetic unit forming (Zheng et al., 2011) или photosynthetic unit fixed (Tang et al., 2011).

Организация puf генов в геномах АНФБ может варьировать. Так, у Chloroflexus aurantiacus гены, кодирующие - и -полипептиды LH-комплекса, собраны в один оперон pufABC (соответственно гены pufA и pufВ) (Watanabe et al., 1995). В этом опероне также находится ген цитохрома с-554 (pufC), входящий в состав фотореакционной системы (Freeman, Blankenship, 1990). В свою очередь гены, кодирующие L- и М-субъединицы РЦ, собраны в другой оперон – pufLM. В геноме бактерий рода Roseiflexus гены pufL и pufM слиты в один гибридный ген, который входит в общий оперон с генами pufA, pufB и pufC (Tang et al., 2011; Grouzdev et al., 2014).

1.2.3 Ассимиляция неорганического углерода

По мере открытия новых АНФБ и исследования их физиологии выяснилось, что группа проявляет широкое метаболитическое разнообразие.

Так, бактерии рода Chloroflexus способны расти за счет фотогетеротрофного и фотоавтотрофного метаболизма на свету или за счет дыхания в темноте (Madigan et al., 1974; Красильникова и др., 1986). Бактерии рода Roseiflexus - за счет фотогетеротрофного метаболизма на свету и за счет дыхания в темноте (Handa et al., 2002; van der Meer et al., 2011). Углеродная автотрофия у бесхлоросомных АНФБ не обнаружена. Мезофильная бактерия Oscillochloris trichoides является облигатно анаэробной бактерией и не способна к дыханию, растет только на свету за счет фотогетеротрофного или фотоавтотрофного метаболизма (Кеппен 2010).

Способность к фиксации углекислоты при осуществлении фотоавтотрофного метаболизма у АНФБ опосредована двумя разными механизмами: через восстановительный пентозофосфатный цикл и через 3гидроксипропионатный цикл. Последний был впервые описан именно при изучении Chloroflexus aurantiacus (Holo, Sirevg, 1986; Holo, 1989; Strauss, Fuchs, 1993). Впоследствии модифицированный 3-гидроксипропионатный цикл был открыт и изучен у Архей (Ishii et al., 1996; Berg et al., 2007).

Активность 3-гидроксипропионатного цикла среди АНФБ доказана только у Chloroflexus aurantiacus (Strauss, Fuchs, 1993). До сих пор среди термофильных АНФБ это единственная бактерия, для которой описана способность к фотоавтотрофному росту за счет окисления сульфида (Madigan, Brock, 1975; Madigan, Brock, 1977, Holo, Sirevg, 1986). Тем не менее, гены, кодирующие ферменты 3-гидроксипропионатного цикла, обнаружены в геноме Roseiflexus RS-1 (van der Meer et al., 2010), а также в геномах бактерий Roseiflexus castenholzii и Chloroflexus aggregans (Klatt et al., 2007). Гены, кодирующие ключевые ферменты цикла Кальвина и цикла Ивенса-БьюкененаЭрнона, а также гены ферментов обеспечивающих путь Вуда-Льюнгдала, не были обнаружены в геноме Chloroflexus aurantiacus (Tang et al., 2011).

Исследование изотопного состава клеток бактерии Chloroflexus aurantiacus при фотоавтотрофном росте выявило, что фиксация углекислоты посредством 3-гидроксипропионатного цикла обуславливает низкое значение C/12C (далее 13C) по сравнению со отклонения изотопного соотношения значением, характерным для восстановительного пентозофосфатного цикла (цикла Кальвина). Так среднее значение 13C для клеток Chloroflexus aurantiacus составляет примерно 13.7‰ (Holo, Sirevg, 1986; van der Meer et al., 2001). В тоже время, для некоторых пурпурных бактерий, цианобактерий и микроскопических водорослей, осуществляющих фиксацию СО2 через цикл Кальвина, значение 13C составляет примерно от 20 до 30‰ (Sirevg et al., 1977;

Madigan et al., 1989; Sakata et al., 1997) Вышеизложенный факт позволил использовать значение 13C как критерий для оценки вклада АНФБ в фиксацию углекислоты фотоавтотрофным сообществом. С помощью этого подхода было установлено, что в биомассе матов, образованных бактериями рода Chloroflexus, которые развиваются в щелочных источниках Йеллоустоуна, значение 13C составляло 12.9 — 14.9‰ (van der Meer et al., 2000). Авторы этого исследования сделали два важных вывода. Во-первых, для природных популяций Chloroflexus spp. углекислота, ассимилируемая через 3-гидроксипропионатный цикл, является важным источником углерода. Во-вторых углеродные отложения Докембрийского периода с аномально низким значением 13C (около 13‰ (Schidlowski, 1988)) могли образоваться вследствие активности прокариот.

Кроме 3-гидроксипропионатного цикла, у АНФБ обнаружена фиксация углекислоты через цикл Кальвина. Активность рибулозобисфосфаткарбоксилазы установлена у бактерии Oscillochloris trichoides DG-6 (Ivanovsky et al., 1999). В этой же работе показано, что значение 13C биомассы бактерии Oscillochloris trichoides DG-6, выросшей в автотрофных условиях, составляет 28.2‰, что также подтверждает функционирование цикла Кальвина.

Способность к фиксации СО2 через цикл Кальвина, кроме О. trichoides DG-6, была установлена у Oscillochloris ps. R, KR и BM (Berg et al., 2005).

Кроме того, было установлено, что эти бактерий способны осуществлять гетеротрофную фиксацию СО2 благодаря активности пируватсинтазы, ФЕПкарбоксилазы и 2-оксоглутаратсинтазы (Berg et al., 2005). Ген, кодирующий рибулозобисфосфаткарбоксилазу, также найден в геноме бактерии ‘Candidatus Chlorothrix halophila’ (Grouzdev et al., 2014). В тоже время у этой бактерии не обнаружена активность ключевых ферментов 3-гидроксипропионатного цикла при фотоавтотрофном росте (Klappenbach, Pierson, 2004).

1.2.4 Метаболизм серы и азота

АНФБ проявляют разнообразие по способности использовать соединения серы и азота для конструктивного и энергетического метаболизма. Как и в случае с ассимиляцией углекислоты, основные особенности серного и азотного метаболизма были изучены на примере бактерий Cfl. aurantiacus и О. trichoides.

Сульфид может служить источником электронов при фотоавтотрофном росте бактерии О. trichoides и некоторых штаммов бактерии Cfl. aurantiacus (Madigan, Brock, 1975; Горленко, Коротков, 1979; Кеппен и др.. 1993). При этом накопление серы наблюдается в трихоме и вне клеток. Необходимость в сульфиде при фотоатотрофном росте показана для «Candidatus Chlorothrix halophila», однако ничего не сообщается о накоплении окисленных форм серы (Klappenbach, Pierson, 2004). Окисление сульфида не было обнаружено у других АНФБ, хотя многие имеют высокую толерантность к сероводороду.

Для конструктивного метаболизма источником серы могут служить серосодержащие аминокислоты. Так, штамм OK-70-fl бактерии Cfl. aurantiacus способен использовать цистеин (Madigan, Brock, 1975). Штаммы B-3, A и UZ способны расти в присутствии цистеина, глутатиона, метионина, хотя интенсивность роста может значительно меняться от варианта к варианту (Красильникова, 1986). Бактерия О. trichoides способна использовать цистеин и цистин (Keppen et al., 1994). В целом, эта бактерия более ограничена в использовании источников серы по сравнению с Cfl. aurantiacus и кроме аминокислот может использовать только сульфид. Бактерия Cfl. aurantiacus, напротив, в гетеротрофных условиях кроме аминокислот в качестве источников может использовать сульфат, сульфит, молекулярную серу и тиосульфат (Красильникова, Кондратьева, 1988; Кондратьева, Красильникова, 1988).

В качестве источника азота АНФБ могут использовать соли амония и такие аминокислоты как глицин, глутамин, глутамат (Heda, Madigan, 1986;

Keppen et al., 1994). При исследовании бактерии Cfl. aurantiacus было показано, что спектр используемых аминокислот варьирует у разных штаммов (Heda, Madigan, 1986). Гидролизат казеина поддерживает рост как у Cfl. aurantiacus, так и у О. trichoides (Madigan et al., 1974; Keppen et al., 1994).

Способность использовать нитраты как источник азота у АНФБ не описана. У бактерии О. trichoides была обнаружена нитрогеназная активность, однако, рост в присутствии только молекулярного азота слабый (Кеппен и др., 1989). У бактерии Cfl. aurantiacus нитрогеназная активность не обнаружена (Heda, Madigan, 1986). Это согласуется с результатами геномного анализа. Так, в геноме бактерии Cfl. aurantiacus не было обнаружено ключевых генов нитрогеназного комплекса — nifDHK (Tang et al., 2011). В свою очередь, у трех штаммов О. trichoides был обнаружен ген nifH (Turova et al., 2006). Кластер генов nifHBDK был обнаружен в геномах Roseiflexus sp. RS-1 и R. сastenholzii (van der Meer et al., 2010). Однако не были выявлены гены, ассоциированные со сборкой и функционированием нитрогеназного комплекса, что согласуется с отсутствием нитрогеназной активности.

Глава 2. Филогенетическое и функциональное разнообразие АНФБ в гидротермальных источниках Основная жизненная форма АНФБ — прикрепленные микробные обрастания и микробный мат.

Так, бактерии родов Chloroflexus и Roseiflexus являются важным компонентом микробного сообщества цианобактериальных матов горячих источников (Hanada, 2014). Бактерия «Candidatus Chlorothrix halophila» обитает в так называемом гиперсоленом микробном мате (Pierson et al., 1994; Klappenbach, Pierson, 2004). Виды рода Oscillochloris, а также бактерия «Candidatus Chloroploca asiatica» были описаны в составе микробных обрастаний (Горленко, Пивоварова, 1977; Горленко, Коротков, 1979, Gorlenko et al., 2014). Изоляты Oscillochloris spp. были выделены из матов, образующихся в мезофильной зоне щелочных источников (Калашников и др., 2013). Только для бактерий рода Chloronema описано существование планктонной формы (Дубинина, Горленко 1975; Abella, Garcia-Gil, 1992). В силу того, что данная работа посвящена исследованию термофильных АНФБ, мы рассмотрим разнообразие этих бактерий в составе микробных сообществ гидротермальных источников.

В гидротермальных источниках АНФБ развиваются в составе цианобактериальных матов, в которых они вместе с цианобактериями формируют основной матрикс мата и являются как структурными, так и функциональными эдификаторами сообщества (Doemel, Brock, 1977; Горленко, Бонч-Осмоловская 1989; Ward et al., 1998). В источниках с высоким содержанием сульфида АНФБ (Chloroflexus spp.) могут значительно доминировать над цианобактериями (Skirnisdottir et al., 2000; Kato et al., 2004).

2.1 Филогенетическое разнообразие

Современные представления о разнообразии термофильных АНФБ основаны на результатах выделения и описания бактериальных культур, а также на основании данных, полученных с помощью молекулярногенетических исследований микробных сообществ. Известные на сегодня АНФБ, которые были изучены в бактериальных культурах, были описаны в главе 1. Это бактерии четырех родов: Roseiflexus, Heliothrix, Chloroflexus и Oscillochloris.

Данные о бактериях рода Heliothrix весьма ограниченны. Как было сказано в главе 1, была выделена единственная культура этой бактерии (Pierson et al., 1985). В работе Weller с соавторами была опубликована последовательность этой бактерии, которая хранится в базе данных GenBank под номером L04675 (Weller et al., 1992). При поиске похожих последовательностей в GenBank видно, что на начало 2016 года последовательности, соответствующие филотипу Heliothrix oregonensis, представлены двенадцатью отдельными записями, которые получены в ходе выполнения трех исследований. Эти последовательности имеют уровни сходства с последовательностью L04675 от 99 до 97%. За последовательностью с уровнем сходства 97% в списке результатов поиска сразу идут последовательности, сходные с L04675 на 89%, которые нельзя считать соответствующими бактериями того же рода (Tindall et al., 2010).

Все три выше упомянутые работы посвящены исследованию гидротермальных источников североамериканского национального парка Йеллоустон. Девять последовательностей были получены из термального источника Fairy в ходе реализации проекта «Red Layer Microbial Observatory», нацеленного на изучение бесхлоросомных АНФБ (Boomer et al., 2003). В этом же источнике одна Heliothrix-подобная последовательность была детектирована в ходе исследования процесса формирования цианобактериального мата (Boomer et al., 2009). Еще одна последовательность получена из еще одного йеллоустонского источника «Mammoth» (Fouke et al., 2003). Таким образом, бактерия Heliothrix oregonensis и филогенетически близкие к ней бактерии обнаружены только в северо-америкнских гидротермальных источниках, в источниках Йеллоустона и штата Орегон.

Данные о других бесхлоросомных бактериях, относящихся к роду Roseiflexus, значительно более обширны. Большое внимание разнообразию этих бактерий и их экологической роли было уделено в исследованиях термальных источников Йеллоустона, начиная с первых работ, в которых филотип еще неописанной к тому времени бактерии Roseiflexus spp. был назван «тип-С» (в англоязычной литературе «type-C») (Ward et al., 1990; Ferris et al., 1997). После того, как в 2002 году была описана бактерия Roseiflexus castenholzii, стало ясно, что распространенный в источниках филотип «тип-С» соответствует бактериям рода Roseiflexus (Hanada et al., 2002а).

Бактерия Roseiflexus castenholzii была выделена из японского щелочного источника, бактерия Roseiflexus sp. RS-1 из йеллоустонского щелочного источника (Hanada et al., 2002а; van der Meer et al., 2010). На этом «разнообразие в культурах» заканчивается. Гораздо больше известно о филогенетическом разнообразии бактерий рода Roseiflexus — о разнообразии Roseiflexus-подобных филотипов известно благодаря молекулярногенетическим исследованиям на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК. Причем, во многих исследованиях бактерии Roseiflexus spp. не являлись целевой группой, а просто были отмечены в качестве одного из элементов сообщества. Так, Roseiflexus-подобные филотипы были обнаружены в гидротермах Йеллоустона (Boomer et al., 2002; Boomer et al., 2009; Nbel et al., 2002; Spear et al., 2005) и Японии (Everroad et al., 2012) Камчатки (Акимов и др., 2013; Burgess et al., 2012), Таиланда (Portillo et al., 2009), Центрального Тибета (Lau et al., 2009; Lau, Pointing, 2009), Чили (Engel et al., 2013), Аргентины (Urbieta et al., 2015), Болгарии (Tomova et al., 2010). Кроме того, Roseiflexusподобные филотипы выявляют в горячих источниках с помощью высокопроизводительного секвенирования (Klatt et al., 2013, Len et al., 2013).

Таким образом, можно говорить о глобальном распространении Roseiflexus spp., множество филотипов которых распространены в различных гидротермах мира.

Все описанные на сегодня термофильные хлоросом-содержащие АНФБ объединены в род Chloroflexus (Hanada, 2014). Разнообразие этих бактерий наиболее изучено, т. к. это был первый организм среди АНФБ, привлекший внимание исследователей. Еще до распространения молекулярно-генетических методов Pierson и Castenholz исследовали разнообразие Chloroflexus spp., выделив штаммы из множества источников Северной и Центральной Америки, Японии, Исландии и Новой Зеландии (Pierson, Castenholz, 1974). Из-за схожести морфологических и физиологических свойств они были описаны как штаммы бактерии Chloroflexus aurantiacus. Однако после получения нуклеотидных последовательностей стало ясно, что некоторые штаммы имеют значительные генетические отличия (см. Рисунок 1). Тем ни менее, штаммы так и не были описаны как отдельные виды.

Кроме вида C. aurantiacu,s был описан вид C. aggregans, работу со штаммами которого вели японские исследователи. Типовой штамм бактерии C.

aggregans – MD-66 был выделен из японского источника «Okukinu Meotobuchi»

префектуры «Tochigi». Еще один штамм YI-9 был выделен из источника «Yufuin» префектуры «Oh-ita» (Hanada et al., 1995б).

Интересно, что C. aggregans не имеет широкого распространения даже в термальных источниках японских островов. Так, Hanada с соавторами исследовали 41 термальный источник, в результате чего были выделены только два выше описанных штамма этой бактерии (Hanada et al., 1995а). В противоположность этому, множество штаммов бактерии C. aurantiacus выделено из гидротерм Северной Америки, Исландии и Новой Зеландии (Hanada et al., 1995а; Pierson, Castenholz, 1974а). Эта бактерия была обнаружена в гидротермах всего мира посредством молекулярно-генетических методов исследования микробных сообществ. Судя по всему, этот вид проявляет самый широкий космополитизм среди термофильных представителей АНФБ.

Хотя было описано только два вида, на сегодня доступны полногеномные последовательности для пяти штаммов: Chloroflexus sp. Y-396-1, Chloroflexus sp. Y-400-fl, Chloroflexus sp. MS-G, C. aurantiacus DSM 635 и C. aggregans DSM 9485.

Кроме штаммов, выделенных Pierson и Castenholz, большое количество термофильных штаммов бактерий Chloroflexus spp. было выделено сотрудниками Института микробиологии РАН им. С.Н. Виноградского из термальных источников Камчатки (штамм UZ) и Бурятии (штамм В-3) (Красильникова и др., 1986).

2.2 Функциональное разнообразие

Уже было отмечено, что практически во всех гидротермальных экосистемах можно встретить АНФБ и, порой, их развитие достигает значительной величины. Этот факт указывает на существование определенной экологической значимости этой группы бактерий в термофильном микробном сообществе. Было показано, что в цианобактериальном мате горячего источника почти половина белкового пула синтезируется этими бактериями (Schaffert et al., 2012). Функциональное разнообразие различных представителей АНФБ определяется их ролью в круговороте углерода и серы.

Также отдельно можно выделить структурообразующую функцию АНФБ для микробного сообщества матов. Из-за нитчатого строения и способности образовывать чехлы АНФБ формируют микробный «войлок», обеспечивающий прикрепление к твердому субстрату и основу для развития одноклеточных бактерий.

2.2.1 Превращение углерода Как фототрофные бактерии, АНФБ прежде всего рассматривались в роли как возможных первичных продуцентов. Действительно, после описания способности бактерии C. aurantiacus к фотоавтотрофному росту стало очевидно, что эта бактерия может выполнять функцию продуцента в анаэробных условиях (Madigan, Brock, 1975). Позже было описано, что в сульфидном источнике «Mammoth» при отсутствии цианобактерий природная популяция бактерий Chloroflexus spp. осуществляет сульфид-зависимый аноксигенный фотосинтез в составе мата (Giovannoni et al., 1987). В подтверждение к этому выводу, на основе результатов анализа изотопного состава было установлено, что в высокосульфидном исландском источнике бактерии Chloroflexus spp. осуществляют преимущественно автотрофный рост (van der Meer et al., 2008) Таким образом, в высокосульфидных горячих источниках, в которых описаны маты с доминированием Chloroflexus spp.

(Skirnisdottir et al., 2000; Kato et al., 2004), эти бактерии могут выполнять функцию основных первичных продуцентов сообщества.

В естественных условиях бактерии Heliothrix oregonensis и Roseiflexus spp. всегда развиваются вместе с цианобактериями в составе мата (Pierson et al., 1985; Boomer et al., 2002; Hanada, 2003). Выделенные штаммы этих бактерии не были способны к фиксации углерода в лабораторных условиях (Hanada et al., 2002а; van der Meer et al., 2010). Однако в результате исследования протеома цианобактериального мата из горячего источника «Octopus» было установлено, что природная популяция бактерий Roseiflexus spp. синтезирует ряд ферментов 3-гидроксипропионатного цикла (Schaffert et al., 2012). Анализ посуточного изменения уровней экспрессии генов метаболизма углерода у АНФБ в мате горячего источника «Mushroom» подтвердил результаты протеомного анализа.

Было установлено, что у бактерий Roseiflexus spp. происходит экспрессия генов 3-гидроксипропионатного цикла, причем пик активности приходится на утреннее время (Klatt et al., 2013). Эти результаты подтвердили результаты, полученные на основе экспериментов с меченым углеродом, указывающие на наибольшую активность аноксигенного фотосинтеза в утреннее сумеречное время (van der Meer et al., 2005).

Вклад бактерий Roseiflexus spp. в суммарную первичную продукцию мата меньше, чем у цианобактерий, хотя и в утренние часы их вклад сопоставим (van der Meer et al., 2005, 2007). Согласно результатам метатранскриптомного, протеомного и метаболомного анализа сообщества цианобактериального мата было предположено, что Roseiflexus spp. вместе с цианобактериями играют ключевую роль в фотоасимиляции солнечной энергии для сообщества мата и в процессах превращения углерода (Schaffert et al., 2012; Liu et al., 2011; Klatt et al., 2013; Kim et al., 2015). Согласно предложенной Klatt с соавторами модели, природная популяция бактерий Roseiflexus spp. переходит с фотомиксотрофного метаболизма при солнечном освещении на ферментацию запасенного гликогена ночью (Klatt et al., 2013). Аккумуляция гликогена происходит днем в ходе фотомиксотрофного метаболизма, при котором бактерии Roseiflexus spp. ассимилируют углекислоту, продукты фотодыхания цианобактерий (гликолат) и накопившиеся в течение ночи продукты ферментации. В утренние часы, благодаря созданию анаэробных условий, возможен фотоавтотрофный метаболизм. На рисунке 3 приведена схема суточной смены метаболизма углерода у АНФБ в сообществе. Таким образом, одна из функций бесхлоросомных АНФБ заключается в утилизации низкомолекулярных органических соединений, образующихся как побочный продукт в результате метаболизма цианобактерий.

Рисунок 3. Схема суточного переключение углеродного метаболизма АНФБ в сообществе цианобактериального мата гидротермального источника «Mushroom».

2.2.2 Превращение серы В разделе 1.2.4 было отмечено, что бактерия Chloroflexus aurantiacus способна окислять сульфид до молекулярной серы в культуре (Madigan, Brock, 1975). Способность образовывать серу при фотоавтотрофном росте наблюдали и у природной популяции Chloroflexus spp. (Giovannoni et al., 1987). Для бесхлоросомных АНФБ такой способности не описано. Поэтому, после обнаружения активной транскрипции генов дегидрогеназного комплекса в природной популяции Roseiflexus spp., было выдвинуто предположение о том, что водород может служить источником электронов для этих бактерий в ходе процесса ассимиляции неорганического углерода (Klatt et al., 2013).

В цианобактериальном мате термальных источников сульфид может быть биогенного и абиогенного происхождения. Последний случай имеет место в сульфидных источниках, таких как «Octopus». Биогенный сульфид образуется в мате в результате активности сульфатредуцирующих бактерий, участвующих в деструкции биомассы в нижнем слое мата (Doemel, Brock, 1977).

Kubo с соавторами провели анализ активности процессов окисления сульфида, сульфат- и сероредукции, а также определили филогенетический состав бактерий серного цикла и их вертикальное распределение в цианобактериальном мате японского гидротермального источника «Nakabusa»

(Kubo et al., 2011). На основании полученных данных авторы составили гипотетическую схему превращения серы в это мате. На рисунке 4 приведена схема, созданная на основе схемы Kubo и соавторов. В исследованном мате АНФБ были представлены популяцией Chloroflexus spp., филогенетически близкой к бактерии C. aggregans. Ранее описанные в культуре штаммы этой бактерии не проявляли способности окислять сульфид и расти фотоавтотрофно (Hanada et al., 1995б). Однако в экспериментах Kubo с соавторами выявлено, что природное сообщество мата, в котором природная популяция C. aggregans доминирует, окисляет сульфид, причем только на свету в присутствии бикарбоната (Kubo et al., 2011). На основании этих наблюдений можно свормулировать предположение относительно экологии бесхлоросомных АНФБ. Так как культивируемые штаммы C. aggregans не проявляли способности к окислению сульфида, но в природной популяции оно происходило, то можно предположить, что и природная популяция бактерий Roseiflexus spp. также способна к окислению сульфида, хотя прямых измерений активности еще небыло сделанно. В целом АНФБ можно рассматривать как светозависимых аноксигенно сероокисляющих бактерий.

Рисунок 4. Превращение серы в сообществе цианобактериального мата источника «Nakabusa» и роль АНФБ в этих процессах.

Изображение сделано на основе схемы приведенной в работе Kubo et al., 2011.

Существует гипотеза, что толерантность АНФБ к сульфиду и способность некоторых из них осуществлять его окисление может обуславливать защитную функцию этих бактерий по отношению к цианобактериям сообщества мата, чувствительным к токсическому действию сульфида (Намсараев и др.. 2006). Это объясняет, почему в сульфидных термальных источниках слой бактерий Chloroflexus spp. развивается над слоем цианобактерий, защищая последних от воды, содержащей сульфид (Jrgensen, Nelson, 1988; Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989). Таким образом, можно говорить о защитной функции АНФБ в цианобактериальном сообществе.

Глава 3. Филогеография прокариот

В микробиологии проблема распространения и расселения микроорганизмов в биосфере Земли долгие годы рассматривалась лишь в свете экологического подхода, который резюмировала гипотеза Баас-Бекинга:

‘Everything is everywhere, but, the environment selects’ (De Wit, Bouvier, 2006), то есть, микроорганизмы потенциально способны обитать везде, и только конкретные экологические условия определяют, какие организмы обитают в той или иной экосистеме. Это было обусловлено общераспространенными представлениями о большом потенциале микроорганизмов к расселению и огромном размере популяций (Finlay, Clarke, 1999). Таким образом, любые микроорганизмы рассматривались как вездесущие агенты, которые можно найти в любой благоприятной экологической нише вне зависимости от ее расположения на Земле.

Однако последние двадцать лет стало появляться все больше данных указывающих, что распределение микроорганизмов в ландшафте носит не случайный характер и обусловлено не только экологическими, но и географическими/историческими факторами (Martiny et al., 2006; Lindstrom, Langenheder, 2012). Новые данные заставили иначе взглянуть на проблему микробного расселения, и этот новый взгляд хорошо обобщил van der Gast, перефразировав гипотезу Баас-Бекинга: «some things are everywhere and some things are not. Sometimes the environment selects and sometimes it doesn’t» (van der Gast, 2015). То есть, вездесущность микроорганизмов не является непреложным законом, и не всегда наблюдаемая структура микробного сообщества или структура генетического разнообразия вида определена лишь условиями среды.

Рост интереса к проблеме микробного расселения и накопившиеся новые данные привели к формированию нового направления в микробиологии — микробной биогеографии, для которого в последнее время идет быстрое концептуальное оформление (Hanson et al., 2012).

Микробная биогеография, как и биогеография животных и растений, рассматривается как концептуальная база при изучении механизмов, лежащих в основе эволюции организмов, в частности, при образовании новых таксонов (Martiny et al., 2006; Hanson et al., 2012).

Влияние географической разобщенности популяций непатогенных микроорганизмов на их генетическую структуру было показано при изучении экстремофильных прокариот. Так, одна из первых работ, убедительно показывающая влияние географической разобщенности на генетическую структуру группы бактерий, была посвящена исследованию эндемичных популяций гипертермофильных архей рода Sulfolobus (Whitaker et al., 2003).

Другая пионерская работа была посвящена филогеографии термофильных цианобактерий (Papke et al., 2003). В отличие от работы Papke с соавторами, в первой работе кроме филогенетического анализа была проведена статистическая обработка. Последнее позволило достоверно выявить корреляцию между генетической дивергенцией популяций и их географической дистанцией, и в тоже время отсутствие корреляции между генетической дивергенцией и условиями среды (Whitaker et al., 2003).

Облигатно термофильные прокариоты являются стенобионтными организмами, способными расти в весьма специфических условиях термальных экосистем, которые на поверхности современной земли не являются основными местами обитания, а скорее имеют спорадическое распределение. Экосистемы горячих источников являются своего рода островами в современной не термальной биосфере. Очевидно, это обусловливает механизм «островного эффекта», влияющего на генетическую структуру видов термофильных прокариот, «запертых» в гидротермах. Известно, что чем уже экологические возможности микроорганизмов, тем больше проявление эндемизма (Barbern et al., 2014). Поэтому некоторые авторы рассматривают островной эффект как значимый механизм для бактериального видообразования (Hreggvidsson et al.,

2012) у термофильных микроорганизмов. В поддержку такого взгляда существует целый ряд работ. Так, локальные популяции были выявлены для гипертермофильных архей рода Pyrococcus (Escobar-Paramo et al., 2005), а также при исследовании филогеографии гена аммония-монооксидазы amoA у термофильных архей (Zhang 2008). Проявление эндемизма было обнаружено для популяций термофильных цианобактерий рода Mastigocladus (Miller et al., 2007). В тоже время, при исследовании мезофильных цианобактерий островной эффект не обнаруживается (van Gremberghe et al., 2011). В этой работе было проанализированно 311 последовательностей внтуренних траскребируемых участков рибосомальных опиронов пресноводной цианобактерии Microcystis aeruginosa, штаммы которой были полученны в Европе, Азии, Африки, Океании Южной и Северной Америки. Не исключено, что полученный результат обусловлен разрешающей способностью выбранного генетического маркера.

Стоит ожидать, что островной эффект действует и в отношении других групп экстремофильных прокариот. Так, проявление эндемизма было отмечено при исследовании галотолерантных изолятов бактерий рода Thioalkalivibrio (Foti et al., 2006) и рода Nocardiopsis (He et al., 2015).

Островной эффект в вышеописанных случаях является результатом естественно сформировашихся условий, однако в наше время на филогенетическую труктуру свободноживущих микроорганизмов может влиять антропогенный фактор. Человек может служить вектором обуславливающим миграцию из одного естественно изолированной популяции в другую. Это важно учитывать при итропретации результатов филогеографического анализа.

Так в разарботанной Cohan филогеографической модели бактериального видообразование этот фактор был назван «эффект Боинга» (Cohan, Perry, 2007).

Само это название отражает, что глобально занчение этот фактор получил лишь во вторую половину двадцатого века с развитием и масовым применением быстрых способов транспортировки на дальние растоняия.

Выше рассматриваемые работы используют подход, основанный на сопоставлении результатов филогенетического анализа и географии мест выделения исследуемых объектов. Этот подход используется в такой дисциплине как филогеография, которая развилась в рамках исторической зоогеографии благодаря внедрению методов молекулярно-генетического анализа (Avise, 1998). Несмотря на то, что термин «филогеография» возник среди зоологов, его используют и в микробиологических исследованиях, т. к., прежде всего, он отражает методологический подход, который применим как к макро-, так и к микроорганизмам.

Таким образом, филогеографию микроорганизмов стоит рассматривать как направление более общей дисциплины — микробной биогеографии, к которой можно отнести работы, посвященные изучению влияния факторов пространственного распределения, совместно с экологическими факторами, на структуру микробных сообществ. В таких работах, в отличие от филогеографических исследований, рассматривается структура филогенетически гетерогенных сообществ, а не структура монофилитичных популяций. Примером может служить работа Pagaling с соавторами, в которой было установлено влияние как экологических условий, так и географической удаленности мест исследования на бактериальный состав микробного сообщества соленых озер (Pagaling et al., 2009).

В работе Pagaling с соавторами установлено, что географическая удаленность озер не оказывает влияние на архейный состав сообщества. Часто состав микробного сообщества определяется главным образом влиянием экологических условий (Logares et al., 2013; Headd и Engel, 2014), а структура сообщества определяется пространственной структурой распределения экологических факторов (Wang 2015). Это обнаруживается даже для относительно изолированных экосистем, таких как горячие источники (Magnabosco et al., 2014). Из этого следует, механизмы формирования микробного сообщества соответствуют гипотезе Баас-Бекинга. Хотя не исключено, что полученные результаты обусловлены недостаточной разрешающей способностью выбранных признаков сравнения.

Заслуживают отдельного внимания результаты, полученые при исследовании филогеографии ряда термофильных бактерий. Takacs-Vesbach с соавторами изучали распределение филотипов йеллоустонской популяции бактерий Sulfurihydrogenibium spp. в термальных источниках старой и новой кальдеры Йеллоустона (Takacs-Vesbach et al., 2008). Сама долина парка Йеллоустоне образовалась в результате извержений, случившихся поочередно 2 миллиона лет назад и 640 тысяч лет назад. Анализ, проведенный авторами, выявил, что статистически достоверная разница флогенетического состава, наблюдается только между источниками старой и новой кальдеры. На основании проведенного исследования авторы выдвинули предположение, что в генетической структуре современной популяции бактерий Sulfurihydrogenibium spp. отражено геологическое событие (извержение), приведшее к изоляции популяций.

Эти исследования интересны как примеры геологической интерпретации результатов, получаемых при филогеографическом исследовании структуры современных микробных популяций. Такой подход наиболее возможен в отношении термофильных микроорганизмов, активность которых жестко связана с гидротермальными экосистемами. При этом важным преимуществом является относительно хорошая изученность истории геологической активности, которая, в свою, очередь определяет гидротермальную активность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

–  –  –

В данной работе были исследованы образцы из 5 термальных щелочных источников Байкальской рифтовой зоны: Алла, Гарга, Гусиха, Уро и Ценхер. Из них первые четыре источника находятся в пределах Баргузинской долины (Республика Бурятия, Россия). Источник Ценхер расположен на нагорье Хангай (Центральная Монголия). Образцы представляли собой фрагменты микробных матов. Забор образцов из источников проходил в августе-сентябре в ходе экспедиционных работ в 2011 и в 2012 году. В таблице 2 приведены основные физико-химические параметры мест отбора образцов, а также названия проб.

Был исследован образец мата из термального источника Термофильный (Камчатка). Мат отобран в 2012 году. Образец любезно предоставлен к.б.н.

Ольгой Леонидовной Ковалевой (Институт микробиологии им. С.Н.

Виноградского Российской академии наук) Также был исследован образец из гейзера Строккур (анг. Strokkur), расположенный в Исландии. Образец представлял собой водно-песочную суспензию, отобранную в 2013 году из гейзерного бассейна гейзера Строккур.

Образец был отобран и любезно предоставлен Николаем Александровичем Демиденко (Государственный океанографический институт им. Н.Н. Зубова).

При заборе образцы матов были помещены в стерильные пластиковые пробирки на 50 мл, в которых они были транспортированы в лабораторию.

Далее пробирки с образцами хранили при температуре 4С. Температура и значение рН среды в месте отбора пробы измерялись с помощью портативного рН-метра «HI 8314» (HANNA, Румыния).

–  –  –

Глава 5. Микробиологические методы исследования

5.1 Состав питательной среды и условия культивирования Получение первичной культуры хлоросом-содержащих АНФБ проводили на питательной среде для Chloroflexus spp. следующего состава (г/л): KH2PO4 – 0.5; NH4CI – 0.5; MgCI2 – 0.3; KCI – 0.5; NaCI – 0.5; Na2S2O3 – 0.1 CaCI2 2H2O – 0.3; комплекс витаминов – 1.0 мл (каждого из трех растворов); комплекс микроэлементов – 1.0 мл; HEPES – 3.0; NaHCO3 – 0.5 г; Na2S 9H2O – 0.3 г;

дрожжевой экстракт – 0.1 г; ацетат натрия – 0.5 г; малат натрия – 0.5 г.

Комплекс микроэлементов готовили по Пфеннигу (Pfennig, Lippert, 1966).

Состав комплекса микроэлементов (г/л): Трилон В – 5.0; FeSO4 6H2O – 2.0;

ZnSO4 7H2O – 0.1; MnCl2 4H2O – 0.03; H3BO3 – 0.3; CoCl2 2H2O – 0.2; CuCl2 2H2O – 0.03; NiCl2 6H2O – 0.02; Na2MoO4 2H2O – 0.03. Значение pH доводили до 3.0 – 4.0.

–  –  –

При получении первичной накопительной культуры АНФБ в среду перед использованием добавляли гербицид Диурон (N-(3,4-Дихлорфенил)-1,1Диметилмочевина, 7 мМ) для подавления развития оксигенных фототрофов.

Питательную среду стерилизовали 30 мин при 1 атм Отдельно стерилизовали CaCI2 2H2O; NaHCO3; Na2S 9H2O; ацетат натрия; малат натрия (5% растворы) в течение 30 мин при 1 атм и добавляли в среду перед использованием. Комплекс витаминов и микроэлементов стерилизовали фильтрованием через бактериологические фильтры с диаметром пор 0.2 мкм.

Для получения плотной среды использовали бактериологический агар (финальная концентрация агара 0.6%). Агар готовили в виде 2% раствора, разливали по 3 мл в пробирки с ватно-марлевыми пробками. Пробирки с агаром автоклавировали при 1 атм. Перед использованием агар расплавляли на водяной бане при 87°С, после чего в пробирки добавляли 9 мл готовой питательной среды.

Для получения первичных накопительных культур значение рН среды доводили до 8.0. Культивирование проводили при температурах 45, 50 и 54°С под постоянным освещением.

–  –  –

Для исследования морфологии клеток как в бактериальной культуре, так и в природном образце использовали фазово-контрастный световой микроскоп «Оlympus BX-41» (Оlympus, Япония). Фото-документацию вели с помощью оптической насадки «С5060 – ADU» (Olympus, Япония), цифрового фотоаппарата «С-7070» (Olympus, Япония) и программного обеспечения «ImageScope Lite» (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия) Строение клеток изучали с помощью электронного микроскопа «JEM100C» (JEOL, Япония). Для электронной микроскопии готовили препараты клеток методом негативного контрастирования в 2% фосфорновольфрамовой кислоте. Строение клеточной стенки выделенных бактерий изучали с помощью ультратонких срезов. Для этого материал фиксировали в 2.5% глутаровом альдегиде, приготовленном на 0.05М какодилатном буфере.

Дофиксацию проводили методом Келленберга-Ритера (Kellenberger, 1958).

Обезвоживание образцов проводили в серии разведений этанола. После финального погружения в 100% этанол, материал переносили в ацетон, после чего их заключали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы готовили на микротоме «KLB-4800». Контрастирование проводили по методу Рейнольдса (Reynolds, 1963).

5.3 Определение пигментов клеток

Основные фотосинтезирующие пигменты клеток выделенных культур, а также цианобактериальных матов определяли с помощью спектрофотометра «СФ-56» (ОКБ “Спектр”, Россия), на котором измеряли спектры поглощения пигментных экстрактов и пигментов in vivo (препарат клеток в глицерине).

Экстракцию пигментов из бактериальной биомассы проводили ацетонметанольной смесью (2:7) в течение суток в темноте при температуре 4С.

Состав каротиноидов клеток штамма isl-2 был определен к.б.н.

Ашихмином А.А. (Институт фундаментальных проблем биологии РАН) с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано ранее (Moskalenko et al., 1995).

5.4 Получение чистой культуры

Чистую культуру штамма isl-2 получили с помощью метода предельных разведений. Для этого первичную накопительную культуру бактерий разбавляли в серии разведении (до 5 разведений) и использовали каждое разведение для посева в агаризованую среду, состав которой приведен в разделе 5.1. Из максимального разведения, в котором выросли колонии, отбирали самую маленькую колонию в нижнем слое агарового столбика. Для этого разрезали пробирку поперек вблизи выросшей колонии. Отобранную колонию растирали в пустой стерильной пробирке и использовали для следующей серии разведений и посева в питательную среду. Процедуру повторяли до получения чистой культуры. Чистоту контролировали с помощью микроскопирования и отсутствия роста гетеротрофных бактерий в использованной для культивирования среде.

5.5 Изучение физиологии штамма isl-2

Оптимальная температура роста культуры была определена с помощью градиентного твердотельного термостата (изготовлен в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН).

Оптимальное для роста значение рН среды определяли при инкубации посевов с разными значениями рН на свету при температуре 55°С.

Для определения субстратов используемых штаммом isl-2 была использован раствор солей следующего состава (г/л): KH2PO4 – 0.5; NH4CI – 0.5; MgCI2 – 0.3; KCI – 0.5; NaCI – 0.5; Na2S2O3 – 0.1 CaCI2 2H2O – 0.3;

комплекс витаминов – 1.0 мл (каждого из трех растворов); комплекс микроэлементов – 1.0 мл; HEPES – 3.0. В раствор солей добавляли соответствующие тестируемые субстраты. Конечное значение рН устанавливали 7.5. Для контроля восстановленности среды использовали резазурин. Инкубация проходила при температуре 55°С на свету. Субстратный спектр был изучен в трех условиях культивирования: анаэробные условия на свету и в темноте, аэробные условия в темноте. В первых двух случаях использовались пенициллиновые флаконы (объем 25 мл) с резиновыми пробками. Для создания анаэробиоза в среду вносили сульфид натрия с конечной концентрацией в среде 100 мг/л. В случае с аэробными условиями в такие же вносили среду в объеме 5 мл. Пенициллиновые флаконы закрывали ватными пробками, прикрытыми фольгой для предотвращения высыхания.

Были протестированы следующие субстраты: глутамат, аспартат, глицинглицил, ацетат, пируват, лактат, сукцинат, малат, бутрират, цитрат, глюкоза, фруктоза, маннитол, метанол, этанол, глицерол, дрожжевой экстракт, казаминовые кислоты, НСО3, соетон, гидролизат казеина, сахароза. Эффект субстратов на рост культуры определяли с помощью измерения оптической плотности выросшей культуры. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре КФК-3 (ЗОМЗ, Россия) при длине волны 650 нм.

5.6 Изучение хемотаксономических свойств штамма isl-2 ГЦ-состав ДНК клеток штамма isl-2 был определен к.б.н. Е.Н. Детковой.

(Институт Микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН) с помощью метода температурной денатурации/реассоциации (Owen et al., 1969). Геномная ДНК для этого анализа была выделена с помощью метода, описанного Marmur (Marmur, 1961).

Состав жирных кислот клеток был определен д.б.н Г.А. Осиповым (Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева) согласно следующей методике: 30 мг биомассы высушивали в токе инертного газа при 80°С и обрабатывали в 0.4 мл 1 N соляной кислоты в метаноле при 80°С в течение 3 часов. Затем проводили экстракцию гексаном. Полученный экстракт упаривали, а сухой остаток растворяли в 20 мкл Бис(триметилсилил)трифторацетамид-N,O 15 мин при 80°С. Препарат анализирвали с помощью хромато-масс-спектрометра «AT-5975» (Agillent technologies, США). Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленого кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0.25 мм.

Состав хинонов клеток был определен Б.П. Баскуновым (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН). Для этого влажные клетки разрушали путем их растирания в ступке с жидким азотом, затем экстрагировали холодным ацетоном и хроматографировали (ТСХ) в системе гексан-диэтиловый эфир (85:15). Наблюдаемые полосы поглощения в УФ-свете с Rf 0.65-0.75 соответствовали менахинонам, тогда как полосы с Rf 0.2-0.3 – убихинонам. Анализ элюата выполняли на тандемном массспектрометре «LCQ ADVANTAGE MAX» (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием источника химической ионизации при атмосферном давлении (APCI).

Глава 6 Молекулярно-генетические методы исследования

–  –  –

Выделение тотальной ДНК из образцов матов и из культур проводили по методике описанной Wilson K. (Wilson K., 2001) с модификациями.

Модифицированная методика представлена ниже (СТАВ-метод):

1. Перенесли 100 мг пробы в стерильную пробирку на 1.7 мл

2. Добавили 400 мкл ТЕ-буфера (0.1 М Tris-HCI, 20mM ЭДТА, pH 8.0и 25 мкл 10% SDS.

3. Гомогенизировали с помощью гомогенизатора «RW16 basic» (Kika Labortechnic, Германия).

4. Добавили 20 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали 60 минут при 37°С.

5. Добавили 125 мкл 4М NaCl и 160 мкл CTAB-буфера (5% CTAB,

0.35 M NaCI).

6. Добавили 20 мкл РНКазы (10 мг/мл) и инкубировали 10 минут при 65°С

7. Остудили до комнатной температуры, добавили 700 мкл хлороформа (100%) и перемешали.

8. Центрифугировали 10 минут при 10800 g для разделения фаз.

9. Перенесли 600 мкл верхней фазы в новую пробирку, добавили 600 мкл хлороформа и перемешали.

10. Центрифугировали 10 минут при 10800 g.

11. Перенесли верхнюю фазу в новую пробирку.

12. Добавили изопропанол (0.6 объёма от жидкости в пробирке), встряхнули в руках, инкубировали 40 минут при 4°С.

13. Центрифугировали 10 минут при 10800 g.

14. Удалили супернатант.

15. Промыли 250 мкл 70% этанола (из морозильной камеры).

16. Отобрали этанол пипеткой, осадок ДНК высушили.

17. Добавили 50 мкл стерильной деионизированной воды.

18. Инкубировали 30 минут при 37С для растворения геномной ДНК.

19. Хранили препарат ДНК при температуре - 20С.

Концентрацию и качество выделенной ДНК оценивали с помощью спектрофотометра «SmartSpec 3000» (BIO-RAD, США).

6.2 Амплификация фрагментов исследуемых генов

Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 1x буфер полимеразы «BioTaq» (2 mM MgCl2; 17 мМ (NH4)2SO4;

67мМ Трис-HCl, pH 8,8), по 6 нмоль каждого из дНТФ, 20 нг ДНК-матрицы, по

6.25 пмоль прямого и обратного праймеров и 1,5 ед. «BioTaq DNA» полимеразы (Диалат ЛТД, Россия). ПЦР с помощью термоциклера «Mastercycler gradient»

(Eppendorf, Германия).

Для идентификации АНФБ в природных образцах и накопительных культурах были использованы праймерные группоспецифические системы для гена 16S рРНК и оперона pufLM. Данные праймерные системы были использованы для ПЦР и для последующего секвенирования полученных продуктов. Характеристика праймерных систем представлена в таблице 3.

Температурно-временной профиль ПЦР для праймерной системы Cfl68f/Cfl1231r: первый цикл - 94оС 9 мин, 55оС 1 мин, 72оС 1 мин;

последующие 35 циклов - 94оС 1 мин, 55оС 1 мин, 72оС 2 мин;

окончательная полимеризация - 72оС 7 мин.

Температурно-временной профиль ПЦР для праймерной системы GreenpufF/ GreenpufR: первый цикл - 94°С 2 мин, 56°С 30 с, 72°С 1 мин 30 с; последующие 42 цикла - 94°С 30 с, 56°С 30 с, 72°С 1 мин 30 с;

завершающий цикл - 72°С 5 мин.

Температурно-временной профиль ПЦР для праймерной системы Rof97f/Rof940r: первый цикл - 94оС 9 мин, 58оС 1 мин, 72оС 1 мин;

последующие 35 циклов - 94оС 1 мин, 58оС 1 мин, 72оС 2 мин;

окончательная полимеризация - 72оС 7 мин.

Температурно-временной профиль ПЦР для праймерной системы Rofpuf46f/Rofpuf1354r: первый цикл - 94оС 2 мин, 58оС 30 с., 72оС 1 мин 30 с.; последующие 42 циклов - 94оС 30 с., 58оС 30с., 72оС 1 мин 30с.;

окончательная полимеризация - 72оС 5 мин.

Таблица 3 – Использованные группоспецифические праймеры.

Целевая Праймерная Размер Маркер Последовательности праймеров Ссылки группа систем ампликона

–  –  –

Оценку качества продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1% агарозном геле в 1х ТАЕ-буфере (40 mM Трис; 20 mM ацетат; 1 mM ЭДТА, pH 7.4). Документирование результатов электрофореза проводили при помощи системы «BioDoc II» (Biometra, Германия). Для анализа отбирали 3 мкл реакционной смеси и добавляли 1 мкл краски (50% глицерина, 6х ТАЕ буфер (0.24 М трис-ацетат; 0.006 М ЭДТА), 0.025% бромфеноловый синий; 0.025% ксилен-цианол). В качестве стандарта размеров фрагментов использовали маркер молекулярной массы ДНК «1 kb plus DNA ladder» (Fermentas, Литва).

6.4 Очистка ПЦР-фрагментов

ПЦР-продукты очищали от примесей и неспецифичных продуктов реакции при помощи электрофореза в 0,8% агарозе. По окончании электрофореза гель освещали длинноволновым ультрафиолетом и вырезали фрагменты геля, содержащие ПЦР-продукты соответствующей длины.

Вырезанные фрагменты геля очищали с помощью набора «PCR-Wizard purification Kit» (Promega, США), согласно инструкции производителя.

Очищенные ПЦР-продукты хранили при -20°С.

6.5 Секвенирование ДНК

Секвенирование проводили с использованием уникального научного оборудования ЦКП «Биоинженерия», ФИЦ Биотехнологии РАН. Был задействован автоматический генетический анализатор «DNA Analyzer 3730»

(Applied Biosystems, США) с использованием набора реактивов «BigDye Terминator v3.1 Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, США), согласно инструкции производителя.

6.6 Клонирование ПЦР-фрагмента Для анализа состава микробного сообщества ПЦР-фрагменты гена 16S рРНК клонировали при помощи набора реактивов «pGEM-T Easy System»

(“Promega”, США) в штамм DH10B E. coli. В качестве векторной системы использовали вектор «pGEM-T Easy Vector System I» (Promega, США).

Лигирование проводили в 20 мкл лигазной смеси следующего состава: 1 х Т4 ДНК лигазный буфер (30 мМ трис-HCl, pH 7.8; 10 мМ MgCl2; 10 мМ дитиотриэтола (ДТТ); 1 мМ аденозинтрифосфата (АТФ); 5% полиэтиленгликоля (ПЭГ6000); 50 нг вектора pGEM-T, 3 ед. Т4-ДНК лигазы, 20 о мкг ПЦР-продукта. Смесь инкубировали ночь при 4 С. Затем смесь обрабатывали с помощью хлороформа. Полученной ДНК трансформировали компетентные клетки методом электропорации с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf (США). Клетки рассевали на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 50 ед/мл ампициллина, 50мкг/мл изопропил-D-тиогалактопиранозида (IPTG) и 40 мкг/мл х-галактозы (X-GAL) и инкубировали ночь при 37оС. Колонии, содержащие вставку (белого цвета), пересевали в жидкую среду LB, выращивали в течение ночи при 37оС и из полученной биомассы выделяли плазмидную ДНК.

6.7 Выделение плазмидной ДНК

Биомассу культуры концентрировали центрифугированием и ресуспендировали в 100 мкл буфера I (50 мM трис-HCl, pH 8.0; 10 мМ ЭДТА;

50 мкг/мл панкреатической РНКазы). Далее добавляли 100 мкл буфер II (0.2M NaOH; 1% SDS) и аккуратно перемешивали. Затем добавляли 100 мкл буфер III (2.5 мМ ацетата калия, рН 4.5), также перемешивали и центрифугировали 8 мин при 10000 g. Надосадочную жидкость переносили в чистую микроцентрифужную пробирку, добавляли 200 мкл изопропанола, перемешивали и центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут. Осадок промывали 70% спиртом, высушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл деионизированной воды.

–  –  –

Геномная ДНК была раздроблена на фрагменты длиной 250 п.н. с помощью Covaris S2. Библиотека фрагментов была сделана с помощью наборов NEBNext® DNA Library Prep Reagent Set for Illumina® согласно инструкции производителей. Вставки были секвенированы с помощью секвенатора HiSeq1500 (Illumina, США). Длина чтений составляла 150 п.н.

Было получено 2.82 миллионов чтений, давших 30-кратное покрытие генома бактерии. Чтения были обработаны с помощью программы SPAdes version 3.1.0 (Bankevich et al., 2012). Полученные 125 контигов были проверены на наличие контаминаций с помощью web-сервиса ProDeGe (Tennessen et al., 2015). Финальная геномная последовательность была депонирована в базу данных “National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

6.9 Анализ полученных последовательностей

Полученные de novo последовательности сравнивали с последовательностями базы данных «GenBank» с помощью программы «BLAST» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование и выравнивание последовательностей, выявление открытых рамок считывания и компьютерное транслирование проводили с помощью программы «BioEdit» (Hall, 1999).

Выявление химерных последовательностей проводили с помощью программы «DECIPHER» (Wright et al., 2012). В случае положительного результата, соответствующую последовательность дополнительно проверяли с помощью программы «Pintail 1.0» (Ashelford et al., 2005). Построение дендрограмм проводили с помощью программного пакета «MEGA 5.0» (Tamura et al., 2011).

Идентичность полных последовательностей геномной ДНК бактерии определяли с помощью метода оценки индекса ANI (Average Nucleotide Identity) и метода GGDC (Konstantinidis et al., 2006; Meier-Kolthoff et al., 2013).

Для этого был использован web-сервис «ANI calculator» (Rodriguez-R, Konstantinidis, 2016).

6.10 Географические, физические данные и корреляционный анализ

Данные о значении рН и температуры, а также географическое положение мест выделения Roseiflexus-подобных филотипов были собраны в ходе анализа опубликованной литературы.

Расстояния между местами выделения Roseiflexus-подобных филотипов были рассчитаны по географическим координатам с помощью формулы Винсенти, реализованной в веб-сервисе (http://www.movabletype.co.uk/scripts/latlong-vincenty.html). Корреляцию между генетической дивергенцией Roseiflexus-подобных филотипов и географической разобщенностью мест их выделения, а также значениями рН и температуры в местах их выделения рассчитывали с помощью теста Мантеля, реализованного в программном пакете ecodist (Goslee, Urban, 2007)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

–  –  –

В данной главе представлены результаты изучения разнообразия термофильных АНФБ в ряде гидротерм Байкальской рифтовой зоны с помощью комплексного подхода, включающего использование классических микробиологических методов и методов молекулярной экологии.

Байкальская рифтовая зона (БРЗ) является областью умеренной тектонической активности, которая определяет существование гидротермальных источников на значительной территории Восточной Сибири.

В рамках данной работы БРЗ рассматривается как естественный полигон для изучения разнообразия термофильных АНФБ. Ранее проводившиеся микробиологические исследования гидротерм этого региона были направлены на изучение термофильных микробных сообществ в целом. Из фототрофных микроорганизмов были изучены преимущественно цианобактерии матов (Брянская и др., 2006; Лазарева и др., 2010; Лазарева и др., 2012; Намсараев и др., 2003; Потапова, Брянская, 2008; Потапова и др., 2010; Потапова, 2010;

Устинова, Будагаева, 2014; Шаргаева и др.. 2013). Системного изучения разнообразия АНФБ не проводилось, хотя отмечалось присутствие бактерии Chloroflexus aurantiacus в составе микробного сообщества (Намсараев и др., 2006). В указанных работах не применялись методы молекулярногенетического исследования, что не позволяет говорить о филогенетическом разнообразии АНФБ в изученных источниках. Последнее обстоятельство занижает оценки разнообразия, т.к. термофильные нитчатые бактерии имеют консервативную морфологию, что не всегда позволяет дифференцировать бактерии одного рода.

Обобщая результаты исследований, проведенных ранее, можно предположить, что разнообразие АНФБ в гидротермах Восточной Сибири недооценено, что поднимает перед нами ряд вопросов. Являются ли бактерии рода Chloroflexus единственными представителями этой группы в гидротермах БРЗ? Каково видовое разнообразие бактерий этого рода? Как разнообразие АНФБ в Байкальской рифтовой зоне соотносится с другими областями гидротермальной активности?

7.1 Гены pufLM - генетические маркеры для АНФБ

В исследованиях, сфокусированных на изучении разнообразия определенной физиологической группы бактерий, активно применяются функциональные гены, которые являются молекулярно-генетическими маркерами физиологической функции целевой группы бактерий. Так, для оценки разнообразия аммоний-окисляющих бактерий применяют ген amoA, кодирующий аммоний-монооксигеназу (Rotthauwe et al., 1997), а для оценки разнообразия СО2-фиксирующих бактерий использовали ген cbbL, кодирующий L-субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Videmek et al..

2009). Для исследования разнообразия аноксигенных фототрофных бактерий, имеющих РЦ второго типа, широкое применение получили гены pufL и pufM (Bj et al., 2002; Zeng et al., 2007; Hirose et al., 2012), кодирующие L- и Мсубъединицы реакционного центра (РЦ) в фотореакционной системе фототрофных протеобактерий и АНФБ.

Для оценки разнообразия АНФБ нами были апробированы новые специально разработанные для этого исследования праймерные системы на фрагмент оперона pufLM (конструирование последовательностей праймеров проводила к.б.н. М.В. Сухачева, лаб. молекулярной диагностики). Были использованы две праймерные системы, специфичные для хлоросомсодержащих (GreenpufF/GreenpufR) и бесхлоросомных (Rofpuf46f/Rofpuf1354r) представителей фототрофных Chloroflexi. Первая праймерная система позволяет амплифицировать ПЦР-продукт длиной 1480 пар нуклеотидов (п.н.).

При длине единичного чтения 750-800 нуклеотидов с прямого и обратного праймера, можно получить последовательности L- и M-субъединиц длиной около 260 и 180 аминокислотных остатков (а.м.), соответственно, которые можно использовать в филогенетическом анализе. Вторая праймерная система позволяет амплифицировать ПЦР-продукт длиной 1300 п.н. Длина транслированной аминокислотной последовательности гибридного белка PufLM около 400 а.м.

Для проверки спектра детектируемых АНФБ с помощью праймерной системы GreenpufF/GreenpufR были использованы культуры хлоросомсодержащих АНФБ, доступные в коллекции Лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии им.

С.Н. Виноградского. В пробных экспериментах целевой ПЦР-продукт был получен на ДНК культур Chloroflexus aurantiacus Se-3, Chloroflexus aggregans T-4, Oscillochloris trichoides DG-6, “Candidatus Chloroploca asiatica” и изолята Um-2 (Рисунок 5).

Рисунок 5. Результаты тестирования праймерной системы GreenpufF/GreenpufR.

Обозначения дорожек: 1 - Chloroflexus aurantiacus Se-3, 2

- Chloroflexus aggregans T-4, 3 - Oscillochloris trichoides DG-6, 4 - “Candidatus Chloroploca asiatica”, 5 - изоляте Um-2, 6 - отрицательный контроль, М - маркер 1 kb plus DNA ladder. Стрелка указывает на полосу, соответствующую длине фрагмента в 1500 п.н.

Таким образом, праймеры позволяют детектировать как ранее известных представителей, так и новые группы, что важно для оценки разнообразия бактерий в неизученном микробном сообществе. Для проверки системы Rofpuf46f/Rofpuf1354r тест-культуры отсутствовали. Однако, результаты, представленные в главе 8, указывают, что эти праймеры также позволяют детектировать новые филотипы Roseiflexus бактерий.

7.2 АНФБ в цианобактериальных матах гидротерм БРЗ Изученные гидротермальные источники Байкальской рифтовой зоны распределены на протяженной дистанции (Рисунок 6). Четыре источника (Алла, Гарга, Гусиха и Уро) расположены в пределах Баргузинской долины. Источник Ценхер расположен на Севере Монголии.

Рисунок 6. Распределение изученных источников БРЗ: 1 — источник Алла, 2 — источник Гарга, 3 — источник Уро, 4 — источник Гусиха, 5 — источник Ценхер.

Изображение сделано с помощью программы Google Earth.

Известно, что в природных термальных условиях гидротермальных источников АНФБ могут достигать значительного развития. При этом хлоросом-содержащие АНФБ образуют в мате слои буро-зеленого или грязножелтого цвета (Pierson, Castenholz, 1971), а бесхлоросомные представители образуют слои морковного и красного цвета (Boomer et al., 2000). Эти признаки были использованы нами при выборе мест для отбора проб. В результате полевых обследований мы выделили основной тип АНФБ-содержащего мата в каждом исследованном источнике. В приложении А приведены фотографии места отбора проб матов. Все образцы были отобраны из термальной зоны источников в виде вырезанных сегментов, что при достаточной толщине мата позволило сделать поперечный срез и выявить вертикальную структуру мата (Приложение А).

Изучение микропрепаратов отобранных матов выявило наличие большого количества нитчатых бактерий в биомассе матов. Во всех образцах наблюдался один морфотип АНФБ. Длинные тонкие трихомы толщиной около 1 мкм. Газовые вакуоли отсутствовали (Рисунок 7).

Рисунок 7. Нитчатые бактерии в цианобактериальных матах БРЗ.

Микрофотография препарата мата источника Уро (А) и источника Алла (Б).

Доминирующие группы фототрофных бактерий в исследованных матах были идентифицированы с помощью анализа пигментного состава.

Пигментные спектры были получены на основании анализа препаратов биомассы матов, разрушенных ультразвуком в 50% глицерине (спектр in vivo).

В приложении Б представлены пигментные спектры матов в сравнении.

В исследованных матах были две доминирующие группы фототрофных бактерий:

цианобактерии и АНФБ. Первые были идентифицированы по присутствию цианобактериального хлорофилла а (максимум поглощения in vivo 678-681 нм).

АНФБ были представлены бактериями рода Chloroflexus и рода Roseiflexus.

В зависимости от доминировавших АНФБ мы выделили Chloroflexusсодержащий и Roseiflexus-содержащий тип мата из термальной зоны (Рисунок 8).

Рисунок 8. Chloroflexus-содержащий мат из источник Уро (А) и Roseiflexus-содержащий мат из источника Алла (Б).

Образцы 2012 года В первом типе (Рисунок 8А) преобладающим бактериохлорофиллом был бактериохлорофилл с, который имел максимум поглощения in vivo 744 нм, характерный для хлоросом бактерий рода Chloroflexus. Также в Chloroflexusсодержащем мате присутствовал бактериохлорофилл а (максимумы поглощения in vivo 806 и 866 нм), входящий в хлоросомы и в реакционный центр фотосистемы бактерий рода Chloroflexus. По соотношению бактериохлорофилла а и с видно, что бактерии Chloroflexus spp. являются доминирующими анноксигенными фототрофами сообщества в матах источников Гарга, Гусиха, Уро (Приложение Б).

Иной пигментный профиль был у Roseiflexus-содержащих матов (Рисунок 8Б) из источников Алла и Ценхер. В этих матах преобладающим бактериохлорофиллом является бактериохлорофилл а, имеющий максимумы поглощения in vivo 805 и 884 нм, характерные для реакционного центра бактерий рода Roseiflexus, который не имеет хлоросомы. В исследованном в 2012 году мате источника Алла бактериохлорофилл с отсутствовал (Приложение Б, секция 1), что указывает на незначительное количество хлоросом-содержащих бакетрий.

В источнике Ценхер бактериохлорофилл с присутствовал в значимых количествах, однако его количество было в два раза меньше, чем количество бактериохлорофилла а (Приложение Б, секция 2). Преобладание бактериохлорофилла а свидетельствует о доминировании в мате Roseiflexus spp., не содержащих в клетках бактериохлорофилл с. Это подтверждается отсутствием развитого зеленого слоя бактерий Chloroflexus spp. на срезе мата (Приложение А, секция 5).

Из образцов матов была выделена тотальная ДНК бактерий, которая была использована для молекулярно-генетического исследования. В этой работе для анализа были использованы замороженные образцы матов, отобранных в 2010 году. Хотя для образцов 2010 года отсутствовали результаты пигментного анализа и микроскопии, их можно использовать для проведения филогенетического анализа.

Для идентификации АНФБ в матах были использованы праймерные системы GreenpufF/GreenpufR и Rofpuf46f/Rofpuf1354r, позволяющие амплифицировать фрагмент оперона pufL/M хлоросом-содержащих представителей и бактерий Roseiflexus spp. соответственно. Полученные ПЦРпродукты были очищены через агарозный гель и секвенированы напрямую.

Хроматограммы, полученные в результате секвенирования, показывали наличие во всех вариантах только одной ДНК-матрицы. Таким образом, в матах обнаружено по одному филотипу хлоросом-содержащих и бесхлоросомных АНФБ. Филогенетический анализ показал, что хлоросом-содержащие АНФБ представлены филотипом, близким к бактерии Chloroflexus aurantiacus.

Бесхлоросомные – бактерией Roseiflexus sp. близкой к Roseiflexus castenholzii (Рисунок 9).

Для исследования филогенетического разнообразия также были задействованы препараты ДНК бактерий, выделенные из образцов высокотемпературных матов, отобранных в 2010 году источниках Алла и Ценхер.

Рисунок 9. АНФБ, идентифицированные в горячих источниках БРЗ.

Дендрограмма построена с помощью метода Maximum Likelihood на основании анализа 263 аминокислотных позиций конкатината PufLM. Статистическая достоверность ветвления установлена на основании построения 600 альтернативных дендрограмм. Показаны достоверности ветвления более 50%.

В данной работе впервые показано филогенетическое разнообразие АНФБ в термальной зоне гидротермальных источников БРЗ. Благодаря использованию методов молекулярно-генетической идентификации нами установлено, что ранее наблюдаемые морфотипы термофильных Chloroflexus spp. относятся к бактерии Chloroflexus aurantiacus. Также показано, что во всех пяти исследованных источниках встречается один и тот же филотип термофильных бактерии Chloroflexus sp., и в двух источниках, Ценхер и Алла, обнаружен новый филотип термофильной бактерии Roseiflexus sp.

Полученные нами данные о доминировании Chloroflexus aurantiacus в термальной зоне источников БРЗ интересны в контексте проблемы глобального распространения этой бактерии. Согласно нашим данным, бактерия Chloroflexus aurantiacus обитает в термальных источниках БРЗ, расположенных на обширной территории. В главе 2 уже говорилось, что бактерия Chloroflexus aurantiacus встречается в гидротермах Японии, Камчатки, Северной Америки и Южной Америки. Поэтому, в совокупности, на основании оригинальных данных, представленных в данной работе, и на основании результатов анализа опубликованных работ других авторов можно предположить космополитность распространения бактерии Chloroflexus aurantiacus.

Стоить отметить, что если ранее были сообщения о Chloroflexus spp. в источниках БРЗ, и даже о развитии аноксигенного «Chloroflexus-мата»

(Намсараев 2006), то о наличии бесхлоросомных АНФБ не было известно и этот факт впервые показан в данной работе. Данная группа в БРЗ была представлена бактерией Roseiflexus spp. Таким образом, можно говорить, что в источниках Байкальской рифтовой зоны, как и в других регионах гидротермальной активности, основными группами термофильных АНФБ являются Chloroflexus spp. и Roseiflexus spp.

Глава 8. Roseiflexus-содержащие фототрофные сообщества

Для источников БРЗ развитие Roseiflexus-содержащего цианобактериальныго мата отмечено впервые, поэтому в данной работе мы сосредоточили наше внимание на исследовании этого типа фототрофного микробного сообщества. Roseiflexus-содержащий мат привлек исследователей, как отдельный тип мата, еще в конце девяностых годов двадцатого века, и даже стал объектом для систематического сравнительного исследования в рамках проекта «Red Layer Microbial Observatory» (RLMO), заявленного в 2000 году (Boomer et al., 2003). Однако, через пять лет проект не получил дальнейшего развития. Кроме того, сбор данных для этого проекта был ограничен гидротермами Йеллоустона (США). В связи с последним обстоятельством, данные, полученные при исследовании источников БРЗ, в совокупности с результатами исследований матов из Йеллоустона и других регионов планеты, представляют интерес как материал для дальнейшего сравнительного анализа.

ДНК Roseiflexus-содержащих матов были нами выделены в 2011 и в 2012 году. Для определения филогенетического состава микробного сообщества были сделаны клональные библиотеки ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК, полученные с использованием универсальной праймерной системы Univ27f и Univ1492r (Lane, 1991). Далее вставки клонов были секвенированы с помощью праймеров Univ27f, Univ530f и Univ1492r. После обработки и проверки на наличие аномалий, последовательности были отобраны для дальнейшего анализа. Для источника Алла было отобрано 111 последовательностей, для источника Ценхер – 60. В среднем длина последовательностей составляла около 1400 нуклеотидов. В сравнительном анализе участвовали только последовательности, отнесенные к филотипам фототрофных бактерий. Данные о филогенетическом анализе легли в основу сравнения состава Roseiflexusсодержащих матов.

В связи с тем, что гидротермальный источник Алла был наиболее доступен, он послужил площадкой для детального исследования данного типа сообщества. Полученные результаты могут служить для описания типового сообщества микроорганизмов мата Roseiflexus, характерного для источников БРЗ.

8.1 Roseiflexus-содержащий мат источника Алла

Термальный источник Алла представляет собой гидротермальную систему, расположенную в пределах Баргузинской долины на отрогах Байкальского хребта, возле одноименной реки. В данной работе было исследовано термальное поле, расположенное на орографически правом берегу реки Алла. Горячая вода выходила как из грифонов, так и просачивалась через песок, выстилающий площадку термального поля. При этом формировался градиент физико-химических параметров водной среды непосредственно от дна, на котором находятся микробные маты. По краю термального поля проходила протока реки Алла, частично заливая поверхность термального поля.

Речная вода при этом охлаждает поверхность сформированных матов, создавая резкий контраст физико-химических условий, влияющих на развитие цианобактериальных матов.

Впервые Roseiflexus-содержащий мат в гидротермальном источнике Алла был найден нами в 2011 году. Согласно исследованиям других авторов, в этом источнике ранее наблюдали только типичные цианобактериальные маты, содержащие Chloroflexus sp. в качестве единственного представителя АНФБ (Намсараев и др., 2006; Лазарева и др. 2010). Возможно, появление данного типа мата связанно с изменением физико-химических условий в термальном поле, вызванное уменьшением заливания поля речной водой. Так, по сообщению Горленко В.М. до проведения этого исследования, в 2010 году в термальном поле под потоком речной воды (из протоки) был обнаружен только «Chloroflexus-содержащий» оливкового цвета, который развивался в непосредственной близости от мест выхода горячей воды из грифонов. При этом большая часть песчаной площадки была свободна от фототрофного мата.

Но уже в 2010 году общий уровень воды в реке упал, по сравнению с наблюдениями более ранних экспедиций, что привело к тому, что протока реки стала мелеть, обнажая термальное поле. Дальнейшее падение уровня речной воды в протоке привело к обильному развитию фототрофного мата. В 2011 году увеличилась площадь, занятая зеленым матом, и появился Roseiflexusсодержащий мат, который стал объектом нашего исследования. В 2012 году площадь, занятая Roseiflexus-содержащим хлорофототрофным матом, стала еще больше. В некоторых местах мат достиг значительной толщины (до 2 см).

Для выявления основных групп фототрофных бактерий мы провели послойное определение пигментного состава мата. В структуре мата, обнаруженного в 2011 году, выделялись два основных слоя: тонкий верхний слой зеленого цвета и нижний толстый слой красно-оранжевого цвета.

Основным пигментом верхнего слоя был цианобактериальный хлорофилл а с максимумом поглощения in vivo 681 нм. В нижнем слое появляются пики поглощения бактериохлорофилла а с максимумами in vivo при 805, 884 нм.

(Рисунок 10).

Рисунок 10. Послойное распределение пигментов Roseiflexusсодержащего мата источника Алла. Бхл а – бактериохлорофилл а, Хл а – хлорофилл а. Прерывистая линия — нижний слой, сплошная линия — верхний слой.

Таким образом, верхний слой был представлен преимущественно оксигенными цианобактериями, а нижний – как цианобактериями, так и бактериохлорофилл а содержащими аноксигенными бактериями рода Roseiflexus.

В 2012 году Roseiflexus-содержащий мат располагался на большей площади и отличался большим разнообразием организации структуры. Его можно считать основным типом мата в термальном поле источника Алла.

Поэтому нами были исследованы дополнительно образцы из трех точек термального поля (Рисунок 11). Маты в отобранных точках отличались по структуре. В точке 1 мат не имел четкую дифференцировку на слои, и представлял собой обрастания преимущественно из нитчатых бактерий Roseiflexus, что было определено по наличию исключительно бактериохлорофилла а с максимумами поглощения 805, 884 нм, на поверхности которых были пятна цианобактериального роста (Рисунок 11, точка 1). Точка 2 расположена возле грифона (Рисунок 11, точка 2). Мат в данной точке имел четко выраженный верхний цианобактериальный слой с преобладанием хлорофилла а с максимумами поглощения iv vivo 681 нм и нижний Roseiflexusсодержащий слой с бактериохлорофиллом а с максимумами поглощения iv vivo 805, 884 нм. Третья точка была выбрана в толстом двухслойном мате (Рисунок 11, точка 3). В данной точке, так же как и в точке 2, верхний слой представлен цианобактериями (хлорофилл а с максимумами поглощения iv vivo 681 нм) и нижний слой Roseiflexus-бактериями (бактериохлорофилл а с максимумами поглощения iv vivo 805, 884 нм).

Рисунок 11. Места отбора проб мата в термальном поле Алла в 2012 году.

Общий вид термального поля (А), цифрами обозначены точки отбора проб.

Фотография первой точки отбора пробы (Б). Срезы матов отобранных в точке два (В) и три (Г).

Для анализа состава фототрофного сообщества мата в комплексе были применены клональный анализ и исследование микропрепаратов мата с помощью светового микроскопа.

При исследовании микропрепаратов мата из образца Алла11-1 было обнаружено, что верхний зеленый слой мата был образован преимущественно бактериями из рода Leptolyngbya (Рисунок 12). Также в верхнем слое были обнаружены одноклеточные цианобактерии из рода Limnococcus (Рисунок 12).

Присутствие мезофильным цианобактерий Limnococcus sp. в верхнем слоем мата может быть объяснено тем, что мат охлаждается речной водой, попадающей из протоки на термальное поле. Так, температура на поверхности мата составляла 40°С, тогда как температура в нижнем слое 57°С. Нижний красно-оранжевый слой мата был образован нитчатыми бактериями рода Roseiflexus (Рисунок 12). В обоих слоях мата в большом количестве присутствовали термофильные одноклеточные цианобактерии рода Synechococcus (Рисунок 12). Клетки Synechococcus sp. были обильно представлены в красном слое и, очевидно, в основном они ответственны за присутствие в нем хлорофилла a.

Рисунок 12. Основные морфотипы фототрофных бактерий в мате источника Алла : А – клетки цианобактерии Limnococcus sp. среди нитей Leptolyngbya sp. в зеленом слое мата; Б – морфотип-1 цианобактерии Limnococcus sp.; В – морфотип-2 цианобактерии Limnococcus sp.; Г – нить бактерии Roseiflexus sp.; Д – одноклеточные цианобактерии Synechococcus sp.; Е

– клетки Synechococcus sp. рядом с трихомом; Ё,Ж – нити цианобактерии Leptolyngbya sp.; З – нити бактерий рода Roseiflexus sp. в красном слое мата;

Увеличение: А,З - х400; Б-Ж – х1000 Для определения филогенетического состава была сделана клональная библиотека ПЦР-фрагментов генов 16S рРНК, полученных с использованием универсальной праймерной системы Univ27f и Univ1492r. Среди отобранных для анализа 111 последовательностей было выделено 26 OTU (Приложение В).

OTU выделяли на основании кластерного анализа и считали отдельным OTU группу последовательностей, отличающуюся от других групп на 3%. Для последующего анализа были использованы OTU, соответствующие фототрофным бакетриям.

Результаты филогенетического анализа фототрофной компоненты микробного сообщества мата согласуются с результатами пигментного анализа и результатами микроскопии. Так, фототрофные бактерии мата были представлены оксигенными и аноксигенными фототрофами: 9 цианобактериальных OTU и 1 OTU, относящаяся к аноксигенным нитчатым фототрофным бактериям рода Roseiflexus (Рисунок 13).

Очевидно аноксигенные фототрофы в данном образце, представлены приемущественно бактериохлорофилл а содержащими нитчатыми бактериям рода Roseiflexus, отнесенными нами к OTU-21, и которые и образовывали основную массу нижнего красного слоя мата (Рисунок 12). Другие представители АНФБ не были выявлены. Аллинский Roseiflexus-филотип имеет идентичность 97% с ближайшей референсной последовательностью «Roseiflexus sp. clone DTB5» (EF205543), детектированной в тибетском гидротермальном источнике. Ближайшая референсная последовательность культивируемой бактерии относится к Roseiflexus castenholzii с идентичностью 97%. Таким образом, аллинская Roseiflexus-бактерия представляет собой новый филотип видового уровня. Морфология трихомов типичная для бактерий рода Roseiflexus (Рисунок 12). Максимумы поглощения бактериохлорофилла а популяции Roseiflexus-бактерий аллинского мата характерные для Roseiflexus castenholzii.

Рисунок 13. Филогенетический состав фототрофных бактерий мата источника Алла, выявленный посредством анализа гена 16S рРНК.

Дендрограмма построена с помощью метода Maximum Likelihood на основании анализа 1263 нуклеотидных позиций. Статистическая достоверность ветвления установлена на основании построения 600 альтернативных дендрограмм.

Наблюдаемое фенотипическое разнообразие согласовывалось с результатами анализа филогенетического разнообразия, выявленного посредством клонирования тотального ПЦР-продукта гена 16S рРНК.

Образцы, отобранные в 2012 году, были использованы для исследования распределения филотипов АНФБ в матах термального поля источника Алла.

Для этого исследования были использованы группоспецифические праймерные системы на ген 16S рРНК, специфичные для хлоросом-содержащих АНФБ (Cfl68f/Cfl1231r), специфичные для бактерий рода Roseiflexus (Rof97f/Rof940r) и праймеры, способные отжигаться на геномной ДНК бактерий обоих групп (ChiF/ChiR) (Таблица 3). Если в результате ПЦР нарабатывался продукт реакции нужной длины, он был использован для дальнейшего секвенирования.

Результаты ПЦР-анализа свидетельствуют о том, что во всех исследованных образцах преобладали бактерии рода Roseiflexus (Таблица 4).

При этом в результате ПЦР с праймерной системой Cfl68f/Cfl1231r на тотальной ДНК только в варианте с образцом Алла12-1 был получен положительный сигнал, свидетельствующий о присутствии бактерии Chloroflexus aurantiacus, в остальных образцах присутствие Chloroflexus не детектировалось.

Таблица 4. Результаты ПЦР-анализа образцов 2012 года. Rof. – филотипRoseiflexus sp.

По результатам секвенирования ПЦР-фрагмента, полученного на ДНК этого же образца с праймерами ChiF/ChiR, была выявлена последовательность, специфичная для рода Roseiflexus. Анализ последовательностей секвенированных ПЦР-продуктов показал, что во всех образцах 2012 года преобладает один и тот же Roseiflexus-подобный филотип, идентичный тому, что был выявлен по данным анализа последовательностей клональной библиотеки, созданной на тотальной ДНК образца Алла11-1 (Рисунок 14).

Рисунок 14. Филотипы АНФБ, выявленные в матах источника Алла.

Дендрограмма построена с помощью метода Maximum Likelihood на основании анализа 724 нуклеотидных позиций гена 16S рРНК. Статистическая достоверность ветвления установлена на основании построения 1000 альтернативных дендрограмм.

Дополнительно были использованы праймеры на оперон pufLM, специфичные для бактерий рода Roseiflexus (Rofpuf46f/Rofpuf1354r). Анализ последовательностей фрагмента оперона pufLM, полученных с помощью праймерной системы Rofpuf46f/Rofpuf1354r, также подтвердил филогенетическую однородность Roseiflexus-бактерий популяции источника Алла и близость к филотипу Roseiflexus castenholzii (Рисунок 15).

Рисунок 15. Филотипы АНФБ, выявленные в матах источника Алла.

Дендрограмма построена с помощью метода Maximum Likelihood на основании анализа 270 аминокислотных позиций белков PufLM. Статистическая достоверность ветвления установлена на основании построения 1000 альтернативных дендрограмм.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Динамика экологических условий на гарях в сосновых лесах юго-востока Западной Сибири Автор научной работы: Заблоцкий, Владимир Ильич Ученая cтепень: доктор сельскохозяйственных наук Место защиты диссертации: Барнаул Код cпециальности ВАК: 0...»

«Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ставропольский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации ГБОУ ВПО СтГМУ Минздрава России КАФЕДРА БИОЛОГИИ УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе, профессор А.Б...»

«Вестник МГТУ, том 16, № 4, 2013 г. стр.631-637 УДК 664.951.6, 664.951.7 Использование мойвы для изготовления консервов из полуфабриката холодного копчения и оценка качества готового продукта Ю.В. Аллоярова1, О.А. Николаенко1, Л.К. Куранова1, Б.Н. Семнов2 Факуль...»

«Экологическая акция в ДОУ как социально значимое, событийное мероприятие. Создание комфортной развивающей образовательной среды, обеспечивающей высокое качество образования, его доступность, открытость и привлекательность для обучающихся, их родителей – одна из приоритетных задач педагогов. ФГТ предпол...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Факультет ветеринарной медицины РАБОЧАЯ ПРОГРАММА дисциплины...»

«Амр Ахмед Махмуд Хаммам ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ И ВОДНО-ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТЫХ ПОЧВ ПРИ ПОСТАГРОГЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ Специальность: 03.02.13 – почвоведение АВТО...»

«ЗАКЛЮЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА Д 501.001.46 на базе Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" по диссертации на с...»

«Доклад: Экомаркировка Экомаркировка – это некий знак или графический cимвол, который в результате процедуры проверки на соответствие выработанным экологическим критериям присутствует на товаре или его упаковке, и подтверждается документально соответствие выраб...»

«Пояснительная записка Дополнительная образовательная общеразвивающая программа "Агробиология" естественнонаучной направленности общим объемом 36 часов, сроком на 3 месяца, разработана для проведения занятий с обучающимися 8-15 лет. Программа ознакоми...»

«Курсовую работу Вы будете выполнять в лаборатории "Биоконтроль" Выбирая свою работу в этой лаборатории Вы получаете ряд преимуществ:1. Овладение наиболее современными научными методами в области биотехнологии, молекулярной биологии, экотоксикологии;2. Наличие научно...»

«86 Казанцева А.Н. ЭКО-ИННОВАЦИИ КАК ИНСТРУМЕНТ ПЕРЕХОДА К УСТОЙЧИВОМУ РАЗВИТИЮ Аннотация. В статье рассматриваются виды устойчивых экологичных инноваций, анализируется их значимость в процессе перехода к устойчивому развитию экономики, приво...»

«МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ "ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА" №9/2016 ISSN 2410-6070 11. Осин А. Мультимедиа в образовании: контекст информатизации // ИКТ в образовании. – 2006, № 6. -90 с.12. Пидкасистый П.И. Тыщенко О.Б. Компьютерные технологии в системе дистанционного обучения // Педагогика. – 2008, № 5...»

«ГБУ "Республиканская имущественная казна" (специализированная организация) руководствуясь ст. 448 Гражданского кодекса Российской Федерации, ст.3 Федерального закона от 03.11.2006г. № 174-ФЗ "Об автономных учреждениях", распоряжением Кабинета Министров Республики Татарс...»

«Лидия Григорьевна Бурова Загадочный мир грибов ABBYY FineReader 11 http://www.litres.ru Загадочный мир грибов: Наука; Москва; 1991 ISBN 5-02-004624-8 Аннотация В книге приводятся сведения, знакомящие читателей с эволюцией, экологией и использованием в народном хозяйстве, практике и медицине шляпочных...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Учебно-методическое объединение по образованию в области информатики и радиоэлектроники УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра образования Республики Беларусь В.А. Богуш 03.05.2016 г. Регистрационный № ТДI /1...»

«МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ И ЭКОЛОГИИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ДОКЛАД О СОСТОЯНИИ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН В 2014 ГОДУ УФА 2015 "ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ДОКЛАД О СОСТОЯНИИ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН В 2014 ГОДУ" ПРЕДИСЛОВИЕ Государственный доклад...»

«МИНИСТЕРСТВО ПРОСВЕЩЕНИЯ ПМР ПРИДНЕСТРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Т.Г. ШЕВЧЕНКО Естественно-географический факультет Научно-исследовательская лаборатория "Палеобиология и палеобиогеография" МАТЕРИАЛЫ ЧТЕНИЙ памят...»

«Лабораторная работа № 1 Тема 1. Технология создания простейших прототипов экспертных систем в режиме приобретения знаний системы ЭКО Цель: приобретение начальных навыков использования системы ЭКО при созда...»

«УДК 597.553.2:551.21 (571.66) ВУЛКАНИЗМ И ХОМИНГ ТИХООКЕАНСКОГО ЛОСОСЯ (геоэкологическая гипотеза) Г.П. Яроцкий Институт вулканологии и сейсмологии ДВО РАН. Петропавловск-Камчатский. 683006; e-mail:ecology@kscnet.ru...»

«Казарина Ольга Витальевна Научное обоснование совершенствования фониатрической помощи в Российской Федерации 14.01.03 – Болезни уха, горла и носа 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Дайхес Н.А. доктор...»

«СЕКС Д ЛЯ НАУКИ НАУКА Д ЛЯ СЕКСА MARY ROACH BONK W. W. NORTON & COMPANY New York London МЭРИ РОУЧ СЕКС Д ЛЯ НАУКИ НАУКА Д ЛЯ СЕКСА Перевод с английского Москва УДК 611.08 ББК 57.0 Р79 Переводчик Галина Шульга Редактор Роза Пискотина Роуч М. Секс для науки. Наука для секса /...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.