WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«Тест-система «ГРИПП» для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и идентификации субтипов в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) ...»

ИНСТРУКЦИЯ

по применению тест-системы «ГРИПП» для выявления и дифференциации

вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции

(организация-производитель - ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г.Москва)

Тест-система «ГРИПП» для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и

идентификации субтипов в биологическом материале методом полимеразной цепной

реакции (ПЦР) выпускается в трех форматах:

Формат EPh – для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и идентификации субтипов H5 и H7 в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

Формат FEP – для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и идентификации субтипов H5, H7 и Н9 в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».

Формат FRT – для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A), идентификации субтипов H5, H7, Н9, и идентификации гриппа свиней А/Н1 в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Тест-система выпускается в трех форматах.

Формат EPh.

Тест-система «ГРИПП» формат EPh, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в двух формах:



Форма 1 включает:

- комплект «РИБО-сорб» вариант 50 - для выделения РНК/ДНК из клинического материала.

- комплект «РЕВЕРТА-L» вариант 50 – для получения кДНК на матрице РНК.

- «ПЦР-комплект» вариант 50 F - для амплификации кДНК Influenza virus A и идентификации субтипов H5 и H7.

- комплект «ЭФ» вариант 200 - для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

Форма 2 включает:

- «ПЦР-комплект» вариант 50 F - для амплификации кДНК Influenza virus A и идентификации субтипов H5 и H7.

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию РНК из биологического материала, реакцию обратной транскрипции, амплификацию кДНК Influenza virus A и электрофоретическую детекцию.

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации кДНК Influenza virus A. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 1 из 44 реагентов для экстракции РНК, обратной транскрипции электрофоретической детекции, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Формат FEP.

Тест-система «ГРИПП» формат FEP, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в двух формах:

Форма 1 включает:

- комплект «РИБО-сорб» вариант 50 - для выделения РНК/ДНК из клинического материала.

- комплект «РЕВЕРТА-L» вариант 50 - для получения кДНК на матрице РНК.

- комплект «ПЦР-комплект» вариант FEP - для амплификации кДНК Influenza virus A и идентификации субтипов H5, H7 и Н9 с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».





Форма 2 включает:

- комплект «ПЦР-комплект» вариант FEP - для амплификации кДНК Influenza virus A и идентификации субтипов H5, H7 и Н9 с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию РНК из биологического материала, реакцию обратной транскрипции и амплификацию кДНК Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».

Форма комплектации 2 предназначена для проведения амплификации кДНК Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции РНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Формат FRT.

Тест-система «ГРИПП» формат FRT, рассчитанная на проведение 50 анализов, включая контроли, выпускается в трех формах:

Форма 1 включает:

- комплект «РИБО-сорб» вариант 50 - для выделения РНК/ДНК из клинического материала.

- комплект «РЕВЕРТА-L» вариант 50 - для получения кДНК на матрице РНК.

- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F - для амплификации кДНК Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма 2 включает:

- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F - для идентификации субтипов H5, H7 и Н9 Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма 3 включает:

- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT - для идентификации гриппа свиней А/Н1 с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма 4 включает:

- комплект «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F - для амплификации кДНК Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-исследования, включающего экстракцию РНК из биологического материала, реакцию обратной транскрипции и амплификацию кДНК Influenza virus A с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Формы комплектации 2, 3 и 4 предназначены для проведения амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 2 из 44 проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции РНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

–  –  –

Упаковка и маркировка.

2.

На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные картонные коробки (застегивающиеся пакеты из полиэтилена). На каждую коробку (пакет из полиэтилена) наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок (флаконов) каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 4 из 44 Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение ТУ/СТО и надпись «Для животных». В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.

Транспортирование и хранение.

3.

Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.

Комплекты реагентов «РИБО-сорб», «ПЦР-комплект» хранить при температуре от 2 до 8 С, кроме полимеразы (TaqF). Комплект реагентов «РЕВЕРТА-L» и полимеразу (TaqF) хранить при температуре от минус 24 °С до минус 16 °С.

Формат EPh.

Комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света месте.

4. Срок годности тест-системы - 12 месяцев с даты изготовления. Тест-системы с истекшим сроком годности применению не подлежат.

II. ПРИНЦИП ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ

Формат EPh. Метод обнаружения кДНК вируса гриппа А (Influenza virus A) основан на 5.

амплификации специфических участков кДНК за счет многократного повторения циклов денатурации кДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы.

Чтобы получить кДНК вируса, предварительно проводят экстракцию РНК вируса из исследуемого материала и реакцию обратной транскрипции.

Форматы FEP, FRT. Метод обнаружения кДНК вируса гриппа А (Influenza virus A) 6.

основан на амплификации специфических участков кДНК за счет многократного повторения циклов денатурации кДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и зондов, меченных флуоресцентными красителями, и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы. Чтобы получить кДНК вируса, предварительно проводят экстракцию РНК вируса из исследуемого материала и реакцию обратной транскрипции.

III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

7. Отбор материала для исследования.

7.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования, необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

7.2. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.

7.3. Для исследования используют следующий материал от животных:

при исследовании птиц:

- помет (4-5 г) в стерильных контейнерах;

- мазки из клоаки, со слизистой глотки и трахеи берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной среды (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора), стерильного физиологического раствора или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают;

- трахеальные смывы, получают с помощью стерильного физиологического раствора;

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 5 из 44 внутренние органы (фрагменты трахеи и легких, селезенка, мозг, воздухоносные мешки, кишечник) в одноразовых стерильных контейнерах;

- яйцо для исследования отправляют целиком, в герметичном контейнере;

- эмбрионы кур целиком в яйце помещают в герметичный контейнер.

при исследовании свиней и лошадей:

- носовые смывы получают с помощью стерильного физиологического раствора в одноразовых стерильных контейнерах;

- бронхиальный экссудат в одноразовых стерильных контейнерах;

- внутренние органы (фрагменты трахеи и легких) в одноразовых стерильных контейнерах.

мясо птиц и субпродукты в одноразовых стерильных контейнерах.

комбикорма для племенной птицы, сухие корма для непродуктивных животных, находящиеся в мешках или небольших насыпях на складе, отбирают по ГОСТ 13496.0 (см. приложение 2).

при исследовании свинины, продуктов ее переработки и субпродуктов:

- пробы мяса, продуктов переработки, субпродуктов в одноразовых стерильных контейнерах;

- мазки с поверхности мяса, субпродуктов берут стерильными зондами с ватными тампонами. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков (производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), стерильного физиологического раствора или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают

7.4. От партии продукта отбирают общую пробу в соответствии с ГОСТом следующим образом:

- отбор проб от каждой новой партии производится с использованием стерильной медицинской перчатки;

- от исследуемой партии корма или продукта отбирают из различных мест не менее 10 образцов проб (по 200 г) в чистый полиэтиленовый пакет и перемешивают, формируя общую пробу (2 кг);

- из общей пробы отбирают среднюю пробу в 20 г, помещают в чистый герметичный пакет из полиэтилена или в чистый сухой флакон с притертой крышкой, опечатывают и отправляют на анализ.

7.5. Допускается хранение вышеперечисленного материала до проведения исследования в течение сут при температуре от 2 до 8 °С или 1 нед - при температуре не выше минус 16 °С.

8. Подготовка исследуемого материала.

8.1. Мазки и смывы используют без предварительной обработки.

8.2. Внутренние органы животных, мясо птицы, свинину и субпродукты гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10 тыс об/мин в течение 30 с. Надосадочную жидкость используют для экстракции РНК.

8.3. Помет. Для исследования используют 4-5 г помета. Готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе, тщательно ресуспендируют и декантируют в течение 10 мин. Надосадок переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для экстракции РНК.

8.4. При исследовании яиц в скорлупе прокалывают отверстие иглой со стерильным шприцем или пастеровской пипеткой с фильтром и отбирают в пробирку объемом 1,5 мл 1,0мл яичного белка.

8.5. При исследовании куриных эмбрионов в скорлупе прокалывают отверстие иглой со стерильным шприцем или пастеровской пипеткой с фильтром и отбирают в пробирку объемом 1,5 мл 1,0-1,5 мл аллантоисной жидкости.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 6 из 44

8.6. Корм для исследования тщательно гомогенизируют. Готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе, тщательно ресуспендируют и декантируют в течение 10 мин. Надосадок переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используют для экстракции РНК.

IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР

Формат EPh: ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).

9.

Форматы FEP, FRT: ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

9.1. ЗОНА 1 – Для экстракции РНК из исследуемого материала:

Стерильный ламинарный шкаф (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).

Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24Биоком», Россия).

Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).

Центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г.Ульяновск, Россия).

Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки объемом 1,5 мл (например, «Axygen», США).

Штативы для микропробирок объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).

Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).

Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл (например, «Axygen», США).

Холодильник от 2 до 8 С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С.

Отдельный халат и одноразовые перчатки.

Ёмкость с дезинфицирующим раствором.

9.2. ЗОНА 2 – Для проведения реакции обратной транскрипции и амплификации:

Формат EPh: амплификатор (например, «Терцик», «ДНК-технология», Россия).

Формат FEP: амплификатор (например, «Терцик», «ДНК-технология», Россия или «GeneAmp PCR System 2700», «Applied Biosystems», США) и флуоресцентный ПЦР-детектор («АЛА-1/4», «BioSan», Латвия или «Джин», «ДНК-Технология», Россия).

Формат FRT: амплификатор («RotorGene» 3000/6000, «Corbett Research», Австралия или «iCycler iQ» или «iQ5», «Bio-Rad», США).

ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С»», «Ламинарные системы», Россия).

Центрифуга/вортекс для пробирок типа «Эппендорф» (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).

Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).

Штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).

Холодильник от 2 до 8 С с морозильной камерой от минус 24 °С до минус 16 °С.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 7 из 44 Отдельный халат и одноразовые перчатки.

Емкость с дезинфицирующим раствором.

9.3. Формат EPh: ЗОНА 3 – для электрофоретического анализа продуктов ПЦР:

камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл (например, «SE-2», «Хеликон», Россия).

источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В (например, «Эльф-4», «ДНК– Технология», Россия).

ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей (например, «Биоком», Россия).

видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов (например, «Биотест-1», «ЦНИИ Эпидемиологии», Россия; «BioRad», США).

аквадистиллятор.

холодильник от 2 до 8 °С для хранения продуктов амплификации.

микроволновая печь для плавления агарозы.

колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления агарозы на 250 мл.

мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).

штатив для микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).

отдельный механический или электронный дозатор переменного объема 10 - 40 мкл (например, «Ленпипет», Россия).

одноразовые наконечники до 200 мкл в штативе (например, «Axygen», США).

пластиковая емкость на 5 л для дезактивации буфера и гелей, содержащих бромид этидия.

парафильм.

отдельный халат и одноразовые перчатки.

10. Порядок работы.

10.1. ЭТАП 1 (зона 1). Экстракция РНК из исследуемого материала.

ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free».

Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре от 60 до 65 °С до полного растворения кристаллов.

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл с плотно закрывающейся крышкой (включая отрицательный контроль экстракции).

Формат EPh: Внести в каждую пробирку по 450 мкл лизирующего раствора.

Промаркировать пробирки.

Форматы FEP, FRT: Внести в каждую пробирку по 450 мкл лизирующего раствора, по 10 мкл ВКО STI-rec. Промаркировать пробирки.

Если анализируются яйцо, эмбрионы кур, то в пробирки с лизирующим раствором внести по 100 мкл исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером.

Если анализируются мазки со слизистой глотки, трахеи, поверхности мяса, пробы фекалий, комбикорма и сухие корма, суспензии мяса и внутренних органов, то в пробирки с лизирующим раствором внести по 50 мкл ОКО и по 50 мкл исследуемого образца, используя наконечники с аэрозольным барьером.

В пробирку отрицательного контроля (В–) экстракции внести 100 мкл ОКО.

Плотно закрытые пробы тщательно перемешать на вортексе и процентрифугировать в течение 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки. Инкубировать при комнатной температуре от 3 до 5 мин.

Если в пробирках находятся взвешенные частицы (не растворившийся полностью материал), центрифугировать при 10 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге и перенести Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 8 из 44 надосадочную жидкость в другие пробирки.

Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 1 мин, еще раз перемешать и оставить на 5 мин.

Процентрифугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс об/мин в течение 30 с на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. Процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге.

Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой и отдельный наконечник для каждой пробы.

Повторить отмывку раствором для отмывки 3.

Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4. Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге.

Полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником, используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой.

Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 15 мин для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

В пробирки добавить по 50 мкл РНК-буфера, используя наконечники с аэрозольным барьером, свободные от РНКаз.

Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 60 С на 2-3 мин.

Перемешать на вортексе и процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги (12-13 тыс об/мин) в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную РНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции.

Реакцию обратной транскрипции следует проводить сразу после получения РНК-пробы.

Отбирать раствор РНК для реакции нужно очень осторожно, не захватывая сорбент. Если сорбент взмутился, необходимо осадить его на центрифуге.

Очищенная РНК может храниться до 4 ч при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарата необходимо отобрать раствор РНК, не захватывая сорбент, перенести в стерильную пробирку и хранить в течение года при температуре не выше минус 68 °С.

10.2. ЭТАП 2 (зона 2). Проведение реакции обратной транскрипции (получение кДНК на матрице РНК) и постановка ПЦР (амплификация участка полученной кДНК).

10.2.1. Постановка реакции обратной транскрипции.

Общий объем реакции - 20 мкл, объем РНК-пробы – 10 мкл.

ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free».

Порядок работы:

Отобрать необходимое количество микропробирок объемом 0,2 (0,5) мл.

Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку с RT-mix внести 5 мкл RT-G-mix-1 и тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки.

К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировать 5 раз, перемешать на вортексе. Осадить капли с крышки пробирки.

Внести в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси.

Используя наконечник с аэрозольным барьером, добавить 10 мкл РНК-пробы в пробирку с реакционной смесью. Осторожно перемешать.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 9 из 44 Поставить пробирки в амплификатор (термостат) при температуре 37 °С на 30 мин.

Формат EPh: полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей постановки ПЦР развести в 5 раз ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным наконечником добавить 80 мкл ДНК-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз).

Форматы FEP, FRT: полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей постановки ПЦР развести в 2 раза ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным наконечником добавить 20 мкл ДНК-буфера, аккуратно перемешать пипетированием 10 раз).

Готовый препарат кДНК можно хранить при температуре не выше минус 16 С в течение нед или при температуре не выше минус 68 °С в течение года.

10.2.2. Постановка ПЦР.

Общий объем реакции - 25 мкл, объем кДНК-пробы – 10 мкл.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант 50 F и электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле с использованием комплекта реагентов «ЭФ» вариант 200 см. приложение 1.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант FEP см. приложение 2.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант FRT и FRT-50 F с помощью приборов «Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия) см. приложение 3.

Проведение амплификации с использованием комплекта реагентов «ПЦР-комплект»

вариант FRT и FRT-50 F с помощью приборов «iQ5» и «iCycler iQ» («Bio-Rad», США) см.

приложение 4.

МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

V.

11. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

12. Все работы по сбору, транспортированию и подготовке проб биологического и секционного материалов осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».

13. Анализ проводится согласно МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».

14. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое.

15. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, должны обязательно до начала и после окончания работ облучаться ультрафиолетовым светом.

16. Обеззараживание биоматериалов и реагентов проводят для каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду, колбы-ловушки вакуумных отсасывателей на 20-24 ч в специальные контейнеры, содержащие дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания биоматериалов (например, 0,2% раствор натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты).

17. При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской, так как ультрафиолетовый свет вызывает ожоги лица и слизистой глаз.

18. Бромистый этидий является мутагеном, проникающим через кожу. При работе с ним использовать одноразовые перчатки.

19. Тест-систему хранить в местах, не доступных для детей.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 10 из 44 Инструкция разработана ФГБУ «ВГНКИ» (г. Москва), совместно с ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а).

–  –  –

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр.

12 из 44 Амплификаторы с матричным регулированием температуры:

«Biometra», «MiniCycler», «PTC-100» («MJ Research») цикл температура время циклы пауза 95 °С 15 мин 95 °С 1 мин 95 °С 1 мин 63 °С 1 мин 72 °С 1 мин 72 °С хранение 10 °С После окончания реакции пробирки отправить в помещение для анализа продуктов ПЦР (ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в течение нед при температуре от 2 до 8 °С (однако перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска).

ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В

II.

АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ (ЭТАП 3, проводится в зоне 3).

Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельном помещении сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2.

А. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля.

Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трисборатного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать.

ВНИМАНИЕ! Бромид этидия – канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке (см. раздел «Дезактивация буфера и гелей»).

Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой – 1,5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать содержимое, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65-70 С.

Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры.

Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга.

Толщина геля должна быть около 0,6 см.

После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру такой объем готового буфера, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху.

Б. Порядок работы.

Пробирки с продуктами амплификации последовательно выставить в штатив, отобрать изпод слоя масла по 10–15 мкл пробы и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду лунок геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 13 из 44 Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Оптимальное напряжение электрического поля 10 В/см. При использовании камеры «SE-2» («Хеликон») и источника питания «Эльф-4» («ДНК-Технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза – 18-20 мин.

Когда краситель пройдет примерно половину длины геля (не менее 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отмечая порядок нанесения проб, занести в базу данных.

Внимание! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной!

В. Дезактивация буфера и гелей.

Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и затем 1 объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют 1 объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.

–  –  –

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 14 из 44 Появление специфической полосы 270 п.н. в любом из отрицательных контрольных образцов (В–, К-) указывает на контаминацию реактивов или проб. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

Идентификация субтипов Н5 и Н7 вируса гриппа А.

Для идентификации субтипов H5 и H7 используют образцы кДНК, давшие положительные результаты на наличие РНК Influenza virus A (с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A).

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ.

I.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Для амплификации кДНК Influenza virus A H5 используется ПЦР-смесь-1 Influenza virus A H5, для амплификации кДНК Influenza virus A H7 используется ПЦР-смесь-1 Influenza virus A H7.

Пробирки с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H5 и ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7 перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1 Influenza

virus A H5, 2,5x ПЦР-буфер blue, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:

5 мкл ПЦР-смеси-1 Influenza virus A H5 10 мкл 2,5x ПЦР-буфер blue 0,5 мкл полимеразы (TaqF) Приготовить аналогичным способом реакционную смесь с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7.

Перемешать смеси на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 или 0,5 мл.

Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл).

Б. Проведение амплификации.

Взять подготовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с аэрозольным барьером, внести в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H5 и в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7 по 10 мкл каждой из кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H5 и в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7 внести по 10 мкл ТЕ-буфера;

б) положительный контрольный образец (К+5 тип) – вместо кДНК-пробы в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H5 внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H5.

в) положительный контрольный образец (К+7 тип) – вместо кДНК-пробы в пробирку с ПЦР-смесью-1 Influenza virus A H7 внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H7.

Запустить на амплификаторе программу (см. табл. 3 и 4). Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы), поставить пробирки* в ячейки амплификатора и нажать кнопку продолжения программы.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок * кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).

Таблица 3.

Программа для амплификации кДНК Influenza virus A H5

Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке):

«GeneAmp PCR System 2700»

(«Applied Biosystems»);

«Терцик»

«Gradient Palm Cycler» «Maxygene» («Axygen») («ДНК-Технология») («Corbett Research»);

«iCycler iQ» («Bio-Rad»)

–  –  –

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 18 из 44 По окончании выполнения программы амплификации приступить к детекции результатов.

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.

II.

А. Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин-4» («ДНКТехнология», Россия) с версией программного обеспечения 4.4i.

Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин» проводится согласно описанию в паспорте «ПЦР-детектора флуоресцентного «Джин-4».

Настройка теста.

Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:

Наименование теста - «ГРИПП»

Привязка каналов: FAM – Influenza virus А, HEX – ВК Пороговые значения для канала FAM должны составлять «п-» = 2,5 и «п+» = 2,8.

Пороговое значение для канала HEX =2.5.

Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список тестов». Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения, указанные выше, и сохранить изменения при выходе из программы.

Проведение детекции.

Включить прибор и запустить программу «Gene» на компьютере, присоединенном к прибору.

Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов и количество фоновых пробирок (2), выбрать нужный тест (ГРИПП) в графе «Тест», нажать кнопку «OK»

(кнопкой мыши) и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).

В качестве образцов, обозначенных «ФОН», использовать пробирки с контрольными образцами «ФОН».

Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной последовательностью (сначала первые 12 образцов) и запустить детекцию, нажав кнопку, обозначенную значком цветной призмы, в панели активных кнопок (вверху экрана). По окончании детекции первой группы заменить пробирки на следующую группу пробирок и продолжить измерения, нажав кнопку «OK». По окончании детекции вынуть пробирки и нажать кнопку «OK».

Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин».

Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «Gene»

(колонка «Результат» на экране). Положительные образцы обозначаются знаком «+» на красном фоне; отрицательные образцы – знаком «-» на зеленом фоне; образцы, для которых получен сигнал, который нельзя однозначно интерпретировать, требующие повторного анализа, обозначены знаком «?» на желтом фоне.

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см. табл. 7).

–  –  –

Образцы, в которых отсутствует специфический сигнал как по каналу «FAM», так и по каналу «HEX», обозначаются в графе результатов знаком «нд» (не детектируется) на желтом фоне. Эти образцы требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае, если повторно получен результат «нд», требуется повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. (Для образца «K-» результат «нд» является нормой).

Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал, значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

Б. Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4» («BioSan», Латвия).

Настройка теста.

Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:

Наименование теста - «ГРИПП»

Привязка каналов: FAM - Influenza virus А, HEX – ВК Пороговые значения для канала FAM должны составлять «п-» = 2,5 и «п+» = 2,8.

Пороговое значение для канала HEX =2.5.

Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список тестов». После ввода указанных значений, следует нажать кнопку «Сохранить».

Проведение детекции.

Включить прибор и запустить программу «ALA-1» на компьютере, присоединенном к прибору.

Задать протокол измерения. Для этого в главном меню выбрать «Протокол» «Создать новый» или «Открыть», чтобы открыть созданный ранее протокол.

В окне протокола необходимо выбрать тип используемого ротора (36 х 0,5 или 48 х 0,2), ввести номер протокола, выбрать нужный тест (ГРИПП) в меню-вкладке «Тест» и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).

Обозначить образцы, которые являются фоновыми для данной группы образцов, как «ФОН» (используя сочетание клавиш «Ctrl» и «F»). В качестве образцов, обозначенных «ФОН» использовать пробирки с контрольными образцами «ФОН».

Закрыть окно редактирования протокола, нажав на кнопку Exit в верхнем левом углу панели. Протокол сохранить.

Поставить пробирки в ячейки ротора в соответствии с заданной последовательностью и запустить детекцию, выбрав в меню «Протокол» «Детекция» или значок Детекция по протоколу на панели инструментов (вверху экрана).

Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4».

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 20 из 44 Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «ALA_1».

Результаты в таблице представляются с помощью следующих обозначений:

«обнаружено» – положительный результат;

«не обнаружено» – отрицательный результат;

«сомнительно» – результат, который нельзя однозначно интерпретировать (сигнал по каналу, отведенному для детекции специфической ДНК, превышает пороговое значение, допустимое для отрицательных образцов, но не превышает пороговое значение для положительных образцов (сигнал в так называемой «серой зоне»);

«нд» – недостоверный результат (в образце не детектируется (не превышает заданного порогового значения) ни специфический сигнал, ни сигнал ВКО).

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см. табл. 8).

Таблица 8.

Оценка результатов анализа контрольных образцов Результат автоматической интерпретации Контролируемый Контроли этап 1 (FAM) 2 (HEX) «В–» Экстракция РНК «грипп A - не обнаружено» ВКО+ ПЦР «грипп А - нд» ВКОК–»

«К+» ПЦР «грипп А - обнаружено» ВКООбразцы, для которых получен результат «нд» (кроме «К-»), требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае, если повторно получен результат «нд», требуется повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Для образца «K-» результат «нд»

является нормой.

Образцы, для которых получен результат «сомнительно», требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае повторения аналогичного результата образцы считать положительными.

Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал, значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

–  –  –

Настройки теста можно установить, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список тестов».

Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения, указанные выше, и сохранить изменения при выходе из программы.

Проведение детекции.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 22 из 44 Включить прибор и запустить программу «Gene» на компьютере, присоединенном к прибору.

Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов и количество фоновых пробирок (2), выбрать нужный тест (ВГП Н5Н7H9) в графе «Тест», нажать кнопку «OK» (кнопкой мыши) и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).

В качестве образцов, обозначенных «ФОН», использовать пробирки с контрольными образцами «ФОН».

Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной последовательностью (сначала первые 12 образцов) и запустить детекцию, нажав кнопку, обозначенную значком цветной призмы, в панели активных кнопок (вверху экрана). По окончании детекции первой группы заменить пробирки на следующую группу пробирок и продолжить измерения, нажав кнопку «OK». По окончании детекции вынуть пробирки и нажать кнопку «OK».

Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин».

Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «Gene».

Знак «нд» будет соответствовать образцам, в которых не обнаружены субтипы вируса гриппа, имеющие в своем составе гемагглютинин 5, 7 или 9 типа.

–  –  –

Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз для всех образцов.

Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал по любому каналу значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

Б. Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4» («BioSan», Латвия).

Настройка теста.

Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:

Наименование теста - «ВГП Н5Н7H9»

Привязка каналов: FAM – H5, HEX – H7, ROX – H9 Пороговые значения для всех каналов должны составлять «п-» = 2,5 и «п+» = 2,8.

Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список тестов».

После ввода указанных значений, следует нажать кнопку «Сохранить».

Проведение детекции.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 23 из 44 Включить прибор и запустить программу «ALA_1» на компьютере, присоединенном к прибору.

Задать протокол измерения. Для этого в главном меню выбрать «Протокол» «Создать новый» или «Открыть», чтобы открыть созданный ранее протокол.

В окне протокола необходимо выбрать тип используемого ротора (36 х 0,5 или 48 х 0,2), ввести номер протокола, выбрать нужный тест (ВГП Н5Н7H9) в меню-вкладке «Тест» и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).

Обозначить образцы, которые являются фоновыми для данной группы образцов, как «фон» (используя сочетание клавиш «Ctrl» и «F»). В качестве образцов, обозначенных «ФОН» использовать пробирки с контрольными образцами «ФОН».

Закрыть окно редактирования протокола, нажав на кнопку Exit в верхнем левом углу панели. Протокол сохранить.

Поставить пробирки в ячейки ротора в соответствии с заданной последовательностью и запустить детекцию, выбрав в меню «Протокол» «Детекция» или значок Детекция по протоколу на панели инструментов (вверху экрана).

Учет результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «АЛА-1/4».

Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «ALA_1».

Результаты в таблице представляются с помощью следующих обозначений:

«обнаружено» – положительный результат;

«не обнаружено» – отрицательный результат;

«сомнительно» – результат, который нельзя однозначно интерпретировать (сигнал по каналу, отведенному для детекции специфической ДНК, превышает пороговое значение, допустимое для отрицательных образцов, но не превышает пороговое значение для положительных образцов (сигнал в так называемой «серой зоне»).

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см. табл. 11).

Таблица 11.

Оценка результатов анализа контрольных образцов Контроли Контролируемый Результат автоматической интерпретации этап 1 (FAM) 2 (HEX) 3 (ROX) «В–» Экстракция РНК «H5 – не обнаружено» «Н7 – не обнаружено» «Н9 – не обнаружено»

ПЦР «К–» «H5 – не обнаружено» «Н7 – не обнаружено» «Н9 – не обнаружено»

«К+» ПЦР «H5 – обнаружено» «Н7 – обнаружено» «Н9 – обнаружено»

Образцы, для которых получен результат «сомнительно», требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае повторения аналогичного результата образцы считать положительными.

Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

Если в отрицательном контроле («В–» или «К–») детектируется положительный сигнал, значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

–  –  –

Выявление РНК Influenza virus A («ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F для ПЦРамплификации кДНК Influenza virus A).

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT

Influenza virus A, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A 5 мкл ПЦР-буфера-Flu 0,5 мкл полимеразы (TaqF) Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.

В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ТЕ-буфера;

б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A

в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл ПКО STI-88.

Б. Проведение амплификации.

Поместить пробирки в карусель амплификатора Rotor-Gene (ячейки карусели пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения проб в амплификаторе).

Запрограммировать прибор.

Программирование амплификатора.

Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу Rotor-Gene версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000 - программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build

67) или выше.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения, указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.

Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.

В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)».

Нажать кнопку «New»/«Новый».

Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окне рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».

Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Выбрать объем реакционной смеси: «Reaction volume»/«Объем реакции» -25 мкл. Для прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 µl oil layer volume»/«15 L объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с помощью мышки).

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 25 из 44 Нажать кнопку «Next»/«Далее».

В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».

Задать следующие параметры эксперимента:

95 °С - 15 мин

1. Hold/Удерж.темп-ры 95 °С - 10 с

2. Cycling/Циклирование 54 °С - 20 с 72 °С - 10 с Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз.

3. Cycling2/Циклирование2 95 °С - 10 с 54 °С - 20 с - Детекция 72 °С - 10 с Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз.

4. Флуоресценцию измеряют при 54 С (во втором блоке циклирования) на каналах FAM/Green и JOE/Yellow.

5. Нажать дважды кнопку «OK»/«Да».

В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«Опт.уровня сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для канала установить параметры FAM/Green Min reading/Миним.сигнал –10Fl и Max reading/Максим. сигнал – 20Fl. Для канала JOE/Yellow установить параметры Min reading/Миним.сигнал –5Fl и Max reading/Максим. сигнал – 10Fl. Пометить галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before 1st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1st Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Окно закрыть, нажав кнопку «Close»/«Закрыть». Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Запустить амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».

Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку «Edit samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и контроли обозначить в меню Samples/Тип как Unknown/Образец.

В. Анализ результатов.

Анализируют результаты амплификации участка кДНК Influenza virus A и ВКО.

Накопление продукта амплификации участка кДНК Influenza virus A детектируется по каналу FAM/Green, а накопление продукта амплификации ВКО – по каналу для детекции флуорофора JOE/Yellow.

Анализ результатов амплификации ВКО.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE» («Cycling A.Yellow» для прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 20%.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.1.

В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся значения Ct, которые должны быть не более 31 для исследуемых образцов и контролей.

Анализ результатов амплификации кДНК Influenza virus A.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM» («Cycling A.Green» для Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 26 из 44 прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор Threshold/Порога.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.

В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся значения Ct.

Г. Учет результатов.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов (см. описание для данного прибора).

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.

табл. 12).

Таблица 12.

Оценка результатов анализа контрольных образцов Результат (значение Сt) Контроли Контролируемый этап Канал FAM/Green Канал JOE/Yellow «В–» Экстракция РНК отсутствует 31 ПЦР отсутствует отсутствует «К–»

«К+» ПЦР отсутствует «ВК+» ПЦР отсутствует 31 Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM/Green менее 33.

Образец считают отрицательным, если по каналу FAM/Green для него значение Сt отсутствует, а по каналу JOE/Yellow для него определено значение Ct, не превышающее 31.

Если значение Ct на канале FAM/Green больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале FAM/Green менее 33.

Образцы, для которых отсутствует значение Ct как по каналу FAM/Green, так и по каналу JOE/Yellow, или получено значение Сt по каналу JOE/Yellow более 31, требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае, если повторно получен аналогичный результат, требуется повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции.

Возможные ошибки:

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля экстракции РНК (на канале FAM/Green) и для отрицательного контроля ПЦР (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Идентификация субтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRTF для идентификации субтипов H5, H7, H9 Influenza virus A).

Для идентификации субтипов H5, H7 и Н9 используют образцы кДНК, полученные после реакции обратной транскрипции.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9 перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр.

27 из 44 Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9 5 мкл ПЦР-буфера-Flu 0,5 мкл полимеразы (TaqF) Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.

В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ТЕ-буфера;

б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H5, Н7, Н9;

Б. Проведение амплификации.

Поместить пробирки в карусель амплификатора Rotor-Gene (ячейки карусели пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения проб в амплификаторе).

Запрограммировать прибор.

Программирование амплификатора «Rotor-Gene»:

Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу Rotor-Gene версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000- программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build

67) или выше.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.

Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.

В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)».

Нажать кнопку «New»/«Новый».

Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окне рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».

Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Выбрать объем реакционной смеси: «Reaction volume»/«Объем реакции» -25 мкл. Для прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 µl oil layer volume»/«15 L объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с помощью мышки).

Нажать кнопку «Next»/«Далее».

В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».

Задать следующие параметры эксперимента:

95 °С - 15 мин

1. Hold/Удерж.темп-ры 95 °С - 10 с

2. Cycling/Циклирование 54 °С - 20 с 72 °С -10 с Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз.

3. Cycling2/Циклирование2 95 °С - 10 с 54 °С – 20 с – Детекция 72 °С -10 с Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 28 из 44

4. Флуоресценцию измеряют при 54С (во втором блоке циклирования) на каналах FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange.

5. Нажать дважды кнопку «OK»/«Да».

В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«Опт.уровня сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для канала установить параметры FAM/Green Min reading/Миним.сигнал – 10Fl и Max reading/Максим. сигнал – 20Fl. Для каналов JOE/Yellow и ROX/Orange установить параметры Min reading/Миним.сигнал –5Fl и Max reading/Максим. сигнал – 10Fl. Пометить галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before 1st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1st Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Окно закрыть, нажав кнопку «Close»/«Закрыть». Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Поместить предварительно подготовленные пробирки в амплификатор. Запустить амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».

Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку «Edit samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и контроли обозначить в меню Samples/Тип как Unknown/Образец.

В. Анализ и учет результатов.

Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н5 – по каналу FAM/Green, кДНК Influenza virus A Н7 детектируется по каналу JOE/Yellow, кДНК Influenza virus A Н9 – по каналу ROX/Orange.

Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A H5.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM» («Cycling A.Green» для прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.

В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся значения Ct.

Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM/Green менее 33.

Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале FAM/Green отсутствует.

Если значение Ct на канале FAM/Green больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале FAM/Green менее 33.

Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н7.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE» («Cycling A.Yellow» для прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.1.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 29 из 44 В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся значения Ct.

Образец считают положительным, если значение Ct на канале JOE/Yellow менее 33.

Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале JOE/Yellow отсутствует.

Если значение Ct на канале JOE/Yellow больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале JOE/Yellow менее 33.

Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A H9.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. ROX» («Cycling A.Orange» для прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть нажаты две кнопки «Dynamic tube»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«Коррект.уклона».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.

В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся значения Ct.

Образец считают положительным, если значение Ct на канале ROX/Orange менее 33.

Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале ROX/Orange отсутствует.

Если значение Ct на канале ROX/Orange больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале ROX/Orange менее 33.

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.

табл. 13).

Таблица 13.

Оценка результатов анализа контрольных образцов Результат (значение Сt) Контроли Контролируемый этап Канал FAM/ Канал JOE/ Канал Green Yellow ROX/Orange отсутствует отсутствует «К–» ПЦР отсутствует «К+» ПЦР 26 26 26 Возможные ошибки Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного образца и для отрицательного контроля ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Идентификация субтипа H1 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRT для идентификации гриппа свиней А/Н1).

Для идентификации субтипа H1 используют образцы кДНК, полученные после реакции обратной транскрипции.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 30 из 44 A/H1-swine для амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 7 мкл ПЦР-смеси-2-FL, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A/H1swine.

Б. Проведение амплификации.

В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ТЕ-буфера;

б) положительный контроль (К+ H1-swine) - в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A/H1-swine;

в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл ПКО STI-88.

В. Программирование амплификатора «Rotor-Gene»:

Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 следует использовать программу Rotor-Gene версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000- программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build

67) или выше.

Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.

Нажать кнопку «New»/«Новый» в основном меню программы.

В открывшемся окне выбрать меню «Advanced»/«Детальный мастер» и шаблон запуска эксперимента «Dual Labeled Probe»/«Hydrolysis probes»/«Флуоресцентные зонды (TaqMan)».

Нажать кнопку «New»/«Новый».

Выбрать тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Поставить отметку в окне рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено».

Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Выбрать объем реакционной смеси: «Reaction volume»/«Объем реакции» -25 мкл. Для прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 µl oil layer volume»/«15 L объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, поставить ее с помощью мышки).

Нажать кнопку «Next»/«Далее».

В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля».

Задать следующие параметры эксперимента:

95 °С - 5 мин

1. Hold/Удерж.темп-ры 95 °С - 10 с

2. Cycling/Циклирование 54 °С - 20 с 72 °С - 10 с Cycle repeats/Цикл повторить – 10 times/раз.

3. Cycling2/Циклирование2 95 °С - 10 с 54 °С - 20 с – Детекция 72 °С - 10 с Cycle repeats/Цикл повторить – 35 times/раз.

4. Флуоресценцию измеряют при 54С (во втором блоке циклирования) на каналах FAM/Green и JOE/Yellow.

5. Нажать дважды кнопку «OK»/«Да».

В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«Опт.уровня сигн.». В открывшемся окне нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для обоих каналов FAM/Green и JOE/Yellow установить параметры Min Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 31 из 44 reading/Миним.сигнал – 5Fl и Max reading/Максим. сигнал – 10Fl. Пометить галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before 1st Acquisition»/«Perform Optimisation Before 1st Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Окно закрыть, нажав кнопку «Close»/«Закрыть». Нажать кнопку «Next»/«Далее».

Поместить предварительно подготовленные пробирки в амплификатор. Запустить амплификацию кнопкой «Start run»/«Старт».

Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо запрограммировать положение пробирок в роторе. Для этого надо использовать кнопку «Edit samples»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и контроли обозначить в меню Samples/Тип как Unknown/Образец.

Анализ и учет результатов.

Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н1 детектируется по каналу JOE/Yellow, ВКО – по каналу FAM/Green.

Анализ результатов амплификации ВКО.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. FAM» («Cycling A.Green» для прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 0%.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» выставить Threshold/Порог = 0.1.

В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н1.

Нажать в меню кнопку «Analysis»/«Анализ», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Количественный», нажать кнопку «Cycling A. JOE» («Cycling A.Yellow» для прибора «Rotor-Gene» 6000), «Show»/«Показать».

Отменить автоматический выбор Threshold/Порог.

В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть нажата кнопка «Dynamic tube»/«Динамич.фон».

В меню основного окна «More settings»/«Outlier Removal»/«Устранение выбросов»

установить значение NTC threshold /Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.

В меню «CT Calculation»/«Вычисление Ct» (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0.1.

В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные результаты») появятся значения Ct.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации (см. табл. 14).

–  –  –

В исследуемом образце идентифицирован вирус гриппа А/H1-swine, если имеется значение Ct по каналу JOE/Yellow.

Если в исследуемом образце отсутствует значение Ct по каналу JOE/Yellow, а значение Ct по ВКО (канал FAM/Green) не превышает 28 циклов, следует считать, что в этом образце вирус гриппа А/H1-swine не идентифицирован.

Если в исследуемом образце отсутствуют значение Ct по каналу JOE/Yellow, а значение Ct по ВКО (канал FAM/Green) превышает 28 циклов или отсутствует, то требуется повторить анализ данной пробы, начиная с этапа экстракции РНК.

Возможные ошибки.

Отсутствие положительного сигнала в пробах с положительными контролями ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными.

Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

–  –  –

Выявление РНК Influenza virus A («ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F для амплификации кДНК Influenza virus A).

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT

Influenza virus A, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ПЦР-смеси-1- FEP/FRT Influenza virus A 5 мкл ПЦР-буфера-Flu 0,5 мкл полимеразы (TaqF) Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.

В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ТЕ-буфера;

б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A;

в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл ПКО STI-88.

Б. Проведение амплификации.

Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.

Поместить подготовленные пробирки в амплификатор.

Открыть программу iCycler.

Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала.

Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме Whole Plate loading. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.

Для прибора «iCycler iQ» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением.pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно редактировать уже использованную ранее схему планшета, для этого в окне Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением.pts) и нажать кнопку Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед использованием. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 34 из 44 Задать программу амплификации.

Программа «Gripp»:

95 °С –15 мин 10 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с /72 °С – 25 с 35 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с (детекция) /72 °С – 25 с детекция флуоресценции на 2-м шаге (54 °С) второго блока циклирования Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы протоколов сохраняются в папке Users).

Для прибора «iCycler iQ» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (Gripp.tmo) и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.

Запустить выполнение выбранной программы «Gripp» с заданной схемой планшета.

Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

Для прибора «iCycler iQ» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета.

Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

После окончания программы приступить к анализу результатов.

Анализ результатов.

Анализируют результаты амплификации участка кДНК Influenza virus A и ВКО.

Накопление продукта амплификации участка кДНК Influenza virus A детектируется по каналу FAM, а накопление продукта амплификации ВКО – по каналу для детекции флуорофора JOE.

Полученные данные интерпретируются с помощью программного обеспечения прибора по наличию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).

Анализ результатов амплификации ВКО.

Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу JOE.

При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 35 из 44 JOE-530. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации кДНК Influenza virus A.

Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу FAM, отключив кнопку JOE. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iCycler iQ» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.

Учет результатов.

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.

табл. 15).

Таблица 15.

Оценка результатов анализа контрольных образцов Результат (значение Сt) Контроли Контролируемый этап Канал «FAM» Канал «JOE»

«В–» Экстракция РНК отсутствует 31 «К–» ПЦР отсутствует отсутствует «К+» ПЦР отсутствует «ВК+» ПЦР отсутствует 30 Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM менее 33.

Образец считают отрицательным, если по каналу FAM для него значение Сt отсутствует (в графе Сt указывается значение N/A), а по каналу JOE для него определено значение Ct, не превышающее 31.

Если значение Ct на канале FAM больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале FAM менее 33.

Образцы, для которых отсутствует значение Ct как по каналу FAM, так и по каналу JOE, или получено значение Сt по каналу JOE более 31, требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае, если повторно получен аналогичный результат, требуется повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции РНК.

Возможные ошибки:

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контрольного образца (на канале FAM) и для отрицательного контроля ПЦР (ТЕ-буфер) (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 36 из 44 анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Идентификация субтипов Н5, Н7 и Н9 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRTF для идентификации субтипов H5, H7, H9 Influenza virus A).

Для идентификации субтипов H5, H7 и Н9 используют образцы кДНК, полученные после реакции обратной транскрипции.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Пробирку с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9 перемешать на вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9, ПЦР-буфер-Flu, полимеразу (TaqF), из расчета на каждую реакцию:

10 мкл ПЦР-смеси-1-FEP/FRT Influenza virus A Н5, Н7, Н9 5 мкл ПЦР-буфера-Flu 0,5 мкл полимеразы (TaqF) Перемешать смесь на вортексе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл.

В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ТЕ-буфера;

б) положительный контрольный образец (К+) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A H5, Н7, Н9.

Б. Проведение амплификации.

Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.

Поместить подготовленные пробирки в амплификатор.

Открыть программу iCycler.

Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM, JOE и ROX.

Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме Whole Plate loading. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.

Для прибора «iCycler iQ» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM, JOE и ROX.

Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением.pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана).

Можно редактировать уже использованный ранее Plate Setup, для этого в окне Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением.pts) и нажать кнопку Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед использованием. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.

Задать программу амплификации.

Программа «Gripp»:

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 37 из 44 95 °С – 15 мин 10 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с /72 °С – 25 с 35 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с (детекция) /72 °С – 25 с детекция флуоресценции на 2-м шаге (54 °С) второго блока циклирования Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы протоколов сохраняются в папке Users).

Для прибора «iCycler iQ» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (Gripp.tmo) и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.

Запустить выполнение выбранной программы «Gripp» с заданной схемой планшета.

Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

Для прибора «iCycler iQ» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета.

Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

После окончания программы приступить к анализу результатов.

Анализ и учет результатов.

Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н7 детектируется по каналу JOE, кДНК Influenza virus A Н5 – по каналу FAM, кДНК Influenza virus A Н9 – по каналу ROX.

Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A H5.

Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iCycler iQ» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии.

Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles.

В таблице результатов появятся значения Ct.

Образец считают положительным, если значение Ct на канале FAM менее 33.

Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале FAM отсутствует. Если значение Ct на канале FAM больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 38 из 44 положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале FAM менее 33.

Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н7.

Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу JOE, отключив кнопку FAM.

При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала JOE-530. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.

Образец считают положительным, если значение Ct на канале JOE менее 33.

Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале JOE отсутствует. Если значение Ct на канале JOE больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале JOE менее 33.

Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н9.

Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу ROX, отключив кнопку JOE.

При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала ROX-575. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.

Образец считают положительным, если значение Ct на канале ROX менее 33.

Образец считают отрицательным, если значение Ct на канале ROX отсутствует. Если значение Ct на канале JOE больше 33, требуется повторить ПЦР и считать его положительным в случае повторения результата или получения значения Ct на канале JOE менее 33.

Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции РНК (см.

табл. 16).

–  –  –

Идентификация субтипа H1 вируса гриппа А («ПЦР-комплект» вариант FRT для идентификации гриппа свиней А/Н1).

Для идентификации субтипа H1 используют образцы кДНК, полученные после реакции обратной транскрипции.

А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A/H1-swine для амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб.

На поверхность воска внести по 7 мкл ПЦР-смеси-2-FL, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-FEP/FRT Influenza virus A/H1swine.

Б. Проведение амплификации.

В подготовленные для ПЦР пробирки, используя наконечники с аэрозольным барьером, внести по 10 мкл кДНК, полученных в реакции обратной транскрипции РНК.

Поставить контрольные реакции амплификации:

а) отрицательный контрольный образец (К-) – вместо кДНК-пробы в пробирку внести 10 мкл ТЕ-буфера;

б) положительный контроль (К+ H1-swine) - в пробирку внести 10 мкл ПКО кДНК Influenza virus A/H1-swine;

в) положительный контроль амплификации ВКО (ВК+) - в пробирку внести 10 мкл ПКО STI-88.

В. Проведение амплификации.

Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не менее, чем через 30 мин после включения оптической части прибора.

Открыть программу iCycler.

Задать схему планшета - расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE.

Для прибора «iQ5» для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме Whole Plate loading. Задать объем реакции (Sample Volume) 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.

Для прибора «iCycler iQ» отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 40 из 44 расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением.pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно редактировать уже использованный ранее Plate Setup, для этого в окне Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением.pts) и нажать кнопку Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед использованием.

Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.

Задать программу амплификации.

Программа «Gripp Н1»:

95 °С – 5 мин 10 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с /72 °С – 25 с 35 циклов: 95 °С – 10 с / 54 °С – 25 с (детекция) /72 °С – 25 с детекция флуоресценции на 2-м шаге (54 °С) второго блока циклирования Для прибора «iQ5» для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы протоколов сохраняются в папке Users).

Для прибора «iCycler iQ» создать программу амплификации, выбрав опцию Edit Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (Gripp Н1.tmo) и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.

Запустить выполнение выбранной программы «Gripp Н1» с заданной схемой планшета.

Для прибора «iQ5» перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

Для прибора «iCycler iQ» перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета.

Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.

После того, как температура реакционного блока достигнет 95 С, нажать кнопку Pause, открыть крышку и поместить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора и нажать кнопку Resume Run (для прибора «iCycler iQ» – кнопку Continue Running Protocol).

После окончания программы приступить к анализу результатов.

Анализ и учет результатов.

Результаты амплификации кДНК Influenza virus A Н1 детектируется по каналу JOE, ВКО – по каналу FAM.

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 41 из 44 Анализ и учет результатов амплификации ВКО.

Для прибора «iQ5» выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iCycler iQ» в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии.

Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles.

В таблице результатов появятся значения Ct.

Анализ и учет результатов амплификации кДНК Influenza virus A Н1.

Для прибора «iQ5» выбрать в окне модуля данные по каналу JOE, отключив кнопку FAM.

При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Чтобы установить уровень пороговой линии нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.

Для прибора «iCycler iQ» в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала JOE-530. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Чтобы установить уровень пороговой линии, нужно перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.

–  –  –

Кат. №№: Формат EPh Форма 2: VET-31-50F-K; Формат FRT: Форма 2: VET-47-FRT-K2;

Форма 3: VET-55-FRT-K2; Форма 4: VET-46-FRT-K / Дата изменения: 28.05.13 / стр. 44 из 44



Похожие работы:

«НАУМОВА ЭВЕЛИН АРВИДОВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРЕСЕРВОВ ИЗ КИЛЬКИ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ, ОБОГАЩЕННЫХ КОМПОНЕНТАМИ С ГИПОТЕНЗИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ 05.18.04 Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств 05.18.07 Биотехнологи...»

«Муниципальное автономное образовательное учреждение дополнительного образования детей Центр дополнительного образования детей "СТРАТЕГИЯ" Рассмотрено на заседании кафедры естественно-географических дисциплин протокол № от "_" 2012 г. Рабочая прогр...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" В. Л. МЕЛЬНИКОВ Н. Н. МИТРОФАНОВА Л. В. МЕЛЬНИКОВ АУТОИММУННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ПЕНЗА 2015 МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ...»

«Паспорт группы № 4 "Пчелки" Воспитатели: Кудренко И. Ю Норкова Ю. М. п. Горноправдинск 2015 г. Паспорт группы "Пчелка" РАЗДЕВАЛКА 1. Информационный стенд для родителей "Расписание НОД", "Режим дня", "Советы по экологическому воспитанию", "Патриотическое во...»

«Китаев Константин Альбертович ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОАДАПТАЦИИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА (LEPTINOTARSA DECEMLINEATA SAY) И ЕГО ЭНТОМОФАГОВ 03.02.07 – генетика 03.02.08– экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата...»

«КАТАЛОГ ПРОДУКЦИИ СЕНТЯБРЬ 2014 610035 Россия, Кировская область г. Киров, ул. Производственная, 35 (8332) 555-565 многоканальный сайт: www.slad-sloboda.ru e-mail: sl@slad-sloboda.ru ПЯТИЗВЕЗДОЧНАЯ КОМПАНИЯ Звезда высокого качеств...»

«ГБУ "Республиканская имущественная казна" (специализированная организация) руководствуясь ст. 448 Гражданского кодекса Российской Федерации, ст.18 Федерального закона от 14.11.2002г. №...»

«техническое описание материалов системы АРХИТЕКТОР АРХИТЕКТОР–ИНТЕРЬЕР–ВД–АК–235 ЭМАЛЬ АКРИЛОВАЯ ВОДНАЯ ТУ 2312–004–40898471–2004 ОПИСАНИЕ И ОБЛАСТЬ "АРХИТЕКТОР–ИНТЕРЬЕР–ВД–АК–235" – экологически чистая тиксотропная супер-белая эмаль на основе водной дисперсии чистых акриловых смол. По стойкости к мытью и истирающим наПРИМЕНЕНИЯ гру...»

«СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПОЛИТИК БАНКОВ ОАО БАНК ВТБ, ОАО СБЕРБАНК РОССИИ, ЗАО КБ "СИТИБАНК" Тихов А.А. Санкт-Петербургский государственный университет, факультет географии и геоэкологии (Институт наук о Земле), кафедра экологической...»

«Маршрутизаторы серии ESR ESR-100, ESR-200, ESR-1000 Руководство по эксплуатации, версия ПО 1.1.0 Версия документа Дата выпуска Содержание изменений Версия 1.8 14.12.2016 Добавлены разделы: 7.2 Настройка терминации Q-in-Q 7.20 Настройка LT-туннелей 7.31 Настройка VRRP tracking Версия 1.7 03.03.2016 Добавл...»

«МУНИЦИПАЛЬНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ГИМНАЗИЯ Г. РАМЕНСКОЕ" МЕТАМОРФОЗ КАК АДАПТАЦИЯ РАЗВИТИЯ К РАЗЛИЧНЫМ УСЛОВИЯМ СРЕДЫ Авторы работы: Гулай Алина, Исфандиярова Юлия, ученицы 9 "В" класса эл. почта: julya4444@yandex.ru Научные руководители: Дорох...»

«Аннотация Автор: Мурашко Елизавета Михайловна МБОУ Гимназия № 7 Тема работы: Многообразие значений бархатцев. Руководитель: Азарова Людмила Вячеславовна, учитель биологии МБОУ гимназия № 7 Это растение и...»

«1. КРАТКАЯ АННОТАЦИЯ Курс посвящен знакомству с многообразием экологических проблем на урбанизированных территориях и усвоение основных навыков их решения.2. МЕСТО ДИСЦИПЛИНЫ (МОДУЛЯ) В СТРУКТУРЕ ОПОП Данная учебная дисциплина включена в раздел Б1.В.ДВ.5 Дисциплины (модули) основ...»

«I. Аннотация 1. Цели и задачи дисциплины Курс БИОГЕОЦЕНОЛОГИЯ предназначен для студентов 4 курса. Цель курса – способствовать развитию представления о биогеоценозе, как едином целом, выработке умений оценки фитоценозов, зооценозов, биоценозов и их отдельных компон...»

«УДК 581.522.4(470.26) Н. Г. Петрова, Ю. В. Чернышова, В. П. Дедков, С. А. Яковлева АДАПТАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ И ЭКОЛОГИЯ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ ИРАНО-ТУРАНСКОГО ИНТРОДУКЦИОННОГО ЦЕНТРА В УСЛОВИЯХ ЮЖНОЙ ПРИБАЛТИКИ (КАЛИНИНГРАДСКАЯ ОБЛАСТЬ) Изучена история интродукции древесных растений Ирано-Туранского...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, III, 1, 1969 УДК 576.895.421 ИНТЕНСИВНОСТЬ ГАЗООБМЕНА У КЛЕЩЕЙ HYALOMMA ASIATICUM P. SCH. ЕТ Е. SCHL., ЗАРАЖЕННЫХ РИККЕТСИЯМИ COXIELLA BURNETI И DERMACENTROXENUS SIBIRICUS Ю...»

«МАТЕМАТИЧНЕ МОДЕЛЮВАННЯ УДК 631.4:004.358 А. К. Балалаев ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МОДЕЛЬНОГО ПОРОВОГО ПРОСТРАНСТВА ЭДАФОТОПА О. К. Балалаєв Дніпропетровський національний університет ЕКОЛОГІЧНА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ ГЕОМЕТРИЧНИХ ХАРАКТЕРИСТИК МОДЕЛЬНОГО ПОРОВОГО ПРОСТОРУ ЕДАФОТОПУ Моделювався синтез...»

«ОТКРЫВАЕМ ВОЛШЕБНЫЙ МИР НАУКИ БИОТЕХНОЛОГИЯ В этом году исполняется тринадцать лет секции "Биотехнология" Малой академии наук (МАН), которая была создана в 2000 году в Днепропетровском отделении МАН на базе областного...»

«Известия ТИНРО 2016 Том 184 УДК 593.12(265.54) Т.С. Тарасова1, А.В. Романова2, С.П. Плетнев3, В.К. Аннин3* Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17; Дальневосточный геологический институт ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, просп. 100-летия Владивостока, 15...»

«УТЕРЖДЕНО приказом Генерального директора ЗАО "Страховая группа "УралСиб" от 03.06.2004 года № 241 Регистрационный номер: 115 ПРАВИЛА ДОБРОВОЛЬНОГО СТРАХОВАНИЯ ГРАЖДАНСКОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ОЦЕНЩИКОВ Москва, 2004 г. ЗАО "Страховая группа "УралСиб". Правила страхования ОГЛАВЛЕНИЕ 1. СУБЪЕ...»

«I. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ Экология – дисциплина, изучающая научные основы функционирования надорганизменных систем: популяций, биоценозов, экосистем и биосферы в целом.1.1. Цель дисциплины – сформ...»

«Педагогико-психологические и медико-биологические проблемы физической культуры и спорта, №2(23) 2012 ISSN 2070 4798 УДК 796.032.2 ОЛИМПИЙСКИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ КАК НАСЛЕДИЕ ЗИМНИХ ИГР З.М. Кузнецова – доктор педагогических на...»

«ГБУ "Республиканская имущественная казна" (специализированная организация) руководствуясь ст. 448 Гражданского кодекса Российской Федерации, ст.3 Федерального закона от 03.11.2006г. № 174-ФЗ "Об автономных учреждениях", распоряжением Кабин...»

«ОСНОВЫ ЛАНДШАФТНОЙ ЭКОЛОГИИ ЕВРОПЕЙСКИХ ТАЕЖНЫХ ЛЕСОВ РОССИИ А. Н. Громцев ОСНОВЫ ЛАНДШАФТНОЙ ЭКОЛОГИИ ЕВРОПЕЙСКИХ ТАЕЖНЫХ ЛЕСОВ РОССИИ Громцев Андрей Николаевич заведующий лабораторией ландшафтной экологии и охраны лесных экосистем Института леса Карельского научного центра РАН, доктор сельскохозя...»

«Бюллетень Никитского ботанического сада. 2011. Вып. 100 ОТ МЕТОДОВ ЗАЩИТЫ К ТЕОРИИ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКОГО УПРАВЛЕНИЯ (Итоги работы сектора энтомологии и фитопатологии НБС-ННЦ за 2000-2009 гг.) Е....»

«ПРОЕКТЫ ДОМОВ из оцилиндрованного бревна от бани до коттеджа из экологичного Подарок при материала строительстве! Северный Вологодский лес Как построить баню выгодно? Весеннее предложение Дом из оцилиндрованного бревна за 800 т. р. Большой выбор проектов на сайте RUSNL.RU № 11 О компании Компания "NL" произ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Кафедра " Микробиология и заразные болезни " МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ ОЮУЧАЮЩИХСЯ ПО ДИСЦИПЛИНЕ "Ветеринарное предпри...»

«Научный журнал КубГАУ, №101(07), 2014 года 1 УДК 504 UDC 504 ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ THE TRENDS IN ENVIRONMENTAL POLICY ПОЛИТИКИ В СОВРЕМЕННОМ МИРЕ IN THE MODERN WORLD Морозова Елена Васильевна Morozova Elena Vasilyevna д.ф.н., профессор, заведующая кафедрой Dr.Sci.Phil., head...»

«МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАУЧНЫЙ ЖУРНАЛ "ИННОВАЦИОННАЯ НАУКА" №5/2015 ISSN 2410-6070 8. ЦГА РСО-А. Ф.262. Оп.1. Д.45.9. ЦГА РСО-А. Ф.262. Оп.1. Д.77.10. ЦГА РСО-А. Ф.291. Оп.1. Д.10.11. ЦГА РСО-А. Ф.291. Оп....»

«Применение порошковой дифракции in situ для исследования процессов, происходящих при отжиге замороженных растворов в системах с клатратообразованием для создания высокоэффективных лекарственных форм нового поколения А.Г. Огиенко, Е.В. Болд...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.