WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«МЕМБРАНОМОДЕЛИРУЮЩИЕ СРЕДЫ ДЛЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ...»

На правах рукописи

ХАБИБУЛЛИНА Нелли Фамзуловна

МЕМБРАНОМОДЕЛИРУЮЩИЕ СРЕДЫ

ДЛЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Специальность: 03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» и в лаборатории инженерии белка Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Долгих Дмитрий Александрович кандидат биологических наук Люкманова Екатерина Назымовна

Официальные оппоненты:

Федоров Алексей Николаевич, доктор биологических наук, Курчатовский центр нано-, бионаук, информационных и конвергентных технологий с источниками синхротронного излучения и нейтронов и социогуманитарных наук Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр «Курчатовский Институт», заведующий лабораторией биохимии.



Чупин Владимир Викторович, доктор химических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В.

Ломоносова», профессор кафедры биотехнологии и бионанотехнологии.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия»

Российской академии наук.

Защита состоится "15" ноября 2012 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан "____" октября 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Мембранные белки (МБ) человека являются перспективными мишенями для разработки новых фармакологических препаратов. Для создания лекарственных средств, обладающих высокой селективностью по отношению к мембранным рецепторам определенного типа, необходимо знание пространственной структуры рецептора-мишени.

Несмотря на огромную важность дляфундаментальных и прикладных исследований, в настоящее время МБ остаются малоизученными. Трудности, возникающие при структурно-функциональных исследованиях МБ, обусловлены рядом факторов. Вопервых, системы клеточной экспрессии в большинстве случаев не могут обеспечить продукцию МБ в нативной конформации в количествах, необходимых для структурных исследований. Применение гетерологичных систем, основанных на использовании бактериальных клеток, позволяет решить проблему количественного выхода МБ, однако часто приводит к агрегации молекул целевого белка и накоплению его в виде нерастворимых “телец включения”. В этом случае для “восстановления” нативной конформации белковой молекулы требуется разработка процедуры ренатурации, эффективность которой часто невелика. Во-вторых, для стабилизации функционально активной конформации МБ требуется использование специальных мембраномоделирующих сред (мембранных миметиков), при этом выбор оптимального окружения для исследования конкретной белковой молекулы может представлять собой сложную и чрезвычайно трудоемкую задачу.

В последнее время для продукции МБ все чаще применяются бесклеточные белоксинтезирующие системы (ББС). Эти системы содержат все необходимые компоненты для протекания процессов транскрипции и трансляции in vitro: ДНК, содержащую ген целевого белка, ДНК-зависимую РНК-полимеразу, факторы транскрипции и трансляции, молекулы тРНК, рибосомы, аминокислоты, нуклеотиды и энергетические субстраты.

Возможность синтеза белков как про-, так и эукариотического происхождения делает ББС универсальным инструментом для решения многих задач современной молекулярной биологии и биотехнологии. Выходы целевых белков в таких системах достигают нескольких миллиграммов с 1 миллилитра реакционной смеси (РС), что позволяет получать МБ в препаративных количествах. Помимо этого, в ББС можно осуществлять синтез белков, токсичных для живых клеток. Открытый характер ББС делает возможным добавление в РС различных компонентов и кофакторов, что в некоторых случаях позволяет получать белки в нативной конформации. Так, например, для продукции МБ в растворимой форме в РС добавляют мембранные миметики, такие как мицеллы детергентов, липид-детергентные бицеллы, липосомы, липид-белковые нанодиски (ЛБН) и др. Кроме того, ББС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований, например, методами ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, разработка новых подходов для эффективной продукции МБ с использованием ББС является актуальной задачей молекулярной биологии и открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований и практического применения этих фармакологически важных молекул.

Цель работы Целью работы являлись разработка эффективных бесклеточных белоксинтезирующих систем на основе экстракта S30 Escherichia сoli, а также изучение возможности применения различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков) для продукции МБ в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной, для их последующих структурнофункциональных исследований.

Объектами исследования являлись трансмембранный (ТМ) домен рецепторной тирозинкиназы ErbB3 человека (ТМ-ErbB3), включающий одну ТМ-спираль, и мускариновый ацетилхолиновый рецептор М1 типа человека, содержащий семь ТМспиралей (М1-мАХР), относящийся к семейству рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR).

Основные задачи исследования

1) Разработать бесклеточные белоксинтезирующие системы для эффективной продукции ТМ-ErbB3 и М1-мАХР в количествах, достаточных для структурных и функциональных исследований.

2) Подобрать мембраномоделирующие среды, обеспечивающие синтез TM-ErbB3 и М1-мАХР в растворимой форме с пространственной структурой, близкой к нативной.

3) Методами ЯМР-спектроскопии провести сравнительный анализ пространственной структуры ТМ-ErbB3 в различных мембраномоделирующих средах (мицеллы, бицеллы, липид-белковые нанодиски).

4) Подобрать условия очистки и ренатурации М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.

5) Провести анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР в составе различных мембраномоделирующих сред.

Научная новизна и практическая значимость работы Все результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.

1) Разработаны ББС для эффективной продукции ТМ-ErbB3 и М1-мАХР как в виде осадка РС, так и в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов, бицелл, липосом и липид-белковых нанодисков (ЛБН).

2) Впервые методами ЯМР-спектроскопии определена пространственная структура TM-ErbB3 в окружении мицелл додецилфосфохолина (ДФХ), и установлено, что димеризация домена происходит по мотиву, не типичному для рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB.

3) На примере ТМ-ErbB3 проведен сравнительный анализ эффективности бесклеточного синтеза МБ в растворимом и структурированном виде в присутствии различных мембранных миметиков. С использованием КД- и ЯМР-спектроскопии, а также кросс-сшивающих реагентов показано, что в окружении мицелл, бицелл и ЛБН ТМ-ErbB3 формирует спиральные структуры, способные к димеризации.





4) На примере ТМ-ErbB3 показана возможность проведения прямых структурных исследований МБ, котрансляционно встроенных в бицеллы и ЛБН, методами ЯМРспектроскопии.

5) Показано, что использование в качестве N-концевых партнеров N-концевого фрагмента бактериородопсина грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum (ESR-таг), N-концевого фрагмента рибонуклеазы А (S-таг) и белка Mistic из Bacillus subtilis позволяет увеличить выход М1-мАХР в 10 – 72 раза до уровня 0.5– 3.6 мг с 1 мл РС.

6) Осуществлен бесклеточный синтез М1-мАХР в присутствии ЛБН. Наличие правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка М1-мАХР, котрансляционно встроенного в ЛБН, подтверждено методом ЯМР-спектроскопии путем наблюдения специфического взаимодействия с антагонистом рецептора телензепином.

7) Разработаны протоколы солюбилизации и очистки М1-мАХР из осадка РС, а также ренатурации рецептора в смешанных мицеллах додецилмальтозид/холестерил гемисукцинат (ДДМ/ХГС). Показано наличие специфического взаимодействия М1мАХР в составе мицелл ДДМ/ХГС с телензепином.

Результаты диссертационной работы могут быть интересны как с точки зрения фундаментальной науки, так и для прикладных разработок в области биотехнологии, фармакологии и медицины, например, при создании оптимальных протоколов продукции интегральных МБ. Кроме того, в перспективе, использование результатов работы может быть полезным для создания лекарственных препаратов, направленных на лечение онкологических заболеваний и расстройств нервной системы, связанных с дисфункциями рецепторных тирозинкиназ и мАХР.

Апробация работы Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на XXII Зимней международной молодежной научной школе “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, Россия, 2009), конференции “Euromar” (Флоренция, Италия, 2010), 35-ом конгрессе FEBS (Гтеборг, Швеция, 20101), Втором русско-греческом симпозиуме BioNanoTox (Ираклион, Крит, Греция, 2011), XIX Международной конференции и дискуссионном научном клубе “Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии” (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2011), 36-ом конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011), Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии ”Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова” (Москва-Пущино, Россия, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, Россия, 2012), Научной конференции “Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты” (Москва, Россия, 2012).

Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований. Основные результаты получены при непосредственном участии автора в планировании и проведении экспериментов. Исследования методами ЯМР-спектроскопии проведены совместно с к.ф.-м.н. н.с. К.С. Минеевым и к.ф.-м.н. с.н.с. З.О. Шенкаревым, сотрудниками лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из которых 3– статьи в реферируемых научных журналах, включенных в список ВАК, 11 – тезисы Российских и международных конференций, также подана 1 заявка на патент РФ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на ____ страницах машинописного текста, состоит из Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), а также Заключения и Выводов. Работа содержит ___ рисунков и ___ таблицы.

Библиографический указатель содержит ____ источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Бесклеточная продукция трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ErbB3 человека Рецепторная тирозинкиназа ErbB3 принадлежит семейству рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor; или ErbB, Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog), участвующих в процессах пролиферации и дифференцировки клеток. Рецепторы семейства ErbB содержат вариабельный внеклеточный N-концевой домен, отвечающий за связывание лигандов, мембранный домен, образованный одной ТМ-спиралью, и цитоплазматическую часть, в которую входят околомембранный домен, каталитический тирозинкиназный домен и С-концевая регуляторная область. За счет взаимодействия тирозинкиназных и ТМ-доменов рецепторы семейства ErbB формируют в мембране клетки каталитически неактивные гомо- или гетеродимерные комплексы. При связывании лиганда эти димеры рецепторов подвергаются конформационным перестройкам, ведущим к активации одного из внутриклеточных тирозинкиназных доменов. Дисфункция рецепторных тирозинкиназ часто является причиной злокачественной трансформации клеток.

Внутриклеточный тирозинкиназный домен рецептора ErbB3 не имеет самостоятельной ферментативной активности, тем не менее, так как рецепторы этого типа могут функционировать в виде гетеродимеров с другими представителями семейства ErbB, структурно-функциональные исследования ТМ-ErbB3 представляют интерес с точки зрения создания новых биомедицинских препаратов, нацеленных на контролируемую регуляцию работы рецепторов семейства эпидермального фактора роста.

На основе гена, кодирующего ТМ-ErbB3 в виде слитной конструкции с геном тиоредоксина (плазмида была любезно предоставлена с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН А.А.Шульгой), были получены последовательности генов TM-ErbB3 для продукции в виде индивидуального домена (остатки с 632 по 675, далее с 32 по 75), а также его укороченной мутантной формы (остатки 639-670, далее остатки 39-70, с заменой K39R, shTM-ErbB3) (Рис.1). Обе последовательности содержали участки, кодирующие дополнительно N-концевой остаток Met и С-концевую гексагистидиновую последовательность (His6-таг). Гены ТМ-ErbB3 и shTM-ErbB3 были клонированы в плазмиды на основе вектора pET22b(+) (Novagen, США) по сайтам рестрикции NdeI и BamHI.

Рис. 1. Аминокислотные последовательности ТМ-ErbB3 и shTM-ErbB3. Серым цветом выделены идентичные аминокислотные остатки.

В работе использовали ББС диализного типа на основе экстракта S30 E. coli, в которой питающая и реакционная смеси разделены полупроницаемой мембраной. В качестве матриц использовали плазмиды pET-22b(+)/ТМ-ErbB3 и pET-22b(+)/shTM-ErbB3.

Для продукции ТМ-ErbB3 был осуществлен подбор оптимальных концентраций ионов Mg2+ (11 мМ), K+ (80 мМ), а также плазмиды (0.3 мг/мл). Общее количество ТМ-ErbB3, синтезированного в этих условиях, составило 1.8-2.0 мг/мл РС.

Выделение TM-ErbB3 из осадка реакционной смеси и анализ полученных препаратов ТМ-ErbB3 является гидрофобным пептидом и при синтезе в бесклеточной системе образует нерастворимый осадок. Осадок РС, содержащий ТМ-ErbB3, солюбилизировали либо в додецилсульфате натрия (ДСН), либо в додецилфосфохолине (ДХФ), детергенте наиболее часто используемом для структурных исследований методами ЯМРспектроскопии. Солюбилизированные препараты очищали с помощью Ni2+-афинной хроматографии. Электрофоретический анализ показал высокую чистоту (95%) очищенных препаратов ТМ-ErbB3 и отсутствие в них высокомолекулярных агрегатов (Рис.

2А, вкладка). Данные КД-спектроскопии подтвердили преимущественно спиральную структурную организацию ТМ-ErbB3 как в окружении мицелл ДСН, так и в мицеллах ДФХ (Рис. 2А). Содержание спиральных элементов во вторичной структуре белка в обоих случаях составляло примерно ~50%, что хорошо согласуется с данными, полученными ранее для других ТМ-доменов рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB (~60%).

Незначительное снижение доли спиральной структуры в случае ТМ-ErbB3, видимо, связано с наличием в полученном белке дополнительного N-концевого остатка Met и шести С-концевых остатков His.

Для продукции селективно и тотально меченых вариантов домена в реакционную и питающую среды добавляли селективно или тотально меченые аминокислоты. Анализ селективно 15N-Ile-меченого варианта TM-ErbB3 методом ЯМР-спектроскопии выявил изменения в структуре домена при изменении молярного соотношения ДФХ/TM-ErbB3 в образце. Различные спектры ЯМР наблюдались при низких (молярное соотношение 45:1) и высоких (молярное соотношение 135:1) концентрациях детергента (Рис. 2Б). Вероятно, наблюдаемые конформационные переходы связаны с гомодимеризацией TM-ErbB3 при низких концентрациях ДФХ.

Рис. 2. Исследование физико-химических свойств TM-ErbB3. (А) КД-спектр и анализ в ПААГ (вкладка) препарата ТМ-ErbB3, полученного из осадка РС и очищенного с помощью хроматографии на Ni2+-сефарозе в присутствии ДСН. 1 – маркер молекулярных масс, 2 – препарат ТМ-ErbB3. (Б) 2D 1H,15N-HSQC спектры 15N-Ile-TM-ErbB3, полученные при различных молярных соотношениях ДФХ/TM-ErbB3. Вероятно, при соотношении 135:1 наблюдаются в основном мономеры домена, в то время как при соотношении 45:1 домен представлен в основном гомодимерами. Красным цветом показаны сигналы 15N-Ile, имеющие внутримембранную локализацию.

Пространственная структура ТМ-ErbB3 в присутствии мицелл ДФХ, переход “мономер-димер” Для изучения пространственной структуры TM-ErbB3 в окружении мицелл ДФХ использовали укороченный вариант домена shTM-ErbB3, содержащий остатки (39-70). Для исследования эквимолярную смесь тотально 13С,15N-меченого shТМ-ErbB3 и shТМ-ErbB3, состоящего из немеченых а.о., растворяли в суспензии мицелл ДФХ, при двух молярных соотношениях ДФХ/shTM-ErbB3 (45:1 и 135:1). Общая концентрация домена в смеси составляла 2 мМ.

Исследование образца с молярным соотношением ДФХ/shTM-ErbB3 45:1 методами гетероядерной ЯМР-спектроскопии (Рис. 3) позволило установить, что пространственная структура shTM-ErbB3 в окружении мицелл ДФХ включает в себя одну -спираль, образованную а.о. с 42 по 70. В спектрах NOESY, измеренных с гетероядерной фильтрацией, наблюдались ЯЭО контакты между мечеными и немечеными молекулами домена. Полученные данные напрямую показали формирование молекулами shTM-ErbB3 спиральных симметричных гомодимеров с параллельной ориентацией субъединиц (Рис. 4).

ЯМР исследование образца с молярным соотношением ДФХ/shTM-ErbB3 135:1 не выявило наличия межмолекулярных контактов, что подтвердило переход домена в мономерную форму при увеличении концентрации детергента. Согласно полученным данным переход мономер-димер не вызывает значительных изменений в пространственной структуре домена (Рис. 3Б).

Рис. 3. Фрагменты 1H-15N-TROSY ЯМР-спектров 2 мМ смеси 13С,15N-shTM-ErbB3/shTM-ErbB3 в окружении мицелл ДФХ (40°C, рН 5.0). (А) Фрагмент спектра, измеренного в 90 мМ ДФХ. (Б) Фрагменты спектров, показывающие сигналы остатков Gly, измеренные при различных концентрациях ДФХ. Концентрация детергента подписана для каждого спектра. Сигналы мономера shTM-ErbB3 показаны красным цветом. Условия экспериментов (за исключением концентрации детергента) не изменялись.

Для большинства МБ показано, что парные взаимодействия между отдельными спиралями в ТМ-доменах осуществляются либо посредством GG4-мотива (ХхххХ, где Х один из остатков G, A, S, T, а х - любой а.о.), либо через так называемый “семичленный повтор” (ХххххххХ, где Х - один из остатков G, A или S). В аминокислотной последовательности TM-ErbB3 представлены два повторяющихся GG4 мотива (43Тххх47Тххх51G), расположенные в N-концевом участке ТМ-домена. Однако данные ЯМР-спектроскопии показали, что, взаимодействие между -спиралями TM-ErbB3 осуществляется посредством остатков 49Ixx52LVx55IFxx59Lxxx63FLxx67R с образованием левозакрученного гомодимера (Рис. 4А). Поверхность взаимодействия образована неполярными а.о. и занимает около 70% от длины ТМ-домена (Рис. 4Б). Димеризация ТМ сегментов TM-ErbB3 осуществляется за счет взаимодействий Ван-Дер-Ваальса между алифатическими и ароматическими боковыми цепями остатков 49-59, стекинга ароматических боковых цепей остатков 63F и -катионных взаимодействий между ароматическими кольцами остатков 63F и гуанидиновыми группами остатков 67R (Рис. 4В).

Наблюдаемый в TM-ErbB3 мотив димеризации отличается от мотивов, ответственных за образование гомо- и гетеродимеров у других рецепторов семейства ErbB, димеризация которых происходит по GG4-мотивам, расположенным в N- и С-концевых участках ТМдомена. Таким образом, в ходе исследования была определена пространственная структура гомодимера shTM-ErbB3 в мембраномоделирующем окружении мицелл ДФХ, и были выявлены участки спиралей, ответственные за димеризацию.

Рис. 4. Пространственная структура димера shТМ-ErbB3 (А) – Набор из 20 структур димера shTM-ErbB3, рассчитанных по данным спектроскопии ЯМР и совмещенных по атомам основной цепи а.о. 40-70 обеих субъединиц. Основные цепи мономеров показаны черным цветом, боковые цепи – зеленым и пурпурным. (Б) – Доля площади поверхности а.о., участвующая в образовании интерфейса димеризации. (В) – Структура гомодимера shТМErbB3 в ленточном представлении. Показаны боковые цепи остатков, находящихся на интерфейсе димеризации и участвующих в образовании 49Ixx52LVx55IFxx59Lxxx63FLxx67R мотива.

Синтез ТМ-ErbB3 в присутствии мицелл детергентов Для исследования возможности получения полноразмерного варианта ТМ-домена ErbB3 в растворимом и структурированном виде в настоящей работе был опробован подход, основанный на добавлении различных мембраномоделирующих сред (мицелл детергентов, бицелл, липосом и ЛБН) непосредственно в реакционную смесь. В качестве тестируемых детергентов были использованы как неионные детергенты (Бридж-35, БриджБридж-78, Бридж-98, ДДМ, Тритон Х-100, Твин 20), которые, согласно литературным данным, широко применяются для поддержания молекул МБ в растворимой форме, так и цвиттерионный детергент ДФХ, часто используемый в структурных исследованиях МБ методами ЯМР-спектроскопии. В реакционную и питающую смеси добавлялись различные концентрации детергентов в диапазоне от 0.2 до 2%.

Рис. 5. (А) - Анализ эффективности синтеза ТМ-ErbB3 в присутствии мицелл детергентов. К. - контрольный образец, синтезированный без добавления мембранных миметиков в РС. Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более 15%. Содержание TM-ErbB3 в образцах оценивали с помощью вестерн-блоттинга по сравнению с очищенным препаратом TM-ErbB3/Бридж-58, концентрация белка в котором была определена спектрофотометрически.

(Б) – Анализ в ПААГ препарата TM-ErbB3, синтезированного и очищенного в присутствии Бридж-58. 1- маркер молекулярных весов; 2- и 3- TM-ErbB3 до и после обработки ДТСП, соответственно. Полосы, относящиеся к мономеру и димеру TM-ErbB3, отмечены одной и двумя звездочками. (В) – 2D 1H,15N-HSQC-спектр 15N-Ile-TM-ErbB3, синтезированного и очищенного в присутствии Бридж-58. (Г) - 2D 1H,15N-HSQСспектр 15N-Ile-TM-ErbB3, синтезированного в присутствии Бридж-58 и очищенного в присутствии ДФХ. В препаратах для ЯМР-анализа концентрация TM-ErbB3 составляла 0.2 мM, а соотношение TM-ErbB3/детергент составляло ~ 1:50.

Анализ растворимой и нерастворимой фракций РС с помощью вестерн-блоттинга показал, что добавление неионных детергентов, за исключением Твин 20, значительно повышает содержание ТМ-домена в растворимой форме (~80-95% от общего количества синтезированного белка, Рис. 5А). Однако в случае детергента Тритон Х-100 наблюдалось снижение общего выхода домена по сравнению с другими неионными детергентами.

Наибольшие выходы белка в растворимой форме наблюдались при концентрации неионных детергентов равной 1%. Цвиттерионный детергент ДФХ практически полностью подавлял продукцию ТМ-ErbB3, выход белка в этом случае составлял не более 0.1-0.15 мг/мл РС (Рис. 5А). Наибольший выход домена (~1.9 мг/мл) наблюдался в присутствии мицелл Бридж-58. Методом КД-спектроскопии было показано, что ТМ-ErbB3 в окружении мицелл Бридж-58 обладает вторичной структурой, идентичной структуре домена, солюбилизированного из осадка РС в мицеллах ДФХ и ДСН (Рис. 2А).

Анализ методом ЯМР-спектроскопии препарата N-Ile-ТМ-ErbB3, 2+ синтезированного и очищенного на Ni -смоле в присутствии Бридж-58, показал, что пространственная структура домена в этой среде отличается от структуры, наблюдаемой в мицеллах ДФХ (Рис. 5В). С другой стороны, электрофоретический анализ препарата домена в мицеллах Бридж-58, обработанного кросс-сшивающим реагентом (дитиобис(сукцинимидил пропионатом), ДТСП) активным по отношению к свободным аминогруппам, выявил способность пептида к димеризации (Рис. 5Б). Кроме того, после замены детергента Бридж-58 на ДФХ с помощью хелат-афинной хроматографии был получен 1H-15N-HSQC спектр 15N-Ile-ТМ-ErbB3, идентичный спектру в мицеллах ДФХ (Рис. 5Г). Видимо, домен, синтезированный в присутствии мицелл Бридж-58, обладает “квазинативной” структурой.

Синтез ТМ-ErbB3 в присутствии бицелл и липосом На следующем этапе исследования в качестве мембраномоделирующей среды для бесклеточного синтеза были опробованы бицеллы, состоящие из смеси липида димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) и детергента дигексаноилфосфатидилхолина (ДГФХ) в молярном соотношении 1:2. Анализ растворимой и нерастворимой фракций РС с помощью вестерн-блоттинга обнаружил, что добавление бицелл способствует синтезу домена в растворимой форме, при этом оптимальная концентрация липида составляла 14,5 мМ (Рис. 6А). Однако, только 30% от общего количества синтезированного TM-ErbB3 Рис. 6. (А) - Анализ эффективности синтеза ТМ-ErbB3 в присутствии бицелл ДМФХ/ДГФХ (1:2) и липосом. К. - контрольный образец, синтезированный без добавления мембранных миметиков в РС. Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более 15%. Содержание TM-ErbB3 в образцах оценивали с помощью вестерн-блоттинга (см. подпись к Рис. 5). (Б)- 2D 1H,15N-HSQСспектр 15N-Ile-TM-ErbB3 в мицеллах ДФХ. (В) – 2D 1H,15N-TROSY-спектр РС, содержащей 15NIle-TM-ErbB3, синтезированный в присутствии бицелл ДМФХ/ДГФХ (1:2). В препаратах для ЯМР-анализа концентрация TM-ErbB3 составляла ~ 0.2 мM.

(~0.6 мг/мл) находилось в растворимой фракции РС, что практически в 3 раза ниже, чем при использовании мицелл Бридж-58. В отличие от мицелл, в присутствии бицелл ДМФХ/ДГФХ ТМ-ErbB3 приобретал структуру, близкую к структуре домена в мицеллах ДФХ, что было продемонстрировано с помощью анализа препарата 15N-Ile-TM-ErbB3 методами ЯМР-спектроскопии (Рис. 6В).

Также был опробован синтез ТМ-ErbB3 в присутствии моноламеллярных липосом ДМФХ. Оказалось, что добавление липосом в РС также способствовало синтезу ТМ-ErbB3 в растворимой форме. В этом случае содержание домена в растворимой фракции РС составило около 30% от общего количества синтезированного ТМ-ErbB3, что сопоставимо с результатами, полученными в присутствии бицелл (Рис. 6А).

Синтез ТМ-ErbB3 в присутствии липид-белковых нанодисков Липид-белковые нанодиски (ЛБН) или реконструированные незрелые частицы липопротеинов высокой плотности являются альтернативной мембраномоделирующей средой. Каждый липид-белковый нанодиск представляет собой фрагмент бислойной мембраны, сформированный из ~150-200 молекул фосфолипидов, гидрофобная часть которого экранирована от растворителя двумя молекулами аполипопротеина (в работе использовали фрагмент аполипопротеина А1 человека (42-243), так называемый MSP).

Для синтеза ТМ-ErbB3 в растворимой форме были использованы ЛБН различного липидного состава, содержащие как анионные, так и цвиттерионные липидные молекулы с насыщенными и ненасыщенными жирнокислотными цепями. Анализ растворимой и нерастворимой фракций РС с помощью вестерн-блоттинга показал, что добавление ЛБН независимо от липидного состава значительно повышает содержание ТМ-домена в растворимой форме (~80-90% от общего количества синтезированного белка, Рис. 7А).

Оптимальная концентрация ЛБН в РС составляла 0.05 мМ, повышение концентрации нанодисков до 0.2 мМ лишь незначительно увеличивало количество домена, синтезированного в растворимой форме.

Комплексы ТМ-ErbB3/ЛБН были выделены из растворимой фракции РС и очищены 2+ на Ni -сефарозе, используя His6-таг, эксклюзивно представленный на молекуле домена.

Электрофоретический анализ (Рис. 7В, 3 дорожка) выявил совместную очистку молекул ТМ-ErbB3 и MSP, что подтвердило формирование комплекса домена с ЛБН.

Последующий анализ очищенных препаратов ТМ-ErbB3/ЛБН методом гель-фильтрации показал, что только при использовании ЛБН, содержащих насыщенные липиды (ДМФХ и ДМФГ), размер комплексов составлял ~ 10 нм, что соответствует характерному размеру нанодисков. В случае же использования ЛБН, содержащих ненасыщенные липиды ПОФХ и смесь ПОФХ/ДОФГ, при котрансляционном встраивании домена наблюдалось разрушение нанодисков, сопровождающееся формированием комплексов размером ~ 15нм и высвобождением молекул MSP (пик на хроматограмме, соответствующий размеру ~ 6 нм) (Рис. 7Б). Возможно, при встраивании пептида в ЛБН, содержащие ненасыщенные липиды, происходило слияние нанодисков (процесс, описанный ранее в литературе для липопротеиновых частиц высокой плотности).

Анализ структуры ТМ-ErbB3 в комплексе с ЛБН, содержащими ДМФХ и ДМФГ, был проведен методами ЯМР-спектроскопии с использованием селективно 15N-Ileмеченого варианта TM-ErbB3. Полученные 2D 1H,15N-TROSY спектры комплексов ТМErbB3/ЛБН (Рис. 8Б,В) были сходны со спектрами домена в присутствии мицелл ДФХ (Рис. 8А). Чтобы подтвердить предполагаемое отнесение сигналов 15N-Ile в присутствии ЛБН/ДМФХ, был синтезирован селективно 15N-Ile-меченый укороченный вариант домена shTM-ErbB3, содержащий только 2 остатка Ile. 2D 1H,15N-TROSY спектр этого препарата (Рис. 8В, красные контуры) подтвердил предполагаемое отнесение сигналов остатков Ile.

Рис. 7. (А) - Анализ эффективности синтеза ТМ-ErbB3 в присутствии ЛБН. К. - контрольный образец, синтезированный без добавления мембранных миметиков в РС.

Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более 15%. Содержание TM-ErbB3 в образцах оценивали с помощью вестерн-блоттинга (см. подпись к Рис. 5). (Б)- Гель-фильтрационный анализ (Superdex-200, Tricorn 5/200, GE Healthcare) препаратов ЛБН различного липидного состава: до (“пустые”) и после котрансляционного встраивания TM-ErbB3. ДМФГ-димиристоилфосфатидилглицерин, ПОФХ-пальмитоилолеоилфосфатидилхолин, ПОФХ/ДОФГ смесь ПОФХ и диолеоилфосфатидилглицерина (3:1). Звездочкой отмечен пик, соответствующий свободным молекулам MSP. (В) – Анализ в ПААГ препаратов “пустых” ЛБН и комплексов TM-ErbB3/ЛБН после очистки на Ni2+-сефарозе. 1- и 2- препарат ЛБН/ДМФХ до и после обработки ДТСП; 3и 4- препарат TM-ErbB3/ЛБН/ДМФХ до и после обработки ДТСП, 5- маркер молекулярных весов. Полосы, относящиеся к мономеру, димеру и тримеру TM-ErbB3, отмечены одной, двумя и тремя звездочками, соответственно.

Анализ олигомерного состояния домена, встроенного в ЛБН/ДМФХ, с использованием кросс-сшивающего реагента ДТСП выявил присутствие как мономеров, димеров, так и тримеров TM-ErbB3 (Рис. 7В). Кроме того, на электрофорограммах наблюдались полосы, соответствующие мономеру и димеру MSP, а также комплексам ТMErbB3/MSP (Рис. 7В). Видимо, синтезированный TM-ErbB3 котрансляционно встраивается в нанодиски в виде мономера и впоследствии формирует гомодимеры. При этом встроенные молекулы домена не могут самопроизвольно покидать нанодиск и перемещаться между нанодисками. Статистическое распределение TM-ErbB3 между нанодисками в процессе синтеза ведет к формированию комплексов, содержащих одну, две, три и т.д. молекулы домена. Вследствие этого при реакции с ДТСП в препарате фиксируются не только специфически образованные гомодимеры, но и различные неспецифически образованные комплексы.

Таким образом, было показано, что ЛБН, содержащие насыщенные липиды, являются оптимальной мембраномоделирующей средой для высокоэффективного синтеза ТМ-ErbB3 в растворимой и структурированной форме. Кроме того, показана возможность проведения прямых структурных исследований ТМ-ErbB3, котрансляционно встроенного в бицеллы и ЛБН, методами ЯМР-спектроскопии.

Рис. 8. 2D 1H,15N-ЯМР спектры различных препаратов TM-ErbB3. (A) - HSQС-спектр 15N-IleTM-ErbB3 в мицеллах ДФХ. (Б) - TROSY-спектр 15N-Ile-TM-ErbB3, синтезированного в присутствии ЛБН/ДМФГ. (В) - Наложение TROSY спектров 15N-Ile-TM-ErbB3 (черные контуры) и 15N-Ile-shTM-ErbB3 (красные контуры), синтезированных в присутствии ЛБН/ДМФХ. Концентрация TM-ErbB3 0.1 мM.

Бесклеточная продукция мускаринового ацетилхолинового рецептора М1 типа Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы человека (мАХР) относятся к рецепторам, сопряженным с G-белками (GPCR) первого типа. Они являются интегральными МБ, и имеют в своем составе 7 ТМ-спиралей (Рис. 9). Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы выступают в качестве основных рецепторов ацетилхолина в парасимпатической нервной системе, но они также широко распространены и в центральной нервной системе. Лиганды, действующие на мАХР, в настоящее время широко используются в медицинских целях, например, для расширения зрачков в офтальмологии (атропин), для предотвращения морской болезни (скополамин), для лечения астмы (ипратропиум бромид) и болезни Паркинсона (тропацин). Эти рецепторы также являются перспективными мишенями для создания новых биомедицинских препаратов, нацеленных на лечение болезни Альцгеймера, шизофрении и наркомании. В ЦНС человека (неокортекс, гиппокамп и полосатое тело головного мозга) самым распространенным рецептором мАХР является рецептор М1 типа (М1-мАХР), который влияет на активность фосфолипазы С и опосредует ацетилхолин-индуцированный оборот инозитол-3-фосфата. Эти процессы влияют на мыслительную деятельность, сознание, обучение и память. Разработка эффективных систем продукции М1-мАХР в функционально активной форме необходима для решения задач, связанных со структурнофункциональными исследованиями этого рецептора, а также для создания новых лекарственных препаратов.

Дизайн гена М1-мАХР В работе использовали модифицированный вариант M1-мАХР, в котором были укорочены внеклеточная N-концевая последовательность (удалены а.о. 1-18), последовательность, кодирующая третью внутриклеточную петлю между 5 и 6 ТМ спиралями (удалены а.о. 225-353) и внутриклеточная С-концевая последовательность (удалены а.о. 427-460), которые согласно литературным данным не участвуют в связывании лигандов. С целью уменьшения склонности молекул М1-мАХР к агрегации при образовании “ненативных” межмолекулярных дисульфидных связей методами сайтнаправленного мутагенеза была осуществлена замена неспаренных остатков Cys (69, 205, 417, 421, 435, 460), имеющих трансмембранную и цитоплазматическую локализацию, на остатки Ser. Были сохранены внемембранные остатки Cys98 и Cys178, Cys391 и Cys394, образующие дисульфидные связи (Рис. 9). Кроме того, в молекулу M1-мАХР была введена С-концевая гексагистидиновая последовательность.

Ген укороченного варианта М1-мАХР (М1-мАХР) синтезировали методом ПЦР, используя праймеры, последовательность которых была рассчитана с помощью программы DNA Works с учетом частоты встречаемости кодонов в E. coli. Полученный ген клонировали в вектор pET22b(+) по сайтам рестрикции NdeI и HindIII. В результате был получен вектор pET22b(+)/M1-мАХР.

Рис. 9. Дизайн мутантного гена M1-мАХР. 1- Укороченная внеклеточная N-концевая область.

2- Замена остатков Cys (69, 205, 417, 421, 435, 460) на Ser. 3- Укороченная внутриклеточная петля между 5 и 6 ТМ-спиралями рецептора. 4- Укороченная внутриклеточная С-концевая область. Показаны дисульфидные связи между Cys98/Cys178 и Cys391/Cys394.

Бесклеточный синтез M1-мАХР с различными N-концевыми партнерами Прямая экспрессия укороченного гена M1-мАХР в ББС на основе экстракта S30 из E. coli была малоэффективна. Выход целевого белка после очистки не превышал 0.05 мг с 1 мл РС. Мы предположили, что низкий выход М1-мАХР связан с малой эффективностью процесса инициации трансляции, вызванной образованием вторичной структуры фрагментом мРНК в области начала целевого гена. Для подтверждения этого предположения в гене М1-мАХР была проведена замена 5’-концевой последовательности, кодирующей внеклеточные N-концевые а.о., предшествующие первой ТМ спирали (остатки 19-23), на нуклеотидную последовательность, кодирующую 6 первых а.о.

бактериородопсина ESR (ESR-таг, Бактериородопсин ESR из MEEVNL).

грамположительной бактерии Exiguobacterium sibiricum является структурным гомологом GPCR и также содержит 7 ТМ спиралей. Для гена ESR ранее наблюдалась высокоэффективная прямая экспрессия в ББС (выход целевого белка до 1.6 мг/мл РС).

Введенная замена позволила увеличить эффективность продукции М1-мАХР до ~ 0.5 мг/мл. Полученные результаты подтвердили важную роль 5’-концевой последовательности гена для эффективной экспрессии в бесклеточной системе.

Для дальнейшей оптимизации бесклеточной продукции М1-мАХР были опробованы четыре N-концевых партнера.

Два из них, T7-таг (фрагмент лидерной последовательности белка 10 бактериофага T7, 11 а.о., MASMTGGQQMG) и белок TRX (11.8 кДа), ранее применяли для бесклеточной продукции белков семейства GPCR, в то время как белок Mistic (12.8 кДа) использовали для продукции GPCR в клетках E. coli. Кроме того, была опробована последовательность S-таг, кодирующая N-концевой фрагмент рибонуклеазы А (16 а.о., MKETAAAKFERQHMDS), который применяется для детекции и очистки рекомбинантных белковых препаратов с помощью аффинной хроматографии и который ранее не применяли в качестве N-концевого партнера для рекомбинантной продукции МБ.

В отличие от метода, использованного при дизайне гибридного гена с 5’-концевой последовательностью, кодирующей ESR-таг, нуклеотидные последовательности, кодирующие T7-таг, TRX, Mistic и S-таг, были добавлены в единой рамке считывания на 5’-конец гена М1-мАХР. Плазмида, содержащая ген Mistic, была любезно предоставлена с.н.с. Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Л.Е.Петровской.

Во всех случаях использование N-концевых партнеров вело к увеличению выхода М1-мАХР (Рис. 10А). Наиболее эффективными партнерами являлись S-таг (~ 3.6 мг/мл РС) и Mistic (3.0 мг/мл РС). Очищенные препараты М1-мАХР, солюбилизированные в детергенте ДСН (1%), были проанализированы с помощью электрофореза в ПААГ (Рис.

10Б). На электрофореограммах наблюдались отдельные полосы, соответствующие мономерам, димерам рецептора и агрегатам более высокого порядка. Наблюдаемая степень агрегации белковых препаратов зависела от последовательности использованного N-концевого партнера, а также, возможно, от концентрации белкового препарата в образце. Так, например, наибольшее количество высокомолекулярных агрегатов наблюдалось в образцах S-таг-M1-мАХР и Mistic-мАХР, синтез которых проходил с наибольшей эффективностью. Методом КД-спектроскопии была проанализирована вторичная структура гибрида ESR-таг-M1-мАХР, который в растворе ДСН демонстрировал меньшую степень агрегации (Рис. 10В). Анализ полученных данных выявил преобладание -спиральной структуры (-спираль 65 %, -лист 4 %, -поворот 9 %, неупорядоченная структура 22 %), что указывает на наличие частично сформированной вторичной структуры рецептора в окружении детергента ДСН. Следует отметить, что содержание -спиральных структурных элементов в молекуле укороченного рецептора M1-мАХР, рассчитанное по аналогии с известными кристаллическими структурами M2 и M3-мАХР, должно составлять ~ 72%. Дальнейшая работа была продолжена с ESR-таг-М1мАХР.

Рис. 10. (А). Анализ эффективности бесклеточного синтеза М1-мАХР в зависимости от используемого N-концевого партнера. Уровень синтеза М1-мАХР в отсутствие дополнительных N-концевых последовательностей обозначен «П.Э.» (прямая экспрессия).

Уровень синтеза гибридных белков показан «незаполненными» столбцами, количество синтезированного М1-мАХР (столбцы серого цвета) показано за вычетом доли, занимаемой Nконцевыми партнерами. Каждое приведенное значение получено на основе усреднения результатов 3 независимых экспериментов. (Б) – Электрофоретический анализ эффективности синтеза вариантов М1-мАХР с различными N-концевыми партнерами. (В) – КД-спектр ESR-таг-M1-мАХР в присутствии мицелл ДСН. Белки синтезировали в виде осадка РС без добавления мембраномоделирующих сред. Осадки растворяли в детергенте ДСН (1%) в присутствии 8М мочевины. Количественное содержание белковых препаратов оценивали спектрофотометрически по поглощению на длине волны 280 нм после очистки с помощью Ni2+афинной хроматографии в присутствии 1% ДСН.

Синтез ESR-таг-M1-мАХР в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов Для синтеза в растворимой форме ESR-таг-М1-мАХР в реакционную и питающую смеси добавляли мицеллы неионных детергентов типа Бридж, Тритон Х-100 и Твин 20 в концентрации 1%. Электрофоретический анализ продуктов синтеза показал, что при использовании Бридж-58 более 90% от общего количества синтезированного белка находилось в растворимой фракции РС (0.36 мг/мл). При этом добавление Бридж-35, -78 и

-98 приводило к снижению уровня продукции целевого белка в 2.5 раза (до 0.15 мг/мл).

Детергенты Тритон Х-100 и Твин 20 также подавляли синтез белка, при этом их добавление в РС не способствовало продукции ESR-таг-М1-мАХР в растворимой форме (Рис. 11А).

Электрофоретический анализ ESR-таг-М1-мАХР, синтезированного в присутствии Бридж-58 и очищенного с помощью хелат-аффинной хроматографии на Ni2+-сефарозе, показал, что во фракции, элюированной 100 мМ имидазолом, наравне с мономерами ESRтаг-М1-мАХР присутствуют высокомолекулярные агрегаты (Рис. 11Б, дорожка 7).

Видимо, использование мицелл детергента Бридж-58 в качестве мембраномоделирующей среды хотя и способствует синтезу белка в растворимой форме, однако не обеспечивает условий для стабилизации мономерного состояния белка в растворе. Более того, эксперименты по взаимодействию с селективным агонистом рецептора телензипином, проведенные методами ЯМР-спектроскопии, показали отсутствие связывания ESR-таг-М1мАХР с лигандом, что свидетельствует об отсутствии у рекомбинантного рецептора нативной структуры в окружении мицелл Бридж-58.

Рис. 11. (А) – Анализ эффективности синтеза ESR-таг-М1-мАХР в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов. Приведены усредненные значения, полученные из трех независимых экспериментов, относительная ошибка составляла не более 15%. Содержание ESR-таг-М1-мАХР в образцах оценивали по сравнению с препаратом рецептора в Бридж-58, очищенным на Ni2+-сефарозе, концентрация белка в котором была определена спектрофотометрически. (Б) – Электрофоретический анализ препаратов ESR-таг-М1-мАХР после очистки. 1– маркер молекулярных весов, 2- препарат, солюбилизированный из осадка РС и очищенный в присутствии ДФХ, 3-6- препарат, солюбилизированный из осадка РС и очищенный в присутствии ДФХ и смеси восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона, взятых в разных молярных соотношениях (1:1, 2:1, 4:1 и 10:1 – дорожки 3, 4, 5, 6, соответственно), 7- препарат, синтезированный и очищенный в присутствии мицелл Бридж-58, 8- очищенный препарат, синтезированный в присутствии ЛБН/ДМФХ.

Синтез ESR-таг-М1-мАХР в присутствии липид-белковых нанодисков Для синтеза ESR-таг-М1-мАХР в растворимой форме в качестве мембранного миметика также были опробованы ЛБН. Из опыта работы с ТМ-ErbB3 было известно, что только ЛБН, содержащие насыщенные липиды, не разрушаются при котрансляционном встраивании белка. Для синтеза ESR-таг-М1-мАХР ЛБН, содержащие насыщенные липиды ДМФХ и ДМФГ, добавляли в РС в концентрации 0.1 мМ. После синтеза растворимая фракция РС была очищена с помощью хелат-аффинной хроматографии.

Электрофоретический анализ фракций, элюированных 300 мМ имидазолом, показал ассоциацию ESR-таг-М1-мАХР с ЛБН (Рис. 11Б, дорожка 8). Гель-фильтрационный анализ препаратов ESR-таг-М1-мАХР/ЛБН/ДМФХ и ESR-таг-М1-мАХР/ЛБН/ДМФГ выявил, что только в случае использования ЛБН/ДМФХ в препарате сохраняется некоторое количество нанодисков с характерным диаметром ~ 10 нм. При этом в обоих случаях наблюдалось слияние нанодисков с образованием частиц размером более 20 нм (Рис. 12А).

Активность препарата ESR-таг-M1-мАХР/ЛБН/ДМФХ исследовали методом ЯМРспектроскопии в экспериментах по взаимодействию с телензепином. Химическая формула телензепина и одномерный 1H ЯМР-спектр лиганда приведены на рисунке 13А. В полученном ЯМР-спектре наблюдалось два набора сигналов лиганда, что указывало на наличие в растворе смеси двух изомеров телензепина, отличающихся конфигурацией (cistrans-) связи N-C(O), которая имеет частично двойной характер. Для исследования активности полученного препарата рецептора к раствору телензепина (10 мкМ) постепенно добавляли раствор комплекса ESR-таг-M1-мАХР/ЛБН/ДМФХ. В одномерных спектрах ЯМР наблюдали сигнал от метильной группы телензепина (2.6 м.д.), который не перекрывался с сигналами от CH2- групп липидов из ЛБН (Рис. 13Б). При увеличении концентрации комплекса ESR-таг-M1-мАХР/ЛБН/ДМФХ сигнал метильной группы телензепина постепенно ослаблялся и сдвигался в сильное поле, что свидетельствовало о наличии взаимодействия между лигандом и рецептором. В качестве контроля было проведено титрование раствора телензепина “пустыми” ЛБН/ДМФХ, не содержащими рекомбинантный рецептор. Анализ полученных спектров подтвердил, что телензепин не взаимодействует с “пустыми” ЛБН.

А Б Рис. 12. (А). Гель-фильтрационный анализ (Superdex-200, Tricorn 5/200) препаратов ЛБН различного липидного состава: до (“пустые”) и после котрансляционного встраивания ESR-тагМ1-мАХР. Звездочкой отмечен пик, соответствующий нанодискам (диаметр ~ 10 нм). (Б). Гельфильтрационный анализ препаратов ESR-таг-М1-мАХР, солюбилизированных из осадка РС и очищенных в присутствии мицелл ДФХ. 1.- препарат, очищенный без добавления глутатиона, 2препараты, очищенные в присутствии смесей восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона, взятых в разных молярных соотношениях (1:1, 2:1, 4:1, 10:12 – хроматограммы 2, 3, 4, 5, соответственно). Звездочкой отмечен пик, соответствующий мономеру ESR-таг-М1-мАХР в мицеллах ДФХ (диаметр ~ 6.3 нм).

А Б Рис. 13. (А). 1D 1H ЯМР-спектр телензепина (10мМ Трис-HCl, pH 7.0, 35°С). Показано отнесение некоторых сигналов лиганда. (Б). Фрагменты одномерных 1H-ЯМР-спектров 10 мкМ телензепина (10мМ Трис-HCl, pH 7.0, 35°С) в присутствии увеличивающейся концентрации препарата ESR-таг-M1-мАХР/ЛБН/ДМФХ (1- 0 мкМ, 2- 10 мкМ, 3- 30 мкМ, 4- 50 мкМ, 5- 70 мкМ).

Об увеличении концентрации ЛБН свидетельствовал рост интенсивности сигналов от CH2- и CH3-групп липидов.

Согласно литературным данным, связывание низкомолекулярных лигандов мускаринового рецептора М1 типа происходит в специальном “кармане”, сформированном взаимодействующими ТМ-спиралями 3, 4, 5, 6 и 7, а также второй внеклеточной петлей.

Таким образом, полученные результаты по специфическому связыванию телензепина с рецептором ESR-таг-M1-мАХР, котрансляционно встроенным в ЛБН/ДМФХ, указывают на корректно сформированную структуру лиганд-связывающего участка и возможно на правильную упаковку всего ТМ домена рецептора.

Ренатурация ESR-таг-М1-мАХР из осадка реакционной смеси Альтернативой бесклеточному синтезу МБ в растворимой форме является синтез белка в виде осадка РС без добавления каких-либо мембраномоделирующих компонентов.

В этом случае для получения функционально активного препарата МБ необходима ренатурация. Для растворения ESR-таг-М1-мАХР из осадка РС был использован «жесткий» детергент ДСН в сочетании с 8М мочевиной. Денатурированный белок наносили на Ni2+-сефарозу, после чего производили постепенную замену ДСН и мочевины на более «мягкий» детергент ДФХ. Для формирования внутримолекулярных дисульфидных связей, важных для функциональной активности рецептора, к препарату ESR-таг-М1-мАХР, солюбилизированному в ДФХ, добавляли смеси восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона в различных соотношениях.

Электрофоретический анализ полученных препаратов показал, что замена ДСН на ДФХ приводит к преимущественной стабилизации мономера рецептора в растворе (Рис. 11, дорожки 2-6). Анализ с помощью гель-фильтрации подтвердил формирование мономерной формы рецептора в мембраномоделирующем окружении мицелл ДФХ, характеризующейся компактной упаковкой с характерным диаметром ~ 6.3 нм (Рис. 12Б).

При этом размер комплекса ESR-таг-М1-мАХР/ДФХ не зависел от присутствия GSH/GSSG. Конечный выход рецептора, очищенного в мицеллах ДФХ, составил 0.21 мг/мл РС.

Для тестирования активности полученного препарата ESR-таг-М1-мАХР к нему добавляли телензепин в молярном соотношении рецептор/лиганд 1:1. В качестве контроля использовали мицеллы ДФХ, не содержащие рецептор. Эффективность взаимодействия с лигандом оценивали по количеству несвязавшегося телензепина методом ВЭЖХ.

Проведенные эксперименты не выявили специфического связывания ESR-таг-М1-мАХР, встроенного в мицеллы ДФХ, с телензепином (Рис. 14А).

Из литературных данных известно, что производные холестерина такие как 3-[(3холамидопропил)-диметиламмоний-]-1-пропансульфонат (ХАПС) и холестерил гемисукцинат (ХГС) способны стабилизировать структуру белков GPCR в растворе. ESRтаг-М1-мАХР из раствора мицелл ДФХ был реконструирован в смешанные мицеллы ДДМ/ХГС и бицеллы ХАПС/ДМФХ. Кроме того, для ренатурации рецептора были опробованы моноламеллярные липосомы диолеоилфосфатидилхолина (ДОФХ). Анализ связывания телензепина с препаратами ESR-таг-М1-мАХР, реконструированными в смешанные мицеллы ДДМ/ХГС, бицеллы ХАПС/ДМФХ и липосомы ДОФХ (Рис. 14), выявил наличие статистически достоверного связывания (уровень значимости p0,05 по Uкритерию Манна-Уитни) только в случае комплекса ESR-таг-М1-мАХР/ДДМ/ХГС (Рис.

14Б). Полученные результаты свидетельствуют о корректном формировании структуры лиганд-связывающего участка и, возможно, всего ТМ домена рецептора в этом мембраномоделирующем окружении.

Рис. 14. Анализ эффективности связывания телензепина c комплексами ESR-таг-M1мАХР/мембранный миметик. (А) – Мицеллы ДФХ. (Б) – Смешанные мицеллы ДДМ/ХГС. (В) – Липосомы ДОФХ. (Г) – Смешанные бицеллы ДМФХ/ХАПС. В каждом случае использовалась равная концентрация рецептора и телензепина (3 мкМ). Каждый столбец соответствует усредненному результату четырех независимых измерений, величина полос погрешностей соответствует одному стандартному отклонению.

ВЫВОДЫ

Разработаны эффективные бесклеточные белоксинтезирующие системы на основе 1.

экстракта S30 E. coli для продукции спиральных мембранных белков: трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ErbB3 человека (ТМ-ErbB3) и мускаринового ацетилхолинового рецептора человека (М1-мАХР). Показано, что добавление мембраномоделирующих сред в реакционную смесь позволяет синтезировать ТМ-ErbB3 и М1-мАХР в растворимой форме.

Определена пространственная структура ТМ-ErbB3 в мембраномоделирующем 2.

окружении мицелл додецилфосфохолина. Показано, что гомодимеризация TM-ErbB3 происходит по отличному от других рецепторных тирозинкиназ семейства ErbB структурному мотиву.

Проведено сравнение влияния различных мембраномоделирующих сред (мицелл 3.

детергентов, бицелл, липосом, липид-белковых нанодисков) на синтез ТМ-ErbB3 в растворимой и структурированной форме. Показано, что котрансляционное встраивание домена TM-ErbB3 в бицеллы и нанодиски, содержащие насыщенные липиды, приводит к формированию структуры ТМ-ErbB3, близкой к структуре домена в мицеллах додецилфосфохолина. Показано, что при котрансляционном встраивании TM-ErbB3 в нанодиски, содержащие ненасыщенные липиды происходит разрушение (слияние) нанодисков.

Поведено сравнение влияния различных N-концевых партнеров на эффективность 5.

бесклеточного синтеза М1-мАХР. Показано, что оптимальным партнером для продукции рецептора является N-концевой фрагмент (6 а.о.) бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum.

Показано, что при котрансляционном встраивании М1-мАХР в нанодиски, 6.

содержащие насыщенные липиды, происходит образование комплексов, способных специфически взаимодействовать с селективным агонистом телензепином, что указывает на формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка рецептора.

Разработаны протоколы солюбилизации и очистки М1-мАХР из осадка реакционной 7.

смеси, а также ренатурации рецептора в смешанных мицеллах додецилмальтозид/холестерил гемисукцинат. Показано наличие специфического взаимодействия ренатурированного рецептора с телензепином, что указывает на формирование правильной пространственной структуры лиганд-связывающего участка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1) Хабибуллина Н.Ф., Люкманова Е.Н., Копеина Г.С., Шенкарев З.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Разработка и оптимизация сопряженной бесклеточной системы синтеза трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ErbB3 // Биоорганическая химия. 2010. Т. 36. № 5. С. 654-660.

2) Mineev K.S., Khabibullina N.F., Lyukmanova E.N., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. Spatial structure and dimer-monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrain domain in DPC micelles // Biochim Biophys Acta. 2011. V. 1808. P. 2081-2088.

3) Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Khabibullina N.F., Kopeina G.S., Paramonov A.S., Mineev K.S., Tikhonov R.V., Shingarova L.N., Petrovskaya L.E., Dolgikh D.A., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P. Lipid-protein nanodiscs for cell-free production of integral membrane proteins in a soluble and folded state: comparison with detergent micelles, bicelles and liposomes // Biochim Biophys Acta. 2012. V. 1818. P. 349–358.

Патентная заявка:

1) Люкманова Е.Н., Хабибуллина Н.Ф., Шулепко М.А., Кульбацкий Д.С., Шенкарев З.О., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Способ получения рекомбинантных белков в бесклеточных системах синтеза. Патентная заявка РФ № 2012133162(052591) от 02.08.2012.

Тезисы докладов:

1) Хабибуллина Н.Ф., Люкманова Е.Н., Минеев К.С., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Продукция трансмембранных доменов тирозинкиназ ErbB3 и ErbB4(V18E) в бесклеточной системе // XXII Зимняя международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии”.

Москва (Россия). 2009. С. 122.

2) Lyukmanova E.N., Kopeina G.S., Khabibullina N.F., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Mineev K.S., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Cell-free production of membrane proteins for NMR studies // Euromar and 17th ISMAR Conference. Florence (Italy).

2010. P. 211.

3) Khabibullina N., Lyukmanova E., Mineev K., Arseniev A., Dolgikh D., Kirpichnikov M.

Cell-free production of the transmembrane domain of the human receptor tyrosine kinase ErbB // 35th FEBS Congress “Molecules of life”. Gothenburg (Sweden). 2010. P. 286.

4) Lyukmanova E.N., Khabibullina N.F., Shingarova L.N., Petrovskaya L.E., Shenkarev Z.O., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Large-scale cell-free production of

membrane proteins // 2nd Russian-Hellenic Symposium “Biomaterials and bionanomaterials:

recent advances and safety – toxicology issues. Heraklion, Crete (Greece). 2011. P.46.

5) Люкманова Е.Н., Хабибуллина Н.Ф., Шенкарев З.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Бесклеточная продукция мембранных белков в системе транскрипции-трансляции // XIX Международная конференция и дискуссионнй научный клуб “Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. Достижения современной биоорганической химии и перспективы их применения”. Ялта-Гурзуф, Крым (Украина). 2011. C. 42.

6) Khabibullina N.F., Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Mineev K.S., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Different approaches for effective cell-free synthesis of integral membrane proteins with different topologies in a soluble form // 36th FEBS Congress “Biochemistry for tomorrow’s medicine”. Torino (Italy). 2011. P. 112.

7) Mineev K.S., Khabibullina N.F., Lyukmanova E.N., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. Spatial structure and detergent-dependent dimer-monomer equilibrium of ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles // 36th FEBS Congress “Biochemistry for tomorrow’s medicine”. Torino (Italy). 2011. P. 118.

8) Хабибуллина Н.Ф., Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О. Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков: мицеллы детергентов, бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии ”Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова”.

Москва-Пущино (Россия). 2011. С. 73.

9) Минеев К.С., Бочаров Э.В., Люкманова Е.Н., Хабибуллина Н.Ф., Гончарук М.В., Арсеньев А.С. Топология и энергетика взаимодействий между трансмембранными спиралями рецепторов ErbB // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии ”Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова”. МоскваПущино (Россия). 2011. С. 47.

10) Кульбацкий Д.С., Хабибуллина Н.Ф., Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Люкманова Е.Н., Долгих Д.А. Рекомбинантная продукция мускаринового ацетилхолинового рецептора человека, белка семейства GPCR, в функционально активной форме // XXIV Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии”. Москва (Россия). 2012. С. 38.

11) Хабибуллина Н.Ф., Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Кульбацкий Д.С., Шенкарев

З.О., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Бесклеточная продукция мембранных белков:

новые возможности для медицины будущего // Научная конференция “Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты”. Москва (Россия). 2012 г. C. 15.



Похожие работы:

«МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ И ЭКОЛОГИИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ДОКЛАД О СОСТОЯНИИ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН В 2014 ГОДУ УФА 2015 "ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ДОКЛАД О СОСТОЯНИИ ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН В 2014 ГОДУ" ПРЕДИСЛОВИЕ Гос...»

«ВЛАСЕНКО Людмила Петровна ГОМОЛОГИ ГИСТОНА CENH3 У ВИДОВ СЕМЕЙСТВА BRASSICACEAE BURNETT И ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ ПАРТНЁРЫ У ARABIDOPSIS THALIANA L. Специальность: 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2012 Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-иссл...»

«Реферат Разумовская русский язык 6 класс упражнение 470 Разумовская русский язык 6 класс упражнение 470 Разумовская русский язык 6 класс упражнение 470: Экология План реферата 1. Вступление 2. Химическое...»

«1 Содержание 1 Введение.. 3 2 Темы, выносимые на самостоятельное изучение. 5 3 Тема 1.. 5 4 Тема 2.. 8 5 Тема 3.. 10 6 Тема 4.. 12 7 Тема 5.. 14 8 Тема 6.. 15 9 Тема 7.. 19 10 Тема 8.. 21 11 Тема 9.. 23 12 Тема 10.. 25 13 Тема 11.....»

«УДК 577.322и функции тропомодулинабиологической химии, т. 42, 2002, с. 217—234 Структура 217 Успехи СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ТРОПОМОДУЛИНА — БЕЛКА, РЕГУЛИРУЮЩЕГО ДЛИНУ АКТИНОВЫХ ФИЛАМЕНТОВ А. С. КОСТЮКОВА 8 2002 г. Институт белка РАН, Пущино, Московс...»

«КОМПЬЮТЕРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И МОДЕЛИРОВАНИЕ 2009 Т. 1 № 2 С. 199–207 АНАЛИЗ И МОДЕЛИРОВАНИЕ СЛОЖНЫХ ЖИВЫХ СИСТЕМ Градуировка индексов разнообразия и поиск экологически допустимых уровней абиотических факторов (на примере водных объектов р. Дон) Е. А. Забурдаева1,a Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, биологич...»

«Информационный отчет по блоку "Институциональные аспекты" о проделанной работе за июнь 2010 г.1. Союз водопользователей канала и Водный Комитет канала 03.06.10. Узбекистан, Кувинский район, с.Мингчинор. Проведено очередное заседание Правления СВЮФМК, в котором приняли участие все 5 членов Правления и приглашенные – 3 чел. Н...»

«А.Б. Мосягин ЗАДАЧИ УПРАВЛЕНИЕ РИСКОМ ПРИ ОБЕСПЕЧЕНИИ БЕЗОПАСНОСТИ ОБЪЕКТОВ РЕГИОНА Сформулированы задачи управления риском при обеспечении безопасности объектов региона, и предложены способы их решения на основе логи...»

«Распределение, численность и экология отдельных групп и видов птиц РЕДКИЕ ВИДЫ ВОДОПЛАВАЮЩИХ ПТИЦ МОСКВЫ: ДИНАМИКА С 1985 ПО 2014 гг. К.В. Авилова Кафедра зоологии позвоночных, биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова e-mail: wildlife@inbox.ru Основные результаты осво...»

«Учреждение образования "БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Кафедра промышленной экологии ОБЩАЯ ЭКОЛОГИЯ Программа, методические указания и контрольные задания для студентов специальности 1-57 01...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Горно-Алтайский государственный университет" МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ для обучающихся по освоению дисциплины: Биогеография уровень основной образовательной программы: бакалавриат рекомендуется для направлен...»

«Образование и наука. 2003. № 3 (21) ОБЩИЕ ПРОБЛЕМЫ ОБРАЗОВАНИЯ УДК 37.033 ББК Ч421.235 НЕПРЕРЫВНОЕ ЭКОЛОГО-ЭКОНОМИЧЕСКОЕ ОБРАЗОВАНИЕ УЧАЩИХСЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ШКОЛ А. Ф. Аменд, А. А. Саламатов Совре...»

«Экология УДК 557.4 Н.К. Кобетаева, С.Э. Бадмаева МОНИТОРИНГ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД НА ПРИМЕРЕ РЕКИ ИШИМ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН В статье рассмотрены основные источники антропогенного влияния на реку Ишим на территории Казахстана, а также изучены основные гидробиологические показатели, на основании...»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.