WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«КОНСТРУИРОВАНИЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ПЯТИВАЛЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ ...»

На правах рукописи

ДОЛГОВ Дмитрий Львович

КОНСТРУИРОВАНИЕ АССОЦИИРОВАННОЙ ПЯТИВАЛЕНТНОЙ

ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ

ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Владимир – 2008

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

(г. Владимир) доктор ветеринарных наук

Научный руководитель – Борисов Владимир Владимирович доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты – Шумилов Константин Васильевич, ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ», г. Москва);

доктор биологических наук, профессор Фомина Наталья Васильевна, Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им К.И. Скрябина (ФГОУ «МГАВМиБ», г.

Москва) ГНУ «Всероссийский научноВедущее учреждение – исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ «ВНИИВВиМ», г. Покров)

Защита диссертации состоится 25 июня 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».



С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан 22 мая 2008 г.

Учёный секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М. Семёнова

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях современного промышленного птицеводства, характеризующегося интенсивным выращиванием птиц на ограниченных площадях, возникает опасность возникновения массовых инфекционных болезней, которые приводят к значительным экономическим потерям (В.В. Малушко, 1982; Р.Н. Коровин, 1990; П.В. Каргилл и Д.

Джонстон, 2004). При этом, большую значимость приобрели такие вирусные инфекции, как ньюкаслская болезнь (НБ), синдром снижения яйценоскостиССЯ-76), инфекционный бронхит кур (ИБК), инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) и реовирусный теносиновит (РВТ). Распространение этих заболеваний в последнее время приобрело мировой масштаб (А.В. Борисов и соавт., 1998; Л.А. Венгеренко, 2004; Э.Д. Джавадов, 2003, 2004).

Кроме общих противоэпизоотических мероприятий, краеугольным камнем борьбы с этими болезнями является специфическая профилактика, заключающаяся в массовой иммунизации поголовья птиц живыми и инактивированными вакцинами по специально разработанным схемам (В.И.

Смоленский, 1996; Э.Д. Джавадов, 2004; П.В. Каргилл, 2004; В.В. Борисов, 2007 и др.).

Однако нередко эпизоотическая обстановка, складывающаяся на птицеводческих предприятиях, диктует многократное применение птицам различных возрастных групп биопрепаратов против 8-11 инфекционных болезней. Вследствие часто повторяющихся массовых вакцинаций практически не прекращается воздействие стресс-факторов и нагрузка на иммунную систему птиц, что отрицательно сказывается на формировании надёжной защиты, а также приводит к увеличению затрат труда ветеринарных специалистов при выполнении массовых иммунизаций (В.Н.





Ирза и соавт., 2000, 2002; И.К. Рождественский и О.Ф. Хохлачев, 2003).

В последние годы зарубежная и отечественная ветеринарная практика всё чаще использует ассоциированные инактивированные эмульсионные вакцины с обратным типом эмульсии, применение которых эффективно дополняет использование живых вакцин и позволяет обеспечить у привитых кур напряженный уровень иммунного ответа на протяжении всего продуктивного периода, снизить потери молодняка птиц от инфекционных заболеваний в раннем возрасте за счёт передачи потомству высокого уровня материнских антител (E. Sakai et al., 1992; А.С. Дубовой и соавт., 1995, 1998;

Э.Д. Джавадов и соавт., 2003, 2004; Сiкачина В.I. и соавт., 2004; J.H.

Breytenbach, 2004).

Однако публикации, посвященные этой тематике, содержат в основном описание иммунобиологических свойств (иммуногенность, безвредность) ассоциированных инактивированных вакцин против вирусных болезней птиц и не касаются таких важных вопросов, возникающих при конструировании биопрепаратов, как определение параметров оптимального соотношения специфических компонентов в дисперсной фазе и среде (адъювант). В доступной литературе имеются отдельные данные, отражающие зависимость «доза-эффект» у живых вакцин против НБ, ИББ, ИБК и РВТ, а также у некоторых инактивированных моновалентных биопрепаратов (С.А. Гусев, 1999; А.В. Борисов, 2000; В.И. Шкиря, 2000; Е.С. Кочеткова, 2002; С.В.

Фролов, 2005; В.В. Борисов, 2007).

Поиски адъюванта для производства вакцин, сбалансированного по целому ряду важных требований (высокая эффективность, физическая стабильность, низкие реологические показатели, безвредность, универсальность, технологическая совместимость, доступность, низкая стоимость), остаются актуальными и по сей день и по ряду причин осуществляются на эмпирическом уровне. Многими исследователями, как экспериментально, так и на практике, доказаны преимущества использования масляных адъювантов с обратным типом эмульсии в производстве инактивированных вакцин для птиц (P.D. McKercher, 1986; В.В, Борисов, 1997; H. Stone, 1997, 1998, 1999; С.А. Гусев, 1999; Э.Д. Джавадов, 2000; В.Н.

Ирза, 2000).

B.A. Bokhout et al. (1986) и В.А. Сергеев (1998) сообщили, что размер частиц дисперсной фазы эмульсии и её гомогенность напрямую влияют на иммунологические свойства инактивированных эмульсионных вакцин, поскольку биопрепараты с размером частиц эмульсии менее 1 мкм более доступны для захвата макрофагами и последующей презентации клеткам иммунной системы. Однако эти экспериментальные работы выполнялись с использованием сложных и нестандартных методик определения размера частиц дисперсной фазы, что ограничивает их широкое применение.

Открытие метода лазерной дифракционной гранулометрии позволяет значительно упростить процедуры контроля качества физических свойств эмульсионных биопрепаратов и внедрить их в производственный процесс (D.T. O’Hagan et al., 1991; J. Vaija et al., 1995).

Таким образом, определение таких наиболее важных в технологическом аспекте величин и показателей, как минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объёме до этапа инактивации, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда (адъювант) при конструировании ассоциированной пятивалентной инактивированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ является весьма актуальным для ветеринарной биотехнологии и требует своего решения.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является определение основных технологических параметров (минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объёме, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда - адъювант) при изготовлении ассоциированной пятивалентной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• подобрать и обосновать оптимальный компонентный состав (соотношение специфических антигенов в дисперсной фазе; дисперсную среду) ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц;

• разработать методику концентрирования вируса инфекционного бронхита кур для изготовления ассоциированной вакцины;

• выбрать масляный адъювант, позволяющий получать стабильную и безвредную ассоциированную вакцину против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, с выраженными иммуногенными свойствами;

• разработать с использованием современного оборудования количественный метод оценки эмульсии типа «вода-масло», получаемой в процессе изготовления инактивированных вакцин;

• изучить физические и иммунобиологические свойства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц;

• разработать нормативную документацию на ассоциированную инактивированную эмульсионную вакцину против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

Научная новизна. Подобран и обоснован оптимальный компонентный состав ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

Определены оптимальные технологические параметры концентрирования инактивированного вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации для изготовления ассоциированной вакцины.

Изучена стабильность ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ с типом эмульсии «вода-масло» на различных этапах эмульгирования с помощью стандартных методов, а также при последовательном воздействии температуры минус 40°С и плюс 37°С.

С помощью метода лазерной дифракционной гранулометрии проведен количественный анализ дисперсных свойств ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ с типом эмульсии «вода-масло» в процессе изготовления.

Изучены физические и иммунобиологические свойства ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, приготовленной с учётом обоснованных технологических параметров.

Практическая значимость.

Для практического использования предлагаются следующие методические указания, которые проверены комиссионно, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

1. «Методика экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»» (2005 г.);

2. «Методика концентрирования вируса инфекционного бронхита кур с помощью проточной ультрафильтрации» (2008 г.);

3. «Методика лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин» (2008 г.).

Результаты научных исследований были использованы при составлении следующей нормативной документации:

• Промышленный регламент на производство вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»;

• СТО на вакцину ассоциированную против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную серии «Пентавис» (СТО 00495527Инструкция по применению вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис».

Основные положения, выносимые на защиту:

• Компонентный состав ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульсионной.

• Метод концентрирования вируса инфекционного бронхита кур с помощью проточной ультрафильтрации.

• Метод экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло».

• Количественный метод изучения дисперсных свойств эмульсионных вакцин.

• Результаты оценки иммунобиологических и физических свойств ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «IV Украинская конференция по птицеводству с международным участием»

(Харьков, 2003 г.), «Международная научная конференция молодых учёных»

(Владимир, 2004 г.), «Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса: Проблемы агроэкономики, ветеринарной медицины и биотехнологии в животноводстве» (Иваново, 2005 г.), «Международная научно-практическая конференция молодых учёных «Достижения молодых ученых – в ветеринарную практику»» (Владимир, 2008 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2003гг.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 1 работа опубликована в издании по перечню ВАК.

Доля личного участия соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные исследования и анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно. В ходе работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГУ «ВНИИЗЖ» и ФГУ «ВГНКИ»: доктор биологических наук А.П. Пономарёв (раздел «Разработка методики концентрирования вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации»); кандидаты ветеринарных наук С.В. Фролов и В.Ю.

Кулаков (раздел «Обоснование компонентного состава ассоциированной инактивированной эмульгированной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ»); кандидаты ветеринарных наук Д.А. Лозовой и Ю.В. Зуев, А.А.

Егоров (раздел «Разработка методики экспресс-определения стабильности эмульсионной вакцины с типом эмульсии «вода-масло»»); кандидаты ветеринарных наук О.А. Борисова, В.Н. Ирза, Т.В. Оковытая, С.К. Старов, Г.И. Кожаева (раздел «Изучение иммуногенной активности ассоциированных вакцин на основе различных масляных адъювантов»), за что выражаем им искреннюю благодарность за оказанную помощь.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 288 источников, в том числе 119 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 25 рисунками и дополнена приложением документов, подтверждающих внедрение результатов работы в ветеринарную практику.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы Вирусы: НБ (производственный штамм «Ла-Сота»), ИБК (производственный штамм «Н-52»), ССЯ-76 (производственные штаммы «БИСС», «В8/78»), ИББ (производственный штамм «К-58») и РВТ (производственный штамм «1133»).

Куры. В лабораторных экспериментах в условиях ФГУ «ВНИИЗЖ»

было вакцинировано более 1000 голов птиц в возрасте от 40 до 110 сут яичных кроссов «Хайсекс Браун» и «Хайсекс Белый», доставленных с птицефабрик «Кинешемская» Ивановской области и «Ковровская»

Владимирской области, а также цыплят, выращенных на базе ФГУ «ВНИИЗЖ». Птицы были как серонегативными к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, так и предварительно вакцинированными живыми вакцинами против этих болезней.

Сыворотки крови. В экспериментах было исследовано более 3000 проб сывороток крови птиц, взятых в различные сроки после иммунизации опытными и опытно-промышленными сериями ассоциированных вакцин. До исследований сыворотки хранили при температуре минус 20°С.

Инактивация вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ. Для инактивации инфекционной активности вирусов использовали димер аминоэтилэтиленимина с различными концентрациями и параметрами, согласно общепринятым методикам.

Определение оптимальных титров инфекционной активности вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в ассоциированной вакцине.

Базовыми оценками содержания антигенов вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в ассоциированной вакцине принимали фактические титры их инфекционной активности в вируссодержащем материале, установленные до процедуры инактивации – 10,5 lg ЭИД50/см3; 7,2 lg ЭИД50/см3; 7,0 lg ЭИД50/см3; 7,0 lg ЭИД50/см3 и 7,0 lg ТЦД50/см3, соответственно.

Для удобства последующих вычислительных операций использовали условный показатель титра вируса, характеризующий минимально возможную концентрацию частиц инактивированного вируса (lgTun), которая фактически находилась в вакцине соответственно предшествующей оценке lgT0 (ЭИД50/см3) и заданной величине разведения антигена D. Необходимые расчеты производили по формуле lgTun = lgT0 - lgD [1].

Определение оптимального компонентного состава ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ. На основании расчётов оптимальных титров инфекционной активности вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в прививном объёме ассоциированной вакцины выяснили минимальные показатели титров инфекционной активности этих вирусов до инактивации. Для определения компонентного состава поливалентной вакцины проводили сопоставление расчётных и фактических величин концентраций инактивированных вирусов, выражая их отношения через коэффициент концентрации (К) и коэффициент кратности концентрации (Кк), расчетные показатели которых использовались для этой цели. Коэффициент концентрации (К) определяли по формуле К= lgTun / lgT0) [2], где: T0 - титр инфекционной активности нативного вируса, Tun – рассчитанный минимальный титр вируса. Коэффициент кратности концентрации (Кк) определяли по формуле Кк= 1 / К [3].

Концентрирование инактивированного вируса ИБК.

Концентрирование инактивированного вируса ИБК методом проточной ультрафильтрации проводили на установке для ультра- и микрофильтрации «Сартокон-мини» (фирма «Sartorius») с использованием кассетных полисульфоновых модулей с пропускной способностью от 50 до 300 кДа.

Содержание общего белка в полученных концентратах устанавливали при измерении оптической плотности на спектрофотометре «BIO-RAD» (США) в проходящем пучке света с длиной волны 260 и 280 нм, с последующим вычислением по методу Бредфорда.

Изготовление экспериментальных образцов ассоциированной вакцины.

Для иммунизации птиц готовили экспериментальные образцы ассоциированной вакцины на основе различных масляных адъювантов:

Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ISA 50 V2, Montanide ESSAI PS 60404 (SEPPIC, Франция), и «Бионит» (Россия), образующих эмульсию типа «вода-масло». Стерильные адъюванты помещали в сосуд гомогенизатора «Silverson Sealed Unit» (Великобритания), и при скорости вращения ротора 1000 об/мин вносили смесь антигенных компонентов, после чего скорость вращения ротора увеличивали до 6000 об/мин. Весовое соотношение адъювантов Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ESSAI PS 60404 и «Бионит» к антигенсодержащей жидкости (дисперсная фаза) составляло 70:30, а объёмное соотношение адъюванта Montanide ISA 50 V2 составляло 50:50.

Оценка физических свойств полученных образцов ассоциированной вакцины. Образцы ассоциированных вакцин считали хорошего качества в следующих случаях. Стабильность эмульсии – при хранении образцов при температуре 37°С в течение 14 сут, а также их центрифугировании отсутствовало отслоение водной фракции на дне пробирки, а отслоение верхней масляной фракции не превышало 10% от общего столба эмульсии; в ходе экспресс-теста отслоение водной фракции на дне пробирки не превышало 15% от общего столба эмульсии. Вязкость – кинематическая вязкость вакцинной эмульсии не превышала 200 мм2/с. Гранулометрический состав эмульсии – средний диаметр частиц дисперсной фазы вакцинной эмульсии не превышал 5,0 мкм, а индекс гомогенности (Span) составлял не более 2,4.

Оценка иммуногенной активности ассоциированной вакцины.

Сущность метода заключается в определении способности вакцины вызывать у привитой птицы выработку специфических антител. Уровни сывороточных антител к вирусам НБ и ССЯ-76 определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) согласно действующим методическим указаниям и выражали в логарифмах с основанием 2 (log2). Специфическую активность сывороток к вирусам ИБК, ИББ и РВТ исследовали с помощью диагностических ИФА наборов фирмы Synbiotics (Франция) и ВНИИЗЖ и выражали в виде обратных значений.

Оценка местных тканевых реакций на введение ассоциированной вакцины. Наблюдение за клиническим состоянием привитых птиц и наружный осмотр области введения ассоциированной вакцины осуществляли ежедневно на протяжении 21 сут после прививки, по завершении этого периода проводили послеубойную визуальную оценку состояния тканей в месте инъекции на разрезе. Результаты определения реактогенного действия вакцины оценивали комплексно, учитывая клиническое состояние птиц, результаты наружного осмотра, а также результаты послеубойной оценки степени поражения тканей, которую проводили по критериям предложенным H. Stone (1997).

Статистическая обработка результатов исследований. Для обработки результатов исследований использовали статистические методы, применяемые в биологии.

2.2. Результаты исследований Обоснование компонентного состава ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц Расчёт оптимального компонентного состава ассоциированной вакцины. Было изготовлено 13 опытных образцов инактивированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG, с различным содержанием антигенов.

В соответствии с принятой технологией изготовления максимальное содержание антигенсодержащего материала в вакцине (D) составляло 30% (т.е. D1=0,300). Кроме этого, из инактивированных вирусов ИБК, ИББ и РВТ были приготовлены составы, включающие 1/2, 1/3, 1/4 и 1/5 (D1=0,15; D2=0,1;

D3=0,075; D4=0,06), а из вирусов НБ и ССЯ-76 – 1/5, 1/6, 1/7,5 и 1/15 (D1=0,06;

D2=0,05; D3=0,04; D4=0,02) указанной концентрации. Было создано 14 групп из серонегативных к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ цыплят в возрасте 40 сут по 5 голов в каждой, которых прививали внутримышечно в объёме 1,0 см3.

Экспериментальные данные по соответствующим специфическим компонентам, входящим в состав вакцин, характеризующие их иммуногенные свойства, представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1 Влияние концентрации инактивированных вирусов НБ и ССЯ-76 на иммуногенную активность ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ Титр инфекционной активности вируса в Разведение Титр антител к вирусу у кур вакцине, исходный и в антигена в РТГА, log2 соответствии с кратностью разведения, lg ЭИД50/см3 НБ (10,5) 1/5 (D1=0,06) 9,3 9,2±0,4 1/6 (D2=0,05) 9,2 9,8±0,6 1/7,5 (D3=0,04) 9,1 8,8±0,5 1/15 (D4=0,02) 8,8 8,2±0,4 Минимальный титр 5 ССЯ-76 (7,0) 1/5 (D1=0,06 ) 5,8 11,6±0,2 1/6 (D2=0,05) 5,7 12,0±0,1 1/7,5 (D3=0,04) 5,6 12,0±0,1 1/15 (D4=0,02) 5,3 10,4±0,2 Минимальный титр 5 Показано, что ассоциированные эмульсионные вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ с максимальным (50-ти кратным) разведением инактивированных вирусов НБ и ССЯ-76 в водной фазе вызывали у привитых птиц формирование высоких уровней гуморальных антител значительно превышающих минимальные титры, используемые для оценки эффективности вакцины по этим компонентам (5 log2).

Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что вакцина, содержащая в дисперсной фазе суспензию инактивированного вируса ИБК, разведённую в 16,7 раза, индуцировала у цыплят низкий уровень антител (755±221) по сравнению с минимально необходимым - 1642.

Формирование титра антител (4196±164), превышающего минимально необходимый, стимулировал биопрепарат с 6,7-кратным разведением вируса ИБК. Вакцина с максимальным (16,7-ти кратным) разведением инактивированных вирусов ИББ и РВТ в водной фазе вызывала у птиц образование уровней гуморальных антител, превышающих протективные титры, используемые для оценки эффективности вакцины 2810 и 2150, соответственно.

Инактивированные вирусы НБ и ССЯ-76 имели высокий запас иммуногенной эффективности, даже при 50-кратном их разведении они обеспечивали у привитых цыплят формирование высоких титров антител, а инактивированные вирусы ИББ и РВТ, разведённые в 16,7 раз, вызвали образование уровней антител, сравнимых с минимально необходимыми титрами.

Таблица 2 Влияние концентрации инактивированных вирусов ИБК, ИББ и РВТ на иммуногенную активность пятивалентной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ Титр инфекционной активности вируса в вакцине, Титр антител к вирусу у Разведение исходный и в соответствии с кур в ИФА антигена кратностью разведения, lg ЭИД50/см3, lg ТЦД50/см3 ИБК (7,2) 1/2 (D1=0,15) 6,4 4196±164 1/3 (D2=0,1) 6,2 1108±380 1/4 (D3=0,075) 6,1 691±182 1/5 (D4=0,06) 6,0 755±221 Минимальный титр 1642 ИББ (7,0) 1/2 (D1=0,15) 6,2 5642±213 1/3 (D2=0,1) 6,0 4893±376 1/4 (D3=0,075) 5,9 4597±551 1/5 (D4=0,06) 5,8 4112±182 Минимальный титр 2810 РВТ (7,0) 1/2 (D1=0,15) 6,2 2544±374 1/3 (D2=0,1) 6,0 2329±760 1/4 (D3=0,075) 5,9 2055±902 1/5 (D4=0,06) 5,8 2025±347 Минимальный титр 2150 Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что изменение концентрации инактивированных вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в дисперсной фазе ассоциированной эмульсионной вакцины влияет на ее иммуногенные свойства и подчиняется зависимости «доза-эффект».

В дальнейшем были проведены расчёты минимальных титров инфекционной активности вирусов (до этапа инактивации), входящих в состав пятивалентной инактивированной вакцины, с использованием статистических методов. В результате изучения иммуногенного действия вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в составе ассоциированной вакцины были построены 5 регрессионных моделей, выражающих зависимость «дозаэффект». Определяли влияние концентрации антигена в препарате на уровень антител, создаваемого вакциной в привитом стаде.

Установлено (табл. 3), что коэффициенты корреляции показателей lgTun и Тser для всех совокупностей превышали величину r=0,81, что свидетельствует о весьма устойчивой связи типа «титр инфекционной активности вируса титр антител». Используя уравнения регрессионной модели, рассчитанные для каждого из 5 антигенов, входящих в состав инактивированной вакцины, определили требуемые титры инфекционной активности вирусов в прививном объёме до инактивации. С учетом статистических характеристик регрессионной модели данные величины находились в диапазоне доверительного интервала (7,25lgТun7,83) для вируса НБ, (6,01lgТun6,33) для вируса ИБК, (3,03lgТun3,61) для вируса ССЯ-76, (5,37lgТun5,49) для вируса ИББ и (5,8lgТun6,1) для вируса РВТ.

–  –  –

Примечание: принимая 1 (единицу) за условный полный объём при равном объемном соотношении антигенов Поскольку титры инфекционной активности производственных расплодок вирусов НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ представлены в виде средних значений из выборки в 10 вариант, то можно считать эти показатели технологическими и окончательными, поэтому рассчитанный компонентный состав для пятивалентной инактивированной эмульсионной вакцины является также окончательным, и он был рекомендован к использованию в технологии производства биопрепарата.

Разработка методики концентрирования вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации. Как было показано выше, инактивированный вирус ИБК обладает недостаточной иммуногенной активностью в составе ассоциированной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ, поэтому требуется увеличение его объёма в водной фазе за счет уменьшения концентрации других специфических антигенных компонентов.

Если повышение концентрации вируса ИБК в прививном объёме за счет увеличения его объёмного содержания по каким-либо причинам невозможно, то в качестве альтернативного способа можно использовать концентрирование. Для этого использовали метод проточной ультрафильтрации, как наиболее щадящий и технологичный. Было сконцентрировано 4 партии суспензии инактивированного вируса ИБК объёмом по 10 л каждая через фильтры с отсекающей способностью от 30 до 300 кДа со средней кратностью концентрирования по объёму 30 раз.

Наиболее оптимальным оказалось использование фильтрующих модулей с отсекающей способностью более 50 кДа, поскольку при этом потери вируса в фильтрат были минимальными. Далее с использованием данных модулей были получены 5- и 10-кратные концентраты инактивированного вируса ИБК, на основе которых были изготовлены эмульсионные вакцины.

Результаты иммунизации цыплят обычной вакциной против ИБК и концентрат-вакцинами представлены в табл. 6, из которых следует, что вакцина с исходным антигеном индуцировала 4-кратную сероконверсию до титра 1:5913, а биопрепараты, приготовленные из 5- и 10-кратных концентратов, вызывали образование антител в более высоких уровнях 1:12327 и 1:17884, соответственно.

Таблица 6 Иммуногенная активность вакцин, содержащих концентраты инактивированного вируса ИБК Титры антител в ИФА через, сут.

Кратность концентрата До вируса ИБК в вакцине 14 28 вакцинации исходный 1:1781 1:5913 5 1:3203 1:12327 1:1490 10 1:13813 1:17884 Контроль 1:1600 1:1523 Таким образом, применение проточной ультрафильтрации с использованием модулей с отсекающей способностью более 50 кДа для концентрирования вируса ИБК было эффективным и приводило к значительному увеличению антигенной активности вакцины. Полученные в ходе этих экспериментов результаты легли в основу «Методики концентрирования вируса инфекционного бронхита кур при помощи проточной ультрафильтрации», которая была одобрена учёным советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ».

Разработка методов контроля физических свойств инактивированных эмульсионных вакцин Разработка методики экспресс-определения стабильности эмульсионной вакцины с типом эмульсии «вода-масло». В опытах был разработан простой и быстрый в технологическом плане экспресс-метод определения стабильности масляных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»

путём последовательного замораживания и оттаивания эмульсии. Принцип предлагаемого метода определения стабильности эмульсий обратного типа заключается в том, что образец инактивированной вакцины замораживали при температуре минус 40°С в течение 1 ч, после чего пробирки с вакциной помещали на 1 ч в термостат с температурой 37°С. В результате такого воздействия в нестабильных и неоднородных эмульсиях происходило отслоение водной фазы. Для сравнения новой методики с методом «быстрого старения» и пробой центрифугированием были изготовлены образцы эмульсионных вакцин с продолжительностью эмульгирования от 2 до 12 мин, и проведены параллельные эксперименты. На основе полученных результатов были предложены следующие критерии оценки стабильности эмульсионных вакцин при исследовании в экспресс-методе по отслоению водной фазы: более 15% - не удовлетворительно; от 5 до 15% удовлетворительно и менее 5% - хорошо. Данная методика была опробована при определении стабильности нескольких образцов эмульсионных вакцин различных производителей, а также при определении стабильности вакцинной эмульсии на нескольких этапах ее диспергирования при промышленном производстве. Новый тест был более чувствительным по сравнению с определением стабильности эмульсии центрифугированием и требовал минимальных затрат времени в сравнении с тестами «быстрого старения». Результаты этих экспериментов легли в основу методики «Экспресс-метод определения стабильности инактивированной вакцины с обратным типом эмульсии «вода-масло»», одобренной учёным советом и утвержденной директором ФГУ «ВНИИЗЖ».

Разработка метода лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин.

Из доступных методов количественного изучения дисперсных свойств эмульсий наибольший интерес и перспективу представляет лазерная дифракционная гранулометрия, которая была успешно адаптирована и испытана. Для этого с использованием лабораторного оборудования было изготовлено 5 образцов эмульсионных вакцин с различной степенью готовности (предэмульсия, эмульгирование в течение от 1 до 7 мин).

Результаты измерений частиц дисперсной фазы эмульсий типа «вода-масло»

лазерной гранулометрией с помощью анализатора «Microtrac S3500» (США) контролировали визуальной оценкой состояния эмульсии на световом микроскопе «Olympus BX40» (Япония). Испытуемый метод показал, что размер частиц дисперсной фазы эмульсии зависит от времени диспергирования водно-масляной смеси, т.е. с увеличением времени диспергирования средний размер частиц становится меньше, что визуально подтверждалось микроскопическими исследованиями. Исследования показали возможность использования описанного метода в качестве одного из звеньев контроля качества вакцины непосредственно в процессе промышленного производства биопрепаратов, который позволял быстро и точно определять размер частиц дисперсной фазы эмульсии и её однородность. Эти результаты легли в основу «Методики лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин», которая была одобрена учёным советом и утверждена директором ФГУ «ВНИИЗЖ».

Изучение иммунобиологических и физических свойств ассоциированных вакцин на основе различных адъювантов На основе определённого оптимального компонентного состава вакцины нами были изготовлены несколько образцов ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины с использованием нескольких масляных адъювантов: Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ISA 50 V2, Montanide ESSAI PS 60404 (SEPPIC, Франция) и масляный адъювант фирмы «Бионит» (Россия).

Изучение физических свойств ассоциированных вакцин на основе различных масляных адъювантов. Оценивали такие физические параметры приготовленных вакцин, как тип полученной эмульсии, стабильность вакцинной эмульсии (использовали метод центрифугирования, метод «быстрого старения», экспресс-метод), гранулометрические свойства (средний размер частиц эмульсии, гомогенность) и кинематическая вязкость.

Все образцы имели кинематическую вязкость значительно ниже предела, установленного нормативной документацией – 200 мм2/с.

Определение стабильности образцов ассоциированных вакцин в тестах центрифугирования, «быстрого старения» и экспресс-метода показало хорошее качество эмульсии почти у всех испытуемых образцов, за исключением ассоциированной вакцины, приготовленной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 50 V2, поскольку во всех тестах было обнаружено отслоение водной фракции. При изучении результатов лазерной гранулометрии образцов ассоциированной вакцины было обнаружено, что масляные адъюванты Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG, Montanide ESSAI PS 60404 и «Бионит» образуют так называемую «тонкую»

эмульсию, что подтверждается средним диаметром частиц дисперсной фазы вакцинных эмульсий, которые имели следующие значения: 0,821 мкм; 0,921 мкм; 3 мкм и 1,082 мкм, соответственно, с индексом гомогенности (Span) не более 0,9. Такие размеры частиц дисперсной фазы эмульсий обратного типа являются допустимыми, поскольку известно, что наиболее оптимальной иммунологической эффективностью обладают вакцины, размер микрочастиц которых менее 5 мкм. При изучении гранулометрического состава эмульсионной вакцины, изготовленной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 50 V2, было обнаружено, что средний диаметр частиц дисперсной фазы составил 10,04 мкм, и размер частиц колебался в широких пределах – от 7,65 до 14,1 мкм. При этом прослеживается прямая зависимость между крупным размером частиц дисперсной фазы вакцины, изготовленной на основе адъюванта Montanide ISA 50 V2, и её неудовлетворительной стабильностью.

Изучение иммуногенной активности ассоциированных вакцин на основе различных масляных адъювантов. Экспериментальными ассоциированными инактивированными биопрепаратами против НБ, ССЯИБК, ИББ и РВТ, приготовленными с использованием масляных адъювантов серии Montanide и «Бионит», вакцинировали птиц в возрасте 90 сут, внутримышечно, в прививном объёме 1,0 см3. Подопытные птицы были получены из товарного птицеводческого хозяйства яичного направления, где ранее были иммунизированы живыми вакцинами против НБ, ИБК, ИББ и РВТ в соответствии со схемой специфической профилактики, принятой на птицефабрике. Изучение иммуногенной активности каждого специфического компонента в составе ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ проводили в динамике, отбирая образцы крови у цыплят до вакцинации (Д/В), а также через 14, 28 и 60 сут после неё. Показано, что все испытуемые вакцины, содержащие различные адъюванты, вызывали у привитых птиц формирование выраженного иммунитета к вирусу НБ, причем повышение титров антител происходило постепенно в соответствии со сроками взятия крови (табл. 7).

–  –  –

В абсолютных значениях показателей титров антител к вирусу НБ наибольшей иммуногенной активностью обладали вакцины, изготовленные на основе адъювантов Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA M 70 VG и «Бионит», через 14 сут после прививки, уровни антител у птиц составляли от 12,7 до 13,1 log2; такая же зависимость наблюдалась и на 28 сут после иммунизации - титры антител увеличились до 14,4-16,4 log2. Вакцины, имеющие в своём составе адъюванты Montanide ISA 50 V2 и Montanide ESSAI PS 60404, обладали менее выраженной иммуногеностью, через 28 сут после вакцинации значения титров антител у кур составляли 11,2±0,4 log2 и 9,1±0,7 log2, соответственно. Следует отметить, что у всех птиц уровни специфических антител к вирусу НБ через 28 сут после иммунизации значительно превышали минимальный защитный уровень - 5,0 log2. Также, у всех кур иммунизированных экспериментальными ассоциированными вакцинами отмечалась сероконверсия в отношении вируса ИБК.

Все 5 образцов вакцин индуцировали у привитых птиц напряжённый иммунитет к вирусу ССЯ-76, причем динамика его развития по срокам исследования была сравнимой для всех испытанных препаратов. Однако в группах птиц, вакцинированных биопрепаратами на основе масляных адъювантов Montanide ISA M 70 VG и Montanide ESSAI PS 60404, динамика образования титров антител была несколько ниже первой группы, представленной адъювантами Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA 50 VG и «Бионит», уровни антигемагглютининов у птиц через 14 сут составляли 5,8±0,5 log2 и 5,0±0,5 log2, а через 28 сут – 10,1±0,7 log2 и 7,4±0,5 log2, соответственно. Тем не менее, через 60 сут после вакцинации их уровни были сравнимы с препаратами первой группы.

Испытуемые ассоциированные биопрепараты обладали иммуногенной активностью и по специфическому компоненту ИББ, но динамика формирования иммунитета у привитых птиц была неравномерной, через 14 сут после вакцинации отмечали незначительный прирост титров антител, а наиболее значительный подъём был зафиксирован через 28 сут, который продолжался до 60 сут.

Высокий иммунитет к вирусу РВТ создавался при применении всех ассоциированных инактивированных эмульсионных вакцин, причём повышение титров антител происходило постепенно, и к 28 сут после прививки в группах птиц, получивших биопрепараты на основе масляных адъювантов Montanide ISA M 70 VG и «Бионит», достигали значений – 3988±547 и 3901±399, соответственно, а в группах кур, иммунизированных вакцинами на основе Montanide ISA 70 VG, Montanide ESSAI PS 60404 и Motanide ISA 50 V2, титры антител были примерно одинаковыми и имели значения в пределах 4376-4856, т.е. превышали требуемый минимальный защитный уровень специфических антител – 2150.

Изучение реактогенных свойств ассоциированных вакцин изготовленных на основе различных адъювантов. С этой целью была проведена вакцинация птиц внутримышечно, в область груди, по 1,0 см3 биопрепаратами на основе масляных адъювантов серии Montanide и «Бионит». По окончании срока наблюдений (21 сут) всех птиц подвергали эвтаназии, вскрывали места введения и оценивали изменения тканей по критериям, предложенным H. Stone (1997).

Результаты осмотра мест инъекции биопрепаратов показали, что реактогенные свойства эмульсионных вакцин, изготовленных на основе различных адъювантов, были разными – от лёгкой степени до сильных поражений. Так, наибольшей реактогенностью обладала ассоциированная вакцина на основе масляного адъюванта Montanide ISA М 70VG, которая вызывала у цыплят в местах введения сильные воспалительные реакции.

Вакцины на основе масляных адъювантов Montanide ISA 70 VG, Montanide ISA 50 V2, Montanide ESSAI PS 60404 и «Бионит» индуцировали в месте инъекции изменения тканей лёгкой степени, без развития выраженных воспалительных реакций.

Таким образом, ассоциированная инактивированная вакцина с эмульсией обратного типа, полученная на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG, имела стабильную эмульсию, была безвредна для цыплят и обладала выраженными иммуногенными свойствами по всем пяти антигенным компонентам (НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ), индуцировала более чем двукратный прирост титров антител относительно фоновых уровней и может быть рекомендована для «бустерной» иммунизации птицепоголовья.

Комиссионные испытания ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ В соответствии с приказом директора ФГУ «ВНИИЗЖ» на базе лаборатории аденовирусных инфекций птиц были проведены комиссионные испытания эффективности ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯИББ и РВТ инактивированной эмульсионной.

Компоновку биопрепарата осуществляли согласно рассчитанным технологическим критериям, полученную смесь инактивированных вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ объединяли с масляным адъювантом Montanide ISA 70 VG в весовом соотношении 30:70, и диспергировали с помощью лабораторного гомогенизатора «Silverson Sealed Unit».

Испытание иммуногенной активности опытной вакцины осуществляли на 20 цыплятах в возрасте 70 сут, 10 из которых иммунизировали внутримышечно в прививном объёме 1 см3, а 10 оставили в качестве контрольной группы. Отбор крови для получения сывороток осуществляли до вакцинации, через 14, 28 и 60 сут после ее проведения. Сыворотки крови исследовали методом РТГА на наличие антител к вирусам НБ и ССЯ-76 и методом ИФА (коммерческие наборы фирмы «Synbiotics») на наличие антител к вирусам ИБК, ИББ и РВТ.

Результаты исследований титров антител у привитых птиц к каждому антигенному компоненту ассоциированной вакцины приведены в табл. 8.

Таблица 8 Результаты комиссионных испытаний иммуногенной активности ассоциированной вакцины Титры антител Антигенный Минимальные Фактические титры, сут наблюдений компонент титры Д/В 14 28 60 НБ 6,7±0,9 11,1±0,5 13,4±0,3 16,7±0,3 5 log2 Контроль 6,2±0,6 6,9±0,5 6,5±0,7 5,9±0,9 ИБК 1524±402 4135±265 9552±567 8692±381 1642* Контроль 1673±165 1709±455 1668±398 1743±404 ССЯ-76 н/о 8,8±0,4 12,3±0,6 10,4±0,4 5 log2 Контроль н/о н/о н/о н/о ИББ 1733±300 3421±399 5177±390 4867±686 2810* Контроль 1887±487 1924±505 1799±571 1744±724 РВ 2388±332 4007±879 4320±544 5329±507 2150* Контроль 2299±409 2103±388 2244±421 2509±390 Примечания: Д/В – титры антител до вакцинации; н/о – не обнаружено;* - два минимальных положительных значения.

Установлено, что титры антител к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ у цыплят через 28 сут после прививки значительно увеличивались по сравнению с исходными титрами, в несколько раз превышали требуемые минимальные титры ко всем антигенным компонентам вакцины и сохранялись на высоком уровне в течение всего срока наблюдений (60 сут).

Опытный образец вакцины обладал высокой иммуногенной активностью и вызывал у цыплят формирование высокого уровня антител к вирусу НБ, причем прирост титров регистрировался в течение всего срока наблюдений и достигал максимального значения 16,7±0,3 log2 через 60 сут. По компонентам ИБК и ССЯ-76 наивысший прирост антител наблюдался через 28 сут и составлял 9552±567 и 12,3±0,6 log2, соответственно. Испытуемая вакцина обладала высокой иммуногенной активностью и вызывала формирование высоких титров антител к вирусу ИББ с достижением максимальных значений через 28 сут после вакцинации – 5177±390, а к вирусу РВТ прирост титров антител происходил равномерно в течение всего эксперимента и достигал максимального значения 5329±507 через 60 сут после иммунизации.

В заключение отмечено, что вакцина вызывала формирование титров антител, которые более чем в 2 раза превышали минимальные защитные титры, обеспечивающих защиту от соответствующих инфекций. При макроскопическом осмотре мест введения вакцины отмечены изменения тканей лёгкой степени по классификации H. Stone.

Производственные испытания экспериментальной серии ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в условиях птицефабрики «Ивановский бройлер»

показали высокую эффективность биопрепарата. Ремонтный молодняк в количестве 12000 голов, предварительно праймированный живыми вакцинами против НБ, ИБК, ИББ и РВТ согласно схемам, принятым на предприятии, прививали в возрасте 70 сут ассоциированной вакциной. Через 1 мес после иммунизации в опытной группе птиц был отмечен, относительно исходных значений, более чем двукратный прирост титров антител к специфическим компонентам вакцины, которые оставались на высоком уровне в течение всего срока наблюдений (280 сут).

Таким образом, в результате проведённых исследований были установлены и обоснованы такие важные с технологической точки зрения критерии, как оптимальный сбалансированный состав специфических компонентов в дисперсной фазе и эффективная дисперсная среда (масляный адъювант Montanide ISA 70 VG) для ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, имеющей стабильные физические свойства, низкую реактогенность и выраженную иммуногенную активность. Основные технологические параметры изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ, определенные в ходе лабораторных исследований, были положены в основу комплекта НД (Промышленный регламент, СТО, инструкция по применению) на данный биопрепарат.

3. ВЫВОДЫ

1. Определены и обоснованы основные технологические параметры (минимальные титры инфекционной активности специфических компонентов в прививном объёме, компонентный состав дисперсной фазы, дисперсная среда – адъювант) для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц.

2. Установлены минимальные титры инфекционной активности вирусов НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ в прививном объёме ассоциированной эмульсионной вакцины, обеспечивающие у кур выработку протективных уровней антител к этим компонентам. Эти величины должны составлять для антигена: НБ - 7,54 lg ЭИД50/см3; ССЯ-76 - 3,32 lg ЭИД50/см3; ИБК - 6,17 lg ЭИД50/см3; ИББ - 5,43 lg ЭИД50/см3 и РВТ - 5,94 lg ТЦД50/см3.

3. Определены минимальные значения титров инфекционной активности вирусов до инактивации, необходимые для изготовления ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины для вируса: НБ – 9,0 lg ЭИД50/см3;

ИБК – 7,5 lg ЭИД50/см3; ССЯ-76 – 4,8 lg ЭИД50/см3; ИББ – 6,7 lg ЭИД50/см3 и РВТ – 7,3 lg ТЦД50/см3.

4. Разработан метод концентрирования инактивированного вируса ИБК с помощью проточной ультрафильтрации, позволяющий при 30-кратном по объёму концентрировании увеличить активность вирусного материала при исследовании в Б-ИФА с 1:3200 до 1:204800.

5. Для технологического контроля при производстве инактивированных биопрепаратов с типом эмульсии «вода-масло» разработан экспресс-метод определения стабильности вакцин, основанный на последовательном воздействии на образец низкой и высокой температуры.

6. Разработан количественный метод оценки дисперсных свойств (размер частиц дисперсной фазы и гомогеннсть эмульсии) эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло» с помощью лазерной дифракционной гранулометрии.

7. При сравнительных испытаниях масляных адъювантов серии Montanide и «Бионит» в составе ассоциированной вакцины против НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ показано, что биопрепарат на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG превосходил другие вакцины по физическим (стабильность, реологические показатели) и иммунобиологическим (иммуногенность, безвредность) свойствам.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предложены следующие методики, которые одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

1. «Методика экспресс-определения стабильности эмульсионных вакцин с типом эмульсии «вода-масло»» (2005 г.);

2. «Методика концентрирования вируса инфекционного бронхита кур при помощи проточной ультрафильтрации» (2008 г.);

3. «Методика лазерной гранулометрии эмульсионных вакцин» (2008 г.).

Результаты научных исследований по определению основных технологических параметров при конструировании ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против НБ, ССЯ-76, ИБК, ИББ и РВТ были использованы при составлении следующей нормативной документации, одобренной учёным советом, утверждённой директором ФГУ «ВНИИЗЖ»:

1. Промышленный регламент на производство ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис»;

2. СТО на ассоциированную вакцину против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную серии «Пентавис» (СТО 00495527Инструкция по применению ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной серии «Пентавис».

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Определение размера частиц дисперсной фазы инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 / Д.А. Лозовой, В.В.

Борисов, А.А. Егоров, Д.Л. Долгов // Птахiвництво. Материалi V Укранско конференциii по птахивництву з мiжнародною участю. - вип.

53. - Харкiв, 2003. - С. 586-591.

2. Изучение иммуногенных свойств концентратов инактивированного вируса инфекционного бронхита кур / Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, Д.Л.

Долгов, Н.Н. Луговская, С.В. Фролов, А.П. Пономарев // Птахiвнитцтво:

Материалi V Укранско конференциii по птахивництву з мiжнародною участю. - вип. 55. - Харкiв, 2004. - С. 539-543.

3. Ассоциированная инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, реовирусного теносиновита и инфекционной бурсальной болезни птиц и её физико-биологические свойства / В.В. Борисов, Д.А. Лозовой, Д.Л.

Долгов, А.В. Борисов, Н.Н. Луговская, В.Н. Ирза, Т.В. Оковытая, С.К.

Старов, Г.И. Кожаева // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 292-302.

4. Влияние концентрации балластных белков в водной фазе инактивированной вакцины на стабильность эмульсии / Д.Л. Долгов, Д.А.

Лозовой, В.В. Борисов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 303-308.

5. Лозовой, Д.А. Изучение дисперсных свойств вакцины с обратным типом эмульсии разными методами / Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, Д.Л. Долгов, А.А. Егоров // Акт. пробл. и перспект. разв. агропром. комплекса: Пробл.

агроэкономики, вет. мед. и биотехнол. в жив-ве. - Иваново, 2005. - Т. 2. С. 121-128.

6. Экспресс-тест определения стабильности масляных вакцин с эмульсией обратного типа // Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, Д.Л. Долгов, В.И. Филатов, Ю.В. Зуев // Сб. научн. тр. ВГНКИ. - М., 2005. - т.65. - С. 119-128.

7. Контроль физических свойств инактивированных эмульсионных вакцин против вирусных болезней птиц / Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, Д.Л.

Долгов, Борисов А.В., Егоров А.А. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. - М., 2005. - Т.

66. - С. 99-106.

8. Долгов, Д.Л. Динамика формирования гуморальных антител к вирусам НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ у кур, привитых ассоциированной инактивированной вакциной / Д.Л. Долгов, В.В. Борисов, С.В. Фролов, А.В. Борисов // Ветеринарная патология. - 2007. - №4. - С. 147-152.

_______________________________________________________________________

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»), 90 экз., 2008 г.



Похожие работы:

«Journal of Siberian Federal University. Engineering & Technologies 5 (2013 6) 543-554 ~~~ УДК 629.4.014.22: 621.791.92 Восстановление в депо профиля бандажей промышленных электровозов с помощью наплавки без выкатки колесных пар А.П. Буйносов* Уральский государственный университет путей сообщения Россия 62003...»

«Вестник КрасГАУ. 20 10. №1 УДК 40.3 (571.51) О.В. Коваленко СОВРЕМЕННОЕ ПОЧВООБРАЗОВАНИЕ В НИЗКОГОРНОЙ ЧАСТИ ВОСТОЧНОГО САЯНА (ЗАПОВЕДНИК "СТОЛБЫ") В работе рассматривается взаимодействие факторов почвообразования и современного почвенного покрова низкогорной части заповедника "Столбы". Экологическо...»

«ТРУДЫ ЮЖНОГО НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ИНСТИТУТА МОРСКОГО РЫБНОГО ХОЗЯЙСТВА И ОКЕАНОГРАФИИ 2010 ТОМ 48 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ КОМПЛЕКСНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В АЗОВО-ЧЕРНОМОРСКОМ БАССЕЙНЕ И МИРОВОМ ОКЕАНЕ ...»

«ЧЕРНОВА Александра Михайловна СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА ПРОДУКТИВНОСТИ КУБЫШКИ ЖЁЛТОЙ (NUPHAR LUTEA, NYMPHAEACEAE) В УСЛОВИЯХ МАЛЫХ РЕК ВЕРХНЕГО ПОВОЛЖЬЯ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологи...»

«Шадже А.Е., Сиротюк Э.А., Шадже А.И.СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ ПО ЭКОЛОГИИ Майкоп – 2016 УДК 574 (03) ББК 20.1 Ш-16 Рекомендовано научно-техническим советом ФГБОУ ВО "Майкопский государственный технологический университет" Р е ц е н з е н т ы : Акатов В.В. – доктор био...»

«Пояснительная записка Рабочая программа составлена на основе Федерального Государственного стандарта, Примерной программы основного общего образования по биологии, федерального базисного учебного плана для образовательных учреждений РФ и авторской программы А.Г. Драгомилова, Р.Д. Маша к учеб...»

«ГЛАДЫШЕВ ПАВЕЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ РАЗРАБОТКА ФОТОБИОРЕАКТОРОВ ДЛЯ ЗАМКНУТЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ Специальность 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук МОСКВА – 2007 Работа выполнена в Московском государственном университете...»

«0 Научно-исследовательская работа Биология Тема работы: "Современная теория создания человека" Хертек Айсуу Олеговна, Выполнила: обучающаяся класса Государственного автономного общеобразовательного учреждения республики Тыва "Тувинский республиканский лицей-интернат" Маадыр-оол Урана Руководитель:...»

«Известия ТИНРО 2016 Том 186 УСЛОВИЯ ОБИТАНИЯ ПРОМЫСЛОВЫХ ОБЪЕКТОВ УДК 574.52(265.54) Н.К. Христофорова1, 2, Ю.Е. Дёгтева1, К.С. Бердасова1, А.А. Емельянов3, А.Ю. Лазарюк4* Дальневосточный федеральный университет, 690091, г. Владивосток,...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Сыктывкарский лесной институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный лесотехнический...»

«Муниципальное дошкольное бюджетное образовательное учреждение детский сад №3 "Ручеёк" Проект "ГТО в детский сад. Возрождение традиций"Авторы проекта: Шантор А.Ю.заведующий, Мешкова О.Ю.старший воспитатель, Куляпин Е.Н. – инструктор по физической культуре, Соловьёва Л.А.воспитатель 2016-17 уч. год. Название проекта: "...»

«ЛЕТНЯЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ШКОЛА-2017 ПРИГЛАШАЕТ УЧАЩИХСЯ И РОДИТЕЛЕЙ В БОЛГАРИЮ! ПЛАНИРУЕТСЯ 2 СМЕНЫ: Первая с 10 по 22 июня 2017 года для учащихся 7-10 классов; вторая – с 17 по 29 августа 2017 года! Возможна дополнительная смена в июле с оздоровительным уклоном, если будут заявки. П...»

«MИНИНЗОН И. Л., ТРОСТИНА О. В.ЧЕРНАЯ КНИГА ФЛОРЫ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ: ЧУЖЕРОДНЫЕ ВИДЫ РАСТЕНИЙ, ЗАНОСНЫЕ И КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ, АКТИВНО НАТУРАЛИЗУЮЩИЕСЯ В УСЛОВИЯХ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ. Третья электронная версия. НИЖНИЙ НОВГОРОД ОГЛАВЛЕНИЕ: Предисловие......................»

«ОТЧЕТ ПО ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ за 2014 год филиала "Уральский территориальный округ" ФГУП "РосРАО" УТВЕРЖДАЮ Директор филиала "Уральский территориальный округ" ФГУП "РосРАО" _ О.Л. Ананьев (подпись) "" _ 2015 г. Отчет...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.