WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«Геномная и протеомная характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis кластера Beijing B0/W148 ...»

На правах рукописи

БЕСПЯТЫХ ЮЛИЯ АНДРЕЕВНА

Геномная и протеомная характеристика штаммов

Mycobacterium tuberculosis кластера Beijing B0/W148

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2016

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении

«Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства», в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов доктор биологических наук,

Научные руководители:

профессор РАН Ильина Елена Николаевна

Официальные оппоненты: Ажикина Татьяна Леодоровна доктор биологических наук, ФГБУН Институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова Российской академии наук, лаборатория структуры и функций генов человека, ведущий научный сотрудник Ларина Ирина Михайловна доктор медицинских наук, профессор, ФГБУН "Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медикобиологических проблем Российской академии наук", лаборатория протеомики заведующий лабораторией ФГБУ «Федеральный исследовательский

Ведущая организация:

центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук»



Защита состоится 1 декабря 2016 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при и Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИБМХ www.ibmc.msk.ru.

Автореферат разослан 2016 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Карпова Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В Российской Федерации туберкулез остается одной из актуальных проблем здравоохранения. Несмотря на общую тенденцию к снижению заболеваемости впервые выявленными активными формами туберкулеза, ситуация остается чрезвычайно напряженной. По оценкам Всемирной организации здравоохранения Россия является одной из 22 стран с наибольшим бременем туберкулеза. В стране регистрируется более трети всех новых случаев туберкулеза, зарегистрированных в Европейском регионе (ВОЗ, 2015), причем смертность от заболевания превышает показатели стран Европы в 5 – 8 раз.

Ситуация осложняется появлением так называемых «успешных клонов» Mycobacterium tuberculosis, характеризующихся повышенной лекарственной устойчивостью (Bifani et al., 2002; Lipin et al., 2007), и вирулентностью (Dormans et al., 2004). На территории России одним из таких клонов является кластер Beijing B0/W148, доля которого среди российских штаммов неуклонно возрастает. Представители кластера выявляются в 25 % случаев от общего количества изолятов семейства Beijing и обладают рядом характерных особенностей по сравнению с другими генотипами: более строгой ассоциацией с лекарственной устойчивостью, увеличенной трансмиссивностью и фитнес-успешностью (Mokrousov, 2013).

Представленные обстоятельства делают эндемичные для России штаммы M.





tuberculosis кластера Beijing B0/W148 наиболее значимым объектом для исследования.

Очевидно, что весьма актуальным направлением в изучении штаммов M. tuberculosis является обнаружение факторов, обуславливающих «успешность» отдельных представителей. На сегодняшний день это возможно с применением подходов системной биологии. Так, до недавнего времени изучение молекулярных особенностей микобактерий базировалось в основном на генетическом тестировании. Однако, опираясь на опыт применения технологии полногеномного секвенирования с последующим сравнительным анализом, стали очевидны ограничения такого подхода для полноценного описания причин развития лекарственной устойчивости и проявления патогенности (Warner et al., 2013). Так, большинство замен обнаруживается в промоторных областях генов и белках с гипотетической функцией, роль которых в физиологии микобактерий не ясна. В этой связи актуальным становится функциональный анализ информации, реализуемой геномом патогена, что возможно с привлечение различных методов протеомного тестирования. Таким образом, глубокая инвентаризация протеома M. tuberculosis поможет собрать воедино известные данные об особенностях геномной организации и физиологии патогена. В свою очередь анализ совокупно накопленной геномной и протеомной информации приблизит нас к пониманию молекулярных механизмов адаптации M.

tuberculosis. Эти данные будут иметь несомненную научную ценность, как в решении прикладных задач, связанных с поиском новых средств элиминации возбудителя, так и фундаментальных, касающихся расширения знаний о физиологии и клеточной организации микобактерий.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являлось описание характерных протеомных и геномных особенностей штаммов Mycobacterium tuberculosis кластера Beijing B0/W148 для выяснения потенциальных факторов патогенности.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Формирование экспериментальной группы клинических изолятов M.

tuberculosis кластера Beijing B0/W148

2. Описание геномной организации и мутационного профиля изолятов M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148

3. Разработка протокола инвентаризации белков микобактерий с привлечением средств количественного протеомного анализа

4. Изучение характерных протеомных особенностей кластера Beijing B0/W148 по сравнению с лабораторным штаммом H37Rv

5. Анализ совокупных протеомных и геномных данных для выяснения потенциальных факторов патогенности кластера Beijing B0/W148 Личное участие автора в получении результатов Основной вклад автора состоит в детальном планировании и реализации экспериментальной части, анализе результатов, обобщении литературных данных и написании диссертационной работы. Автором осуществлена адаптация метода экстракции и последующего гидролиза белков микобактерий для LC-MS/MS анализа. Проведен сбор коллекции биологических образцов. Проанализированы результаты полногеномного секвенирования и количественного протеомного анализа. Обнаружены и экспериментально подтверждены неизвестные ранее рекомбинационные события в геноме M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148. Произведен поиск генетических и протеомных маркеров M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148, потенциально ассоциированных с патогенностью.

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые описаны характерные геномные и протеомные особенности клональной группы штаммов возбудителя туберкулеза - M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148, успешно распространяющегося на территории Российской Федерации.

Впервые разработан оригинальный протокол инвентаризации белков микобактерий средствами LC-MS/MS анализа.

Впервые для штаммов M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148 проведено соответствие между данными геномного и протеомного анализа.

Впервые на основании протеомных данных предсказаны биохимические особенности метаболизма представителей M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148, которые можно рассматривать как потенциальные факторы патогенности, объясняющие эпидемиологическую успешность этих штаммов.

В ходе выполнения работы проведено внедрение результатов в практику в виде двух патентов.

Данная работа вносит существенный вклад в фундаментальные исследования особенностей молекулярной организации и функционирования микобактерий. Полученные результаты могут быть использованы в проектах по разработке новых противотуберкулезных вакцин и лекарственных препаратов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Показано, что M. tuberculosis кластер Beijing B0/W148 представляет собой обособленную генетическую группу микобактерий, геном которых содержит 59 уникальных кластер-специфических полиморфизмов и два инвертированных участка.

2. Разработанный протокол экстракции и последующей массспектрометрической идентификации белков микобактерий позволяет достоверно оценить совокупность синтезируемых бактериальных белков и провести сопоставление между отдельными группами штаммов.

3. Показано, что профиль белков, синтезируемых микобактериями кластера Beijing B0/W148, существенно отличается от лабораторного штамма H37Rv, часть этих отличий объясняется отличиями в структуре геномов.

4. Гиперпродукцию ферментов, ответственных за биосинтез длинноцепочечных жирных кислот, можно рассматривать как один из основных факторов вирулентности микобактерий кластера Beijing B0/W148, который наряду с гиперпродукцией белка HsaA способствует повышенной выживаемости этих штаммов в макрофагах.

5. Низкий уровень продукции белка SseA в штаммах микобактерий кластера Beijing B0/W148 возможно приводит к накоплению активных форм кислорода в клетке и, как следствие, повреждению ДНК. Это в свою очередь может вести к образованию широкого спектра генетических вариантов, способствующих выживанию бактериальной клетки под действием селективного отбора, в частности во время лекарственной терапии.

6. Характерные для штаммов микобактерий кластера Beijing B0/W148 изменения в представленности белков DosR регулона свидетельствуют в пользу реализации ими отличного от H37Rv ответа на гипоксию, что также может способствовать лучшей выживаемости внутри макрофагов.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России (Москва, Россия, 2016), а также в ходе ряда международных конференций (4-ая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, Россия, 2014), 6-я Европейская Конференция по Геномике Прокариот и Грибов (Геттинген, Германия, 2015), Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии (XVIII и XIХ Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, Россия, 2015 и 2016), 5ая Интернациональная конференция по Молекулярной Эпидемиологии и Эволюционной генетике Инфекционных Заболеваний (Антверпен, Бельгия, 2016)).

Публикации По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 8 публикаций в трудах научных конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 377 страницах машинописного текста (из которых 216 страниц приложения), содержит 5 приложений, 14 таблиц и 18 рисунков. Состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение и выводы», «Список литературы», который включает 283 источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и их культивирование В исследование включены 10 изолятов M. tuberculosis кластера B0/W148, полученных от пациентов, проходивших лечение в Санкт-Петербургском НИИ Фтизиопульмонологии. Дополнительно использованы лабораторный штамм M.

tuberculosis H37Rv, полученный так же из коллекции Санкт-Петербургского НИИ Фтизиопульмонологии, и штамм M. smegmatis mc2 155, полученный из коллекции Института биохимии им. А.Н. Баха. Штаммы M. tuberculosis культивировали на твердой питательной среде Middlebrook 7H11 (Becton, Dickinson and Company, США) с добавкой OADC (Becton, Dickinson and Company, США) при 35°C 14 -16 дней до плотности 2*10^8 клеток в мл. Штамм M. smegmatis mc2 155 культивировали на плотной питательной среде Middlebrook 7H9 (HiMedia, Индия) с добавкой OADC (HiMedia, Индия) при 37°C и 2 % СО2, 1-2 дня до плотности ±2*10^8 клеток в мл.

Генетический анализ M. tuberculosis Выделение тотальной геномной ДНК проводили по методу (van Embden et al., 1993). Амплификацию тандемных повторов в 24 локусах генома (VNTR-типирование) осуществляли по методике, описанной ранее (Supply et al., 2006). Для амплификации фрагментов генома, участвующих в рекомбинационных событиях, использовали оригинальные праймеры (Shitikov et al., 2014). Амплификацию фрагментов ДНК проводили на приборе DNAEngineTetrad 2 (MJResearch, США) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl pH 9.0; 16.6 мM (NH4)2SO4; 2.5 мM MgCl2, по 250 мкМ каждого дНТФ, 1 ед. Taq-полимеразы (ЛИТЕХ, Россия) и по 10 пмоль соответствующих праймеров. Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом электрофореза в 1 % агарозном геле. Для окраски гелей использовали бромистый этидий.

Нуклеотидные последовательности инвертированных фрагментов генома определяли по методу Сенгера с модификациями (Sanger et al., 1992) с использованием прибора ABIPrism 3730xl Genetic Analyzer (AppliedBiosystems, США; Hitachi, Япония).

Восстановление полноразмерных последовательностей, выравнивание и их сравнительный анализ осуществляли с использованием ContigExprress и AlignX программного пакета Vector NTI 11.0 (Informax Inc, США).

Рестрикционный анализ проводили согласно методике (van Embden et al., 1993) с модификациями. Для гидролиза геномной ДНК использовали рестриктазу MluI (15 ед.) (Thermo Scientific, США). Зонды для анализа по Саузерну были получены с помощью ПЦР с использованием Amersham ECL системы (GE Healthcare, Великобритания) с определенным набором праймеров (Shitikov et al., 2014). Полученные на ECL светочувствительной пленке профили были сканированы и обработаны программным пакетом BioNumerics версия 5.1 (Applied Maths, Бельгия).

Определение полногеномных последовательностей было проведено с использованием высокопроизводительного секвенатора GS FLX + (Roche, США).

Фрагментные библиотеки были получены с использованием коммерческого набора GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit (Roche, США) согласно протоколу фирмыпроизводителя (Rapid Library Preparation Method Manual GS FLX+ Series – XL+,Roche, США). Средний размер библиотек соответствовал 1400–1800 п.о.

Для образца SP21 было дополнительно проводили секвенирование на приборе IonTorrent PGM (LifeTechnologies, США) с использованием двух библиотек парных фрагментов (размеры библиотек 2000–3000 п.о. и 5000–6000 п.о.). Для приготовления библиотек использовали коммерческий набор 5500 SOLiD Mate-Paired Library Construction Kit (Life Technologies, США) в соответствии с протоколом Ion Mate-Paired Library Preparation (Life Technologies Demonstrated Protocol).

Сборку полногеномных последовательностей осуществляли программным пакетом GS de novo assembler v 2.5 (Roche, США). Для оценки перекрытия референсного генома M.

tuberculosis H37Rv использовали программу 454 GS Reference Mapper (Roche, США). Для визуализации результатов выравнивания использовали программу Mauve v 2.3.1.

(http://gel.ahabs.wisc.edu/mauve/).

В исследование включили выборку геномных последовательностей 92 образцов M.

tuberculosis из коллекции key strains и 11 образцов генотипа Beijing, находящихся в открытом доступе в базе данных NCBI.

Поиск однонуклеотидных полиморфизмов проводили на высокопроизводительном вычислительном комплексе Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России» c использованием открытого программного обеспечения, а также разработанных внутри лаборатории скриптов на языке R. Картирование чтений с прибора на референсный геном штамма H37Rv проводили с помощью инструмента bowtie2 (http://bowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml). Анализ данных выравнивания проводили в приложении samtools 0.1.19 (http://samtools.sourceforge.net/). Поиск однонуклеотидных полиморфизмов осуществляли с помощью программы VarScan v 2.3.1 (http://varscan.sourceforge.net).

Для оценки разнообразия образцов M. tuberculosis вычисляли матрицу расстояний Хэмминга на основании однонуклеотидных замен. Построение филогенетических деревьев проводили исходя из полученной матрицы с применением алгоритма Neighborjoining. В качестве внешней группы использовали M. canettii (NC_015848.1).

Функциональный анализ найденных однонуклеотидных полиморфизмов проводили с использованием аннотации генома M. tuberculosis H37Rv из базы данных TubercuList v 2.6 (http://tuberculist.epfl.ch) Протеомный анализ микобактерий Клетки микобактерий отмывали от питательной среды добавлением буфера TrisHCl, PBS + 2 % тритон X-100 (pH 7.5 - 8) с последующим центрифугированием 15 минут при 4500 g (Jungblut et al.,1999).

Для экстракции белка к полученному осадку клеточной культуры добавляли 10 мкл 100 мМ Tris-HCl pH 7.6 и 5 мкл лизоцима (1 мг/мл), инкубировали 30 мин при 4°С.

Дополнительно добавляли 55 мкл 100 мМ Tris-HCl pH 7.6 и 1 мкл смеси ингибиторов протеаз (GE Healthcare, Великобритания). Клетки разрушали на Bead Beater (MPBio, США) с использованием 0.5 мм кремний-циркониевых шариков. Затем к суспензии добавляли 20 мкл 20 % SDS (Sigma Aldrich, США), 10 мкл 1 M ДTT (Sigma Aldrich, США); инкубировали 30 мин при 60°С и центрифугировали при 16000 g в течении 5 минут. Супернатант отбирали и использовали для дальнейшего анализа.

Концентрацию белка в белковых экстрактах определяли по методу Брэдфорда (Bradford et al., 1976) с использованием Bradford Protein Assay Kit (Bio Rad, США).

Одномерный гель-электрофорез проводили в 7.5 % ПААГ согласно методике (Laemmli et al., 1970). Гидролиз белков трипсином проводили в геле согласно методике (Shevchenko et al., 2006). Полученные пептиды подвергали очистке с помощью колонок C18 Sep-Pak (Waters, США) для дальнейшего масс-спектрометирического анализа.

Анализ пептидных фракций проводили на масс-спектрометре TripleTOF 5600 с ионным источником NanoSpray III (ABSciex, Канада), оснащенным нанохроматографической системой разделения NanoLC Ultra 2D+ nano-HPLC (Eksigent, Сингапур). Система высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, англ.

HPLC, High performance liquid chromatography) была настроена в режиме trap-elute.

Образцы пептидных фракций анализировали в IDA-режиме (IDA-mode) работы масс-спектрометра в двух технических повторах. IDA эксперимент состоял из одного обзорного MS скана: время накопления сигнала составляет 250 миллисекунд, отбор масс для фрагментации проводится в диапазоне 300 - 1250 m/z, за которым следует 50 зависимых MS/MS сканов. Ионы для MS/MS анализа отбираются на основе интенсивности измеряемого сигнала при превышении порога в 200 cps и при зарядовом состоянии от 2 до 5.

Мониторинг множественных реакций (MRM анализ) осуществляли на массспектрометре ABSciex QTRAP 4500 с ионным источником NanoSpray III (ABSciex, Канада), оснащенным нанохроматографической системой разделения Ekspert NanoLC 425 (Eksigent, Сингапур).

Параметры МRМ анализа для анализируемого пептида были оптимизированы в процессе прямого ввода раствора пептида в источник ионизации:

родительский ион m/z 494.8 (z = +2), потенциал декластеризации 150 В, время накопления сигнала для каждого фрагмента 100 мс, m/z фрагментных ионов (энергия столкновительной диссоциации, В): 745.5 (20), 648.4 (22), 549.3 (20), 450.2 (19), 433.2 (29), 580.3 (26).

Идентификацию пептидов проводили программными пакетами ProteinPilot v 4.5 (ABSciex, Канада) и Mascot v 2.2.07 (Matrix Science, Великобритания) Первичную квантификацию пептидов/белков проводили программным пакетом OpenMS v 1.10 (OpenMS, США), для проведения количественного анализа использовали программу Progenesis LC-MS (Nonlinear Dynamics, США). Анализ и обработку результатов MRM эксперимента проводили программным пакетом SkyLine v 2.6 (MacCossLab, США).

Локализацию идентифицированных белков из клеток M. smegmatis и M. tuberculosis устанавливали согласно базе данных PSORTdb (http://db.psort.org/browse/genome?id=13549). Аннотацию по генной онтологии (Gene Onthology, GO) загружали из базы данных uniprot (http://www.uniprot.org/).

Функциональную аннотацию M. tuberculosis H37Rv получали из базы данных TubercuList v 2.6 (http://tuberculist.epfl.ch/).

Для характеристики дифференциальных белков проводили анализ обогащения GO с использованием пакета TopGO для языка программирования R. Для оценки достоверности обогащения использовали точный тест Фишера. Белки, относящиеся к обогащенным GO категориям, классифицировали с помощью PANTHER (http://pantherdb.org/).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование экспериментальных групп штаммов и геномных последовательностей Исследование проведено на клинических изолятах M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148, лабораторном штамме M. tuberculosis H37Rv и M.

smegmatis mc2 155.

В экспериментальную группу вошли 10 изолятов M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148. Принадлежность изолятов M. tuberculosis к кластеру определена методом VNTR анализа и методом ПЦР по (Mokrousov et al., 2012). Все изоляты кластера прошли обязательную процедуру установления профиля лекарственной чувствительности к препаратам первой (стрептомицин, рифампицин, изониазид и этамбутол) и второй (офлоксацин, амикацин, канамицин, капреомицин, этионамид и пиразинамид) линии противотуберкулезной терапии согласно приказу МЗ РФ № 109 от 23.03.2003 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». По данным бактериологического тестирования один образец был идентифицирован как чувствительный, 3 – с множественной лекарственной устойчивостью (устойчивые, как минимум, к рифампицину и изониазиду), 6 – с широкой лекарственной устойчивостью (устойчивые к изониазиду и рифампицину, одному из фторхинолонов, и, по крайней мере, к одному из трех инъекционных препаратов второго ряда – канамицину, капреомицину или амикацину).

В референсную группу образцов для всех экспериментов включен штамм M. tuberculosis H37Rv. Выбор референсного штамма был обусловлен тем, что на сегодняшний день H37Rv является наиболее изученным штаммом M. tuberculosis, в свободном доступе имеется как полный геном, так и максимально полный протеом данного штамма. В качестве тест-культуры для апробации методов выделения белка в работу был включен штамм M.

smegmatis mc2 155.

Геномные последовательности 92 образцов коллекции key strains и 11 образцов генотипа Beijing были выгружены и использованы для построения филогенетического дерева и определения Beijing B0/W148 кластерспецифических полиморфизмов.

Генетические особенности кластера BeijingB0/W148 Для всестороннего анализа генетических особенностей представителей кластера Beijing B0/W148 было проведено полногеномное секвенирование 10 образцов. В ходе первичного анализа был установлен большой процент гомологии геномов с референсным штаммом H37Rv (99.9 %), что согласуется с данными мировой литературы (Sreevatsan et al., 1997;

Fleischmann et al., 2002). При этом количество однонуклеотидных полиморфизмов между геномами изучаемых штаммов и H37Rv составило 1500 (среднее плюс/минус) (в среднем 3 SNPs на 10 т.п.о.). Последнее в полной мере характеризует объект исследования как генетически мономорфный организм. При попарном сравнении геномы Beijing B0/W148 отличались друг от друга не более чем на 25 полиморфизмов, что говорит о недавней экспансии представителей изучаемого кластера и согласуется с другими исследованиями (Merker et al., 2015; Mokrousov 2013).

Для оценки разнообразия секвенированных образцов, определения основных филогенетических маркеров и дальнейшего поиска кластерспецифических полиморфизмов был использован филогенетический анализ.

В ходе анализа установлено, что геномы изучаемых образцов относятся к генетическому семейству Beijing и кластеризуются еще с одним представителем данного семейства: образцом W-148, представленным в базе данных GenBank в виде полного генома (CP012090.1). Таким образом, результаты филогенетического анализа показали полную сходимость с результатами первичного генетического анализа, а также указали на родство изучаемых штаммов со штаммом M. tuberculosis W-148.

В целом же стоит отметить, что штаммы кластера Beijing B0/W148 несли общие для линии Beijing филогенетические маркеры, которые представлены в Таблице 1. Так же более детальное изучение полиморфизмов геномов дало возможность определить, что штаммы Beijing B0/W148 относятся к линии «современных» Beijing, характеризуются секвенс-типом ST10 по (Filliol et al., 2006), относятся к группе 3 по (Gagneux et al., 2006), секвенс-типу BST19 по (Schurch et al., 2011), группе 2 по (Tsolaki et al., 2005) и lineage 2.2.1 по (Coll et al., 2014). Представленные нами данные впервые получены для Beijing B0/W148, однако они не позволили дифференцировать представителей кластера от других штаммов Beijing, встречаемых по всему миру. В связи с этим был произведен поиск уникальных кластерспецифических полиморфизмов, которые могут служить основой для дальнейших прицельных исследований, а также создания систем генетического мониторинга указанного семейства. Методами сравнительной геномики было выявлено 59 полиморфизмов, которые совпали с аналогичным исследованием по поиску B0/W148 – специфических мутаций (Merker et al., 2015).

Таблица 1. Молекулярные маркеры исследуемых образцов Сполиготип PGG SCG SNP SNP Образец (Brudey et (Sreevatsan (Filliol et (Baker et (Hershberg al.

, 2006) et al., 1997) al., 2006) al., 2004) et al., 2008) Главная ВосточноSP1, SP7, SP10, SP13, генетическая Кластер 2 Линия 1 Азиатская SP21, SP22, SP23, Beijing группа 1 линия SP27, SP45, SP54 Стоит отметить, что в настоящем исследовании была выявлена делеция в гене kdpD (c.2541_2542delCA), ведущая к сдвигу рамки считывания.

Последнее, в свою очередь, приводит к образованию единой открытой рамки считывания двух генов kdpDE (Рисунок 1). Данная мутация является кластерспецифической для Beijing B0/W148 и в последнее время в мировом сообществе ей уделяют достаточно пристальное внимание, ассоциируя с вирулентностью (Merker et al., 2015).

Рисунок 1. Образование единой открытой рамки считывания для генов kdpD и kdpE.

Рассмотрев особенности представителей кластера Beijing B0/W148 на уровне однонуклеотидных полиморфизмов, следующей задачей было определение структурной организации генома. Как отмечалось ранее, в ходе филогенетического анализа было установлено сходство секвенированных штаммов кластера со штаммом W-148, представленным в GenBank (CP012090.1). Выравнивание геномов W-148 и H37Rv показало наличие двух больших инверсий в геноме W-148, которые впоследствии были подтверждены для всех представителей кластера. Дополнительно инверсии подтвердили секвенированием границ повторов и постановкой специфического RFLP анализа (Рисунок 2).

Рисунок 2. Схематическое изображение перестроек в геноме W-148 относительно H37Rv и представление стратегии RFLP анализа.

Римскими цифрами I - V обозначены коллинеарные блоки. Вертикальными линиями отмечены сайты узнавания для рестриктазы MluI. Ожидаемые длины рестрикционных фрагментов представлены между вертикальными линиями.

ДНК зонды для гибридизации отмечены буквами А - Н.

Первый инвертированный участок (блок II) затрагивал 559 т.п.о. и располагался межу генами Rv0609a и Rv1135c. Второй инвертированный участок (блок IV) распространялся на 339 т.п.о. и затрагивал последовательность геномной ДНК между генами Rv3019c и Rv3327. Следует отметить, что такие масштабные рекомбинационные события в геноме микобактерий крайне редки и в мировой литературе описаны только два таких случая. Однако они заключались в дупликации отдельных сегментов хромосомы (Weiner et al., 2012; Domenech et al., 2010). Интересным моментом является тот факт, что в большинстве случаев дупликации происходили между сонаправленными копиями повтора IS6110. В нашем случае инвертированные участки располагались между разнонаправленными копиями того же повторяющегося элемента. Согласно работе Weiner с соавт.

граница дуплицированного участка для одного из образцов находилась в области гена Rv3327, что соответствует границе одного из инвертированных участков, описанного в представленном исследовании (Weiner et al., 2012).

Стоит отметить, что данный регион так же соответствует RvD5 в геноме H37Rv.

Обобщая приведенную информацию можно сделать предположение, что данная область генома не стабильна, и произошедшие перестройки могут отражать происходящую эволюцию топологии хромосомной ДНК.

Принимая во внимание выявленные рекомбинационные события, а также возможные дупликации геномной ДНК, было проведено дополнительное полногеномное секвенирование M. tuberculosis штамма SP21 с последующим анализом генома и сопоставлением с результатами IS6110 RFLP типирования.

Согласно RFLP анализу штаммы кластера Beijing B0/W148 несут 17 бэндов, соответствующих 17 копиям повторяющегося элемента IS6110 (Рисунок 3). В ходе анализа геномов образцов SP21 и W-148 была выявлена 21 копия элемента. Такое различие количества выявляемых копий IS6110 связано с «маскированием» повторов и описано в мировой литературе (McEvoy et al., 2007). В представленном случае повторы 4 и 5, а также с 11 по 15 имеют схожие длины рестрикционных фрагментов и тем самым становятся неразличимы в ходе RFLP анализа. При этом особое внимание заслуживают повторы 1, 2, 3, 14 и 20 (Рисунок 3). Повтор 1 был изучен в работе Мокроусова с соавт. и расположен между генами TBPG_002546 и TBPG_002549 штамма W-148 (Rv2664 и Rv2665 по H37Rv). Данный повтор может быть использован для типирования штаммов кластера, так как образуемый им рестрикционный фрагмент уникален и не встречается у представителей других генотипов (Mokrousov et al., 2012). Повтор 20 располагается в так называемом NTF регионе и характеризует штаммы Beijing как «современные». В свою очередь повторы 2, 3 и 14 являются границами инвертированных участков. При этом повторы 3 и 14 были выявлены на границах инвертированных участков между блоками III - IV и II

- III, соответственно. Повтор 2 имел усеченную форму и располагался между блоками I и IV. Вторая часть усеченного повтора была выявлена между блоками II и V, однако она не представлена на рисунке 3, так как эта часть не содержит последовательности, комплементарной зонду, используемому для RLFP анализа.

Рисунок 3. Позиционирование повторяющегося элемента IS6110 в геноме штамма W-148.

Позиции повторяющегося элемента, расчет длин рестрикционных фрагментов и названия генов приведены в соответствии с геномом штамма W-148 (CP012090v1).

Отработка протокола экстракции белка из клеток микобактерий Протокол протеомного анализа микобактерий отработан на культуре M.

smegmatis. Выбор непатогенного штамма M. smegmatis mc2 155 был продиктован легкостью его культивирования в условиях in vitro и возможностью сопоставления получаемых данных протеомного профилирования с опубликованными ранее результатами для оценки эффективности отрабатываемых методик. Для анализа протеома микобактерий была выбрана так называемая стратегия «shotgun», предполагающая получение полного пептидного гидролизата общего пула белков с его последующим многомерным фракционированием и идентификацией отдельных пептидов методом тандемной массспектрометрии.

Исходя из поставленных задач, нами протестированы три способа смыва клеток M. smegmatis со среды культивирования. Первый способ согласно (Blackwood et al., 2005) заключался в добавлении раствора 1 % Tween-80 (Sigma Aldrich, США) с последующим центрифугированием. После использования данного способа отмывки осадок клеток оставался вязким и не поддавался дальнейшему анализу. Было сделано предположение, что в отношении микобактерий недостаточно эффективен детергент Tween-80. В связи с этим был протестирован следующий способ по AfCS Solution Protocol (Protocol ID: PS00000603), включающий 1 % тритон X-100 (Sigma Aldrich, США). Данный способ оказался значительно лучше, согласно визуальной оценке консистенции осадка. Однако некоторая вязкость сохранялась. Далее был опробован третий способ согласно (Jungblut et al., 1999) включающий раствор 2 % тритон X-100 и дополнительно Tris-HCl. Таким образом, основываясь на визуальной оценке цвета и консистенции получаемого бактериального осадка, наиболее эффективным был признан последний метод, который использовался нами в последующих экспериментах.

Для отработки протокола экстракции белка суспензию клеток в отмывочном буфере нормировали по мутности. В каждый эксперимент брали приблизительно 10^10 клеток. Апробированы пять различных методов экстракции общего белка из микобактериальных клеток.

Каждый метод включал в себя уникальный состав лизирующего буфера и непосредственно способ разрушения клеток. Так основным компонентом лизирующего буфера в первом методе был 0.75 % раствор RapiGest SF (Waters, США). В лизирующих буферах остальных четырех методов использовали различные концентрации ДТТ (Sigma Aldrich, США) и SDS (Sigma Aldrich, США) в сочетании с ингибиторами протеаз (GE Healthcare, США) и/или нуклеазами (ДНКаза + РНКаза, Promega, США). Клетки разрушали на Bead Beater (MPBio, США) и ультразвуковом гомогенизаторе (И100-6/840, ИНЛАБ, Россия). В ходе экспериментов для обеих систем были апробированы различные условия разрушения клеток.

Согласно полученным данным, наибольший выход белка наблюдали при использовании для экстракции реагента RapiGest SF (Waters, США) либо лизирующего буфера, содержащего 20 % SDS, 1 M ДTT и ингибиторы протеаз в Tris-HCl. Несмотря на то, что во втором случае экстрагируется достоверно больше общего белка, чем в первом (р = 0.0006), для дальнейшего анализа использовали белковые экстракты, полученные с использованием обоих методов.

Так же апробировано несколько методов триптического расщепления белков. Так, для белков, экстрагированных с использованием реагента RapiGest SF (Waters, США), гидролиз трипсином проводили согласно описанной методике (Vowinckel et al., 2013). Белки, экстрагированные вторым способом, подвергли гидролизу трипсином в растворе по методу FASP (Vowinckel et al., 2013) и в геле согласно (Shevchenko et al., 2006).

Хромато-масс-спектрометрический анализ был осуществлен для пептидных фракций, подготовленных по описанным выше протоколам, с использованием масс-спектрометра TripleTOF 5600 с ионным источником NanoSpray III (ABSciex, Канада), оснащенным нанохроматографической системой разделения NanoLC Ultra 2D+ nano-HPLC (Eksigent, Сингапур).

Сравнительный анализ списков идентифицированных белков установил, что три биологических и два технических повтора являются минимально достаточными для описания протеома микобактерий. Наиболее полно спектр белков представлен в образцах, прошедших экстракцию в лизирующем буфере, содержащем лизоцим и ингибиторы протеаз в Tris-HCl, с последующим гидролизом трипсином в геле. В общей сложности хроматомасс-спектрометрический анализ триптических пептидов позволил идентифицировать 3937 белков M. smegmatis, что сопоставимо с опубликованными ранее данными (Chopra et al., 2014).

Протеомные особенности изолятов M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148 По разработанному в настоящем исследовании протоколу проведен сравнительный протеомный анализ штаммов кластера Beijing B0/W148 и штамма H37Rv. В общей сложности идентифицировано 1868 белков для штаммов кластера B0/W148 и 1560 белков штамма H37Rv. Накопленные данные масс-спектрометрических измерений депонированы в специализированную мировую базу данных «PRoteomics IDEntifications database» (PRIDE) (http://www.ebi.ac.uk/pride).

Идентифицированным белкам были приписаны клеточная локализация (согласно PSORTdb v 3.0) и функциональная категория (согласно TubercuList v 2.6). Анализ полученных данных свидетельствует о равномерном распределении белков по всем категориям, на основании чего можно сделать заключение, что применяемые методы протеомного анализа оптимальны как для лабораторного штамма H37Rv, так и клинических изолятов кластера Beijing B0/W148 (Рисунок 4).

Рисунок 4. Функциональное распределение идентифицированных белков.

Белки, идентифицированные для штамма H37Rv (синий столбец), для штаммов кластера Beijing B0/W148 (красный столбец) и все аннотированные согласно базе данных (зеленый столбец) были распределены: А. по функциональным категориям в соответствии с TubercuList v 2.6 (http://tuberculist.epfl.ch); Б. в соответствии с их локализацией по данным PSORTdb v 3.0 (http://db.psort.org/) Для проведения сравнительного анализа белковых профилей штаммов кластера В0/W148 и H37Rv, полученные нами данные были расширены списком белков, идентифицированных для H37Rv (Schubert et al., 2013).

Среди спектра идентифицированных белков были обнаружены группы (n = 17), которые встречались исключительно среди штаммов кластера Beijing B0/W148. Так же была обнаружена группа белков (n = 57), встречающихся исключительно в штаммах H37Rv.

Для определения представленности белков, идентифицированных в штаммах Beijing B0/W148 и H37Rv, была использована программа Progenesis LC-MS. Данный анализ был ограничен 1016 белками, присутствующими во всех штаммах кластера Beijing B0/W148 и H37Rv. В общей сложности было выявлено 192 достоверно различающихся белка (p 0.05). Из них, 24 белка были высокопредставленные в штаммах кластера Beijing B0/W148 и 168 были низкопредставленные.

Далее результаты количественного анализа и массспектрометрического профилирования были сопоставлены для выявления возможного общего эффекта дифференциальных белков на функционирование микробной клетки. Белки, идентифицированные только в штаммах кластера, были отнесены в группу высокопредставленных. В свою очередь белки, отсутствующие в штаммах кластера были отнесены в группу низкопредставленных белков. Таким образом, первая группа включала 41 белок, а вторая 225.

Для оценки возможного физиологического эффекта найденных различий были использованы два независимых подхода. Так, нами был проведен Gene Ontology (GO) анализ с обогащением для распределения изучаемых белков (n = 266) по трем категориям: «Молекулярные функции», «Биологические процессы» и «Клеточные компоненты». При этом распределение белков внутри категории «Биологические процессы», на наш взгляд, является наиболее показательным. Соответственно, при более детальном анализе данной категории, мы обнаружили, что большинство дифференциальных белков (33/266, 12.4 %) принадлежат к категории «Метаболические процессы» (GO: 008152). Углубленный анализ высокопредставленных белков (4/41, 9.8 %) показал обогащение категории «Липидный метаболический процесс» (GO: 0006629).

В свою очередь низкопредставленные белки относительно равномерно были распределены по следующим категориям: липидный (GO: 0006629), аминокислотный (GO:

0006520) и углеводный (GO: 0005975) метаболические процессы.

Следует отметить, что GO анализ позволяет дифференцировать белки по функциональным группам, не учитывая возможные взаимосвязанные изменения в бактериальной клетке. Зная, что прокариотические гены и опероны имеют регулонную организацию, было выдвинуто предположение, что белки, контролируемые одним транскрипционным фактором (ТФ), будут объединяться в «однонаправленно изменяющиеся» группы. Для проверки данного предположения, а так же оценки эффектов белковых взаимодействий 266 дифференциальных белков были проанализированы с использованием генной регуляторной сети, включающей 65 транскрипционных факторов и регулируемые ими 431 ген (Galagan et al., 2013). Полученные результаты визуализированы с помощью программы Cytoscape v 2.8.3. Пять белков из группы наиболее представленных и 38 из группы наименее представленных белков были идентифицированы на данной сети. Далее мы сфокусировали свое внимание на рассмотрении наиболее обширных групп совместно регулируемых белков (Рисунок 5). Данный анализ выявил 24 гена, находящихся под регуляцией 5 ТФ, среди которых ТФ Rv3133c, Rv1049 и Rv0081 обладали наиболее обширными связями. Стоит отметить, что Rv3133c является основным членом DosR регулона и ассоциирован с 8 низкопредставленными белками: Rv1997, Rv2004c, Rv2005c, Rv2029c, Rv2623, Rv2626c, Rv3130c и Rv3131 (Рисунок 5 А). Данная система хорошо описана для микобактерий туберкулеза; в штамме H37Rv она индуцируется в ответ на ингибирование аэробного дыхания: гипоксию, NO или CO. В связи с этим мы решили более подробно рассмотреть все белки DosR системы.

Согласно литературным данным, регулон состоит из 52 генов и гистидинкиназы dosT. Всего нами было идентифицировано 33 из 53 (62 %) белков данного регулона, при этом 11 из них были низкопредставлены в штаммах кластера Beijing B0/W148. Согласно литературным данным известно, что во время экспоненциальной фазы роста уровень транскриптов DosR системы в штаммах кластера Beijing B0/W148 значительно выше, чем в H37Rv (Domenech et al., 2010; Fallow et al., 2010). Однако, Badillo-Lpez с соавт. показали, что во время гипоксии, наоборот, уровень DosR существенно ниже в штаммах семейства Beijing по сравнению с H37Rv (Badillo-Lopez et al., 2010). Возможно, это объясняется тем, что штаммы данного семейства реализуют иной ответ на гипоксический стресс, нежели штаммы H37Rv. В нашем случае мы наблюдали низкую представленность DosR-регулируемых белков в штаммах кластера Beijing B0/W148 в стационарной фазе роста. Мы предполагаем, что данный факт может быть связан с преадаптацией бактериальных клеток к возможной нехватке кислорода в связи с длительным культивированием in vitro.

Рисунок 5. Фрагмент регуляторной сети M.

tuberculosis. Овалами обозначены транскрипционные факторы, прямоугольниками - регулируемыми ими гены.

Желтым цветом обозначены гены, кодирующие низкопредставленные белки в штаммах кластера Beijing B0/W148. А. Группа генов (=белков), находящихся под регуляцией DosR (Rv3133c). Б. Группа генов (=белков), находящихся под регуляцией Rv0081.

Другим интересным белком является транскрипционный фактор Rv0081, отсутствующий в штаммах кластера Beijing В0/W148 и входящий в DosR регулон. Ранее этот белок был описан как «regulator hub» при ответе клетки на гипоксию (Galagan et al., 2013). Согласно регуляторной сети Rv0081 совместно с Rv1049 регулирует mce1 оперон, состоящий из 6 генов mce (Rv0169-Rv0174), двух генов yrbE (Rv0167, Rv0168) и четырех генов mceассоциированных (Rv0175-Rv0178). В нашей работе было выявлено, что 4 белка Mce (Rv0169, Rv0170, Rv0172, и Rv0174), и один белок Mceассоциированный (Rv0176) низкопредставлены в штаммах кластера Beijing B0/W148 (Рисунок 5 Б). Белки, кодируемые mce1 опероном, относятся к группе ABC транспортеров и вовлечены в транспорт фосфолипидов. Было показано, что делеция данного оперона ведет к формированию гипервирулентного фенотипа.

Согласно работе de Keijzer с соавт. представители «современной»

линии Beijing отличаются от «древней» высокой представленностью белков Rv0450c и Rv3137, а также низкой представленностью белков Rv1269c и Rv3283 (de Keijzer et al., 2014). В нашем исследовании представленность белка Rv3283 (SseA) так же была значительно ниже в штаммах Beijing B0/W148 по сравнению с H37Rv, что согласуется с данными о принадлежности кластера к «современной» линии семейства Beijing (Mokrousov, 2013). Известно, что данный белок (Rv3283) является тиолоксидоредуктазой и совместно с ферментом детоксикации супероксидных радикалов SodA (Rv3846) и мембранным интегральным белком DoxX (Rv3005c) формирует мембран-ассоциированный оксидоредуктазный комплекс. Потеря любого компонента данного комплекса ведет к нарушению переработки микотиола, являющегося аналогом глутатиона в клетках M.

tuberculosis. Сниженная представленность белка Rv3283 (SseA) в штаммах Beijing B0/W148 может приводить к накоплению повреждений в клетке, вызванных активными формами кислорода.

Для валидации полученных протеомных данных использован метод мониторинга множественных реакций.

Был сформирован тестовый набор из 40 белков, включающий 35 дифференциальных белков и 5 не идентифицированных. Для проведения анализа использовали пул штаммов кластера Beijing B0/W148 (7 образцов в 3х биологических повторах) и штамма H37Rv (1 штамм в 3х биологических повторах). В ходе анализа 31 белок из 40 были идентифицированы с помощью 2 - 11 пептидов. Остальные 9 белков контролировались с помощью одного пептида из-за ограниченности успешного MRM анализа для других триптических пептидов внутри этих белков. Результаты для всех 35 дифференциальных белков совпали с полученными ранее. Так, удалось подтвердить изменения в представленности наиболее значимых дифференциальных белков, в том числе белков DosR регулона.

Сравнительный анализ геномных и протеомных данных Для сопоставления геномных и протеомных данных использовались данные полногеномного секвенирования пяти штаммов кластера Beijing B0/W148. В ходе анализа были выявлены геномные изменения в 8 из 17 белков, характерных только для штаммов кластера Beijing B0/W148 и отсутствующих в H37Rv. Так, в штаммах H37Rv промоторные области генов Rv2277c, Rv2475c и Rv3323c содержали вставку IS6110. В то время как в штаммах Beijing B0/W148 она отсутствовала, что возможно сказывается на синтезе соответствующих белков. Так же в геноме H37Rv, в промоторной область гена Rv2974c было выявлено три CG повтора, в геноме Beijing B0/W148 только два таких повтора. Дополнительно для Beijing B0/W148 в промоторной области гена Rv0976c была выявлена вставка одного нуклеотида и несинонимичные замены SNPs (nsSNPs) в кодирующих областях генов Rv0945, Rv1319c и Rv2351.

В ходе проведенного GO анализа мы обратили внимание на распределение белков в категории «Транспортная активность» (GO:0005215).

Данная категория была обогащена тремя высокопредставленными белками и 15 низкопредставленными, из которых пять относились к АВС транспортерам. Низкопредставленные белки PstB и PstS1 входят в состав одного оперона и участвуют в импорте фосфатов во время голодания, характерного для клеток, находящихся внутри фагосомы. Другой белок, CtpF, относится к P-типу АТФаз и является предполагаемым транспортером катионов щелочных и щелочноземельных металлов. Стоит отметить, что данный белок не был обнаружен в штаммах кластера Beijing B0/W148, и согласно геномным данным, ген ctpF содержит делецию (Rv1997: 2241032 delG), приводящую к сдвигу рамки считывания.

В своем анализе мы так же обратили внимание на белки эффлюксной системы (Rv0341, Rv2688c, Rv3728), которые ранее были идентифицированы только в штаммах семейства Beijing (de Keijzer et al., 2014). Согласно нашим данным белок Rv0341 был обнаружен во всех изучаемых штаммах, в том числе и в H37Rv и не показал различий в степени его представленности, в то время как белки Rv2688 и Rv3728 не были идентифицированы вовсе. Стоит так же отметить, что ген Rv3728 содержит B0/W148-специфическую мутацию, ведущую к образованию стоп кодона, что объясняет отсутствие данного белка в штаммах кластера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Mycobacterium tuberculosis – возбудитель туберкулеза, инфекционного заболевания, характеризующегося различной локализацией и клиническими проявлениями с тенденцией к хроническому и рецидивирующему течению.

Со времени описания патогена Робертом Кохом прошло уже более 130 лет, однако заболевание до сих пор остается глобальной проблемой здравоохранения. Специфичность строения мощной гидрофобной стенки, переключение метаболизма из латентного состояния в активное и высокая степень адаптации к иммунной системе макроорганизма делает M.

tuberculosis невероятно успешным патогеном. Дополнительно ситуацию осложняет глобальное распространение штаммов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, а так же отдельных наиболее «успешных» клонов. Наиболее интересным в этой связи являет системный подход к изучению описанных выше проблем. Триггером к этому послужило значительное совершенствование технологий в последние десятилетия, что привело к возникновению новых разделов молекулярной биологии, таких как геномика, транскриптомика и протеомика, позволяющих изучать микроорганизмы на различных биологических уровнях.

В данном исследовании объектом системного подхода, включающего методы геномного и протеомного анализа, выбрана очень узкая группа микобактерий – кластер Beijing B0/W148, представляющая интерес, как с эпидемиологической, так и клинической точек зрения. Приложение технологии полногеномного секвенирования позволило охарактеризовать совокупность кластер-специфических мутаций, которые можно рассматривать как специализированные маркеры для мониторинга распространения данных изолятов. Кроме того, нами описана уникальная геномная перестройка, характерная исключительно для этой группы. Стоит отметить, что это первый в мире случай регистрации и экспериментального подтверждения рекомбинационных событий для современных штаммов M.

tuberculosis.

Проведенный сравнительный протеомный анализ штаммов кластера Beijing B0/W148 указал на ряд изменений в их белковом профиле относительно H37Rv. Системный анализ наблюдаемых отличий в представленности 266 дифференциальных белков (41 высоко- и 225 низкопредставленных) позволил предположить молекулярные механизмы известных физиологических особенностей исследуемой группы штаммов – повышенная выживаемость в макрофагах, крайне высокая встречаемость в группе лекарственноустойчивых штаммов. В частности, мы наблюдали увеличение представленности ферментов, ответственных за биосинтез длинноцепочечных жирных кислот, наряду со снижением представленности белков, ответственных за их деградацию. Микобактерии используют длинноцепочечные жирные кислоты для получения микотиоловых кислот и различных липидов, которые рассматривают как основные факторы вирулентности M. tuberculosis, проявляющиеся на начальных стадиях инфекции, когда бактерии попадают в макрофаг. Мы так же отметили увеличение представленности белка HsaA, вовлеченного в деградацию стероидов. Было показано, что M. tuberculosis используют внеклеточный холестерин в качестве источника энергии и для биосинтеза липидов клеточной стенки. Указанные наблюдения могут свидетельствовать в пользу повышенной выживаемости микобактерий в макрофагах, что является известной характеристикой штаммов кластера Beijing B0/W148. Кроме того, на основании протеомных данных нами зафиксирован очень низкий уровень белка SseA в штаммах B0/W148, что возможно приводит к накоплению активных форм кислорода в клетке и, как следствие, повреждению ДНК. Это в свою очередь может вести к образованию широкого спектра генетических вариантов, способствующих выживанию бактериальной клетки под действием селективного отбора, в частности во время лекарственной терапии.

Таким образом, анализ совокупно накопленной геномной и протеомной информации приближает нас к пониманию молекулярных механизмов адаптации M. tuberculosis. Представленные данные имеют несомненную научную ценность, как в решении прикладных задач, связанных с поиском новых средств элиминации возбудителя, так и фундаментальных, касающихся расширения знаний о физиологии и клеточной организации микобактерий.

В ходе выполнения работы проведено внедрение результатов в практику в виде двух патентов: 1. Патент на изобретение №2551764 (Ильина Е. Н., Шитиков Е. А., Беспятых Ю. А., Способ обнаружения микобактерий туберкулеза генетического кластера Beijing B0/W148). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 23.04.2015. Приоритет: 04.07.2013 и 2. Патент на изобретение №2548797 (Ильина Е. Н., Шитиков Е. А., Беспятых Ю. А., Способ одновременной амплификации и флуоресцентного маркирования нескольких сегментов генома микобактерий туберкулезного комплекса). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 24.03.2015. Приоритет: 04.07.2013.

ВЫВОДЫ

1. Кластер Beijing B0/W148 представляет обособленную генетическую группу микобактерий, которая характеризуется 59 кластер-специфическими полиморфизмами и двумя инвертированными участками в структуре генома.

2. Разработанный протокол экстракции и последующей массспектрометрической идентификации белков микобактерий позволяет получать данные мирового уровня, пригодные для характеристики протеома.

3. Впервые описанный протеомный профиль M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148 существенно отличается от H37Rv, часть этих отличий согласуется с отличиями в структуре их геномов.

4. Изменения в представленности белков DosR регулона свидетельствуют о реализации штаммами M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148 отличного от H37Rv ответа на гипоксию, что предположительно способствует их выживаемости внутри макрофагов.

5. Зафиксированы изменения в ферментах метаболизма липидов и белках транспортных систем представителей M. tuberculosis кластера Beijing B0/W148, которые можно рассматривать как потенциальные факторы патогенности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Беспятых Ю. А., Шитиков Е. А., Зименков Д. В., Кулагина Е. В., Грядунов 1.

Д. А., Носова Е. Ю., Букатина А. А., Шульгина М. В., Журавлев В. Ю., Ильина Е. Н.

Определение лекарственной устойчивости и генотипирование клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis экспериментальным набором «ТБ-ТЕСТ» // Пульмонология. – 2013. – N 4. – С.77-81 Зименков Д. В., Кулагина Е. В., Антонова О. В., Суржиков С. А., Беспятых 2.

Ю. А., Шитиков Е. А., Ильина Е. Н., Михайлович В. М., Заседателев А. С., Грядунов Д. А.

Анализ генетических детерминант множественной и широкой лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза с использованием олигонуклеотидного микрочипа // Молекулярная биология. – 2014. – Т. 48. – № 2. – С. 251-264

3. Bespyatykh J. A., Shitikov E. A., Ilina E. N., Govorun V. M., Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Lapa S. A., Gryadunov D. A. Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis complex isolates using hydrogel oligonucleotide microarrays // Infection, Genetics and Evolution. – 2014. – Т. 26. – С. 41-46

4. Shitikov E. A., Bespyatykh J. A., Ischenko D. S., Alexeev D. G., Karpova I. Y., Kostryukova E. S., Isaeva Y. D., Nosova E. Y., Mokrousov I. V., Vyazovaya A. A., Narvskaya O. V., Vishnevsky B. I., Otten T. F., Zhuravlev V. Y., Yablonsky P. K., Govorun V. M Unusual Large-Scale Chromosomal Rearrangements in Mycobacterium tuberculosis Beijing B0/W148 Cluster Isolates // PLOS ONE. – 2014. – V. 9 (1). – P. e84971

5. Bespyatykh J., Shitikov E., Butenko I., Altukhov I., Alexeev D., Mokrousov I., Dogonadze M., Zhuravlev V., Yablonsky P., Ilina E., Govorun V. Proteome analysis of the Mycobacterium tuberculosis Beijing B0/W148 cluster // Scientific Reports. – 2016. – V. 6. – P. 10.1038/srep28985.

Материалы трудов конференций

6. Беспятых Ю. А., Шитиков Е. А., Побегуц О. В., Ковальчук С. И., Алтухов И. А., Ильина Е. Н. Отработка протокола количественного протеомного анализа бактерий рода Mycobacterium // POSTGENOME. 2014, Казань, Россия – Сборник тезисов. – 2014. – C.

7. Ильина Е. Н., Шитиков Е. А., Беспятых Ю. А., Ищенко Д. С., Вязовая А. А., Мокроусов И. В., Шульгина М. В., Журавлев В. Ю. Геномная вариабельность эндемичных для России клинических штаммов M. tuberculosis // POSTGENOME. 2014, Казань, Россия.

– 2014. – C. 11

8. Шитиков Е.А., Беспятых Ю.А., Ищенко Д.С., Журавлев В.Ю., Яблонский П.К., Вязовая А.А., Мокроусов И.В., Нарвская О.В., Ильина Е.Н. Генетические особенности представителей Mycobacterium tuberculosis Bejing B0/W148 кластера // 2014, СанктПетербург, Россия. – Инфекция и Иммунитет. – 2014. – Т134. – С. 121-122

9. Беспятых Ю. А., Шитиков Е. А., Алтухов И. А., Бутенко И. О., Алексеев Д. Г., Мельникова Н. Н., Журавлев В. Ю., Яблонский П. К., Ильина Е.Н.. Особенности протеома микобактерий кластера Beijing B0/W148 в условиях in vitro культивирования // XVIII Кашкинские чтения, 2015. Санкт-Петербург, Россия. – Проблемы медицинской микологии. – 2015. – Т17 №2. – С. 46

10. Беспятых Ю. А., Шитиков Е. А., Алтухов И. А., Бутенко И. О., Алексеев Д. Г., Ильина Е. Н. Особенности протеома микобактерий кластера Beijing B0/W148 // Итоговая научно-практическая конференция ФНКЦ ФХМ ФМБА России, 2015. Москва, Россия. – Сборник тезисов. – 2015. – С 1.

11. Bespyatykh J., Shitikov E., Altukhov I., Butenko I., Alexeev D., Melnikova N., Zhuravlev V., Ilina E. Quantitative proteomic analysis of M. tuberculosis cluster Beijing B0/W148 strains // ProkaGenomics, 2015. Геттинген, Германия. – Сборник тезисов. – 2015.

– P. 117

12. Беспятых Ю. А., Шитиков Е. А., Алтухов И. А., Бутенко И. О., Мельникова Н.

Н., Журавлев В. Ю., Ильина Е. Н. Молекулярные механизмы "успешности" штаммов Mycobacterium tuberculosis кластера Beijing B0/W148 // XIХ Кашкинские чтения, 2016.

Санкт-Петербург, Россия. – Проблемы медицинской микологии. – 2016. – Т18 №2. – С.

13. Bespyatykh J., Shitikov E., Altukhov I., Butenko I., Alexeev D., Melnikova N., Zhuravlev V., Narvskaya O., Mokrousov I., Ilina E. Genomic and proteomic analysis of M.

tuberculosis cluster Beijing B0/W148 strains // MEEGIDXIII, 2016. Антверпен, Бельгия. – Сборник тезисов. – 2016. – Р1.2.03. – Р. 132

Список сокращений

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДТТ – дихлордифенилтрихлорэтан Ед – единица МЗ – министерство здравоохранения мг – микрограмм мкл – микролитр п.о / т.п.о. – пар оснований / тысяч пар оснований ПААГ – полиакриламидный гель ПЦР – полимеразная цепная реакция РФ – Российская Федерация ТФ – транскрипционный фактор DR – Direct Repeat (англ. прямой повтор) GO – Gene Ontology (анг. онтологичные гены) IDA – independent data acquisition (англ. получение независимых данных) IS6110 RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphisms IS6110 (англ. анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов IS6110) LC – Liquid chromatography–mass spectrometry (англ. жидкостная хроматография) M. tuberculosis – Mycobacterium tuberculosis, микобактерия туберкулеза m/z – отношение массы к заряду MRM – multiple reaction monitoring (анг. мониторинг множественных реакций) MS – масс-спектрометрия MS/MS – тандемная масс-спектрометрия PBS – phosphate buffered saline (англ. фосфатно-солевой буфер) PGG – Principal genetic group (англ. главная генетическая группа) SCG – SNP cluster groups (англ. кластер – группа на основании SNP) SDS – sodium dodecyl sulfate (англ. додецилсульфат натрия) SNP – Single Nucleotide Polymorphism (англ. однонуклеотидный полиморфизм) VNTR – Variable Number of Tandem Repeats (англ. вариабельное количество тандемных повторов)



Похожие работы:

«Министерство образования и науки РФ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тульский государственный университет Естественнонаучный факультет Кафедра физики СБОРНИК МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ...»

«МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЛИЦЕЙ №1 п. НАХАБИНО СИМБИОЗ КАК АДАПТАЦИЯ РАЗВИТИЯ К УСЛОВИЯМ СРЕДЫ Авторы работы: Овчинникова Валерия, Шибеко Глеб, ученики 11 “А” класса;Научный руководитель: Лукуткина Ольга Анатольевна, учитель биологии. Нахабино 20...»

«Каргашин Павел Евгеньевич КАРТОГРАФИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА МАГИСТРАЛЬНЫХ ГАЗОПРОВОДОВ 25.00.33 – картография Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географич...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ СК РГУТИС УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТУРИЗМА И СЕРВИСА" Лист 1 из 22 УТВЕРЖДАЮ Декан факультета подготовки кадров высшей квалификации д.э.н., профессор _ Бушуева И.В. _ " "" 201_ г. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ...»

«ЕЛИСТРАТОВ ПАВЕЛ АЛЕКСЕЕВИЧ НОВЫЙ ЭФФЕКТИВНЫЙ ПОДХОД ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ОСНОВНОГО ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ (FGF-2) И ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩЕГО ВНЕКЛЕТОЧНОГО ДОМЕНА РЕЦЕПТОРА II ТИПА TGF(TRII-ED) В E. COLI Специальность: 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степ...»

«УДК 639.2/.6 ББК 47.2 П81 Серия "Приусадебное хозяйство" основана в 2000 году Подписано в печать 20.02.2004. Формат 84x108 1/32 Усл. печ. л. 5,88. Тираж 5 000 экз. Заказ № 4281 Промышленное разведение мидий и устриц / Ред.П81 сост. И.Г. Жилякова. — М.: ООО "Издательство ACT"; Донецк: "Сталкер", 2004....»

«Муниципальное бюджетное образовательное учреждение дополнительного образования станция юных натуралистов г. Холмска муниципального образования "Холмский городской округ" Сахалинской области Рассмотрена УТВЕРЖДАЮ на педагогическом совете директор МБОУДО СЮН г. Холмска протокол № С.В. Червякова от ""_20 г. Дополнительная общеоб...»

«Школьный этап Всероссийской олимпиады школьников по экологии Ханты-Мансийский автономный округ – Югра город Нягань 2015-2016 учебный год 10-11 класс Экология 10-11 класс Задание 1. Определите правиль...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Тульский государственный университет В.А. Хромушин, К.Ю. Китанина, О.В. Хромушин, С.Ю. Федоров СО...»

«Кавказский энтомол. бюллетень 3(2): 105–185 © CAUCASIAN ENTOMOLOGICAL BULL. 2007 Материалы к фауне пластинчатоусых жуков (Coleoptera, Scarabaeoidea) Южной России Contribution to the fauna o...»

«ГІДРО ЕКО ЛО ГІЯ on submerged plants the numbers, biomass, and the number of species of phytoepiphyton were essentially higher than those on plants of other ecological groups. Keywords: phytoepiphyton, higher aquatic plants, ecological groups, the Kanev Reservoir, riverbed section. УДК 574.587 С П. КОВАЛИШ ИНА, О.Г.КАЧАЛОВ Укра...»

«Цибизова Мария Евгеньевна НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И МЕТОДОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ВОЛЖСКОКАСПИЙСКОГО РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО БАССЕЙНА 05.18.04 – Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств Диссертация на соискание ученой степени...»

«-2Пояснительная записка Нормативные правовые документы Рабочая программа составлена с учётом: ФГОС (утвержденный Приказом Минобрнауки РФ от 17.05.2012 №413);Примерной программы среднего (полного) общего образования по биологии;Федерального базисного учебного план для образовательных учрежд...»

«Геология, полезные ископаемые и проблемы геоэкологии Башкортостана, Урала и сопредельных территорий Десятая Межрегиональная научно практическая конференция Уфа, 13–15 мая, 2014 г. Материалы и доклады ИГ УНЦ РАН Российская Академия Наук Уфимский Научный центр Институт геологии Министерство Природных Ресурсов Р...»

«От составителя Хронологический указатель содержит библиографию трудов доктора биологических наук, профессора Академии Морской экологии и биотехнологии ДВГУ Вячеслава Николаевича Иванкова. В пределах каждого года книги и статьи располагаются в алфавитном порядке заглавий в такой последоват...»

«Развитие отраслевого и регионального управления УДК 338.242.4:338 И.А. Папахчян ЭТАПЫ ПРАКТИКИ ГОСРЕГУЛИРОВАНИЯ СЕЛЬХОЗПРОИЗВОДСТВА Аннотация. Рассматриваются этапы становления системы государственного регулирования агропромышленного комплекса (АПК), приведена их характеристика. Показаны ограничения государственного регулирования по правовым, бюд...»

«МИШИН АЛЕКСЕЙ ВИКТОРОВИЧ ПОЛУЧЕНИЕ И СТАБИЛИЗАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЭНДОТЕЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА Специальность 03.01.02 – Биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физ...»

«ТРБОО "Сибирское Экологическое Агентство" Кафедра начального и дошкольного образования ТОИПКРО Отдел духовно-нравственного воспитания ТОИПКРО "ХОЗЯИН СВОЕЙ ЗЕМЛИ" СБОРНИК ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ПРОГРАММ ПЕДАГОГОВ ДОШКОЛЬНЫХ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ ТОМСКОЙ ОБЛАСТИ Томск 2014 УДК 371.39.214.11 ББК 74.200.58 Х706 Х706 Хозяин своей Земли : Сборник...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ В. Н Рыжаиовекий ЭКОЛОfИЯ ПОСЛЕfНЕЗДОВОfО ПЕРИОДА ЖИЗНИ ВОРОБЪИНЫХ ПТИЦ СУБАРКТИКИ Екатерин...»

«ПЛАН РАБОТЫ МЕТОДИЧЕСКОГО ОБЪЕДИНЕНИЯ ЕСТЕСТВЕННО-МАТЕМАТИЧЕСКОГО ЦИКЛА Тема: "Формирование функциональной грамотности учащихся через использование современных образовательных технологий" Направления деятельности методического объединения Анализ результатов о...»

«~щ AJ~~~~ /3 €-J+ И/,·s ~ 1J /11 O~I:J З ~ !L-РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 1 ТРУДЫПАЛЕОНТОЛОГИЧЕСКОГОИНСТИТУТА 1932 г. Основаны в Том277 И.П.Морозова Мшанки Fenestellida отряда (морфология, система, историческое развитие) Огветственный редактор доктор биологических наук Л.А.Вискова Москва ГЕОС БЕК26.323 м79 УДК 564.7.551.73 Морозова И.П.Мшаню1...»

«Бюджетное образовательное учреждение Омской области дополнительного образования детей "Омская областная станция юных натуралистов" Переселение белок с постоянных мест обитания в парки города. (для педагогов дополнительного образования, егерей, частных владельцев животных, руководителей парковых территорий, заповедников Омско...»

«Орловская областная публичная библиотека им. И. А. Бунина. Отдел экологической информации и сельскохозяйственной литературы. ГРЕЧИХА – ЦЕННАЯ КРУПЯНАЯ КУЛЬТУРА (список литературы) Орел 2010 Гречиха – ценная крупяная культура : список литературы / Орловская обл. публ. б-ка им. И. А. Бунина ; [сост. Ю. С. С...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Ур а л ь с к о е о т д е л е н и е Институт экологии растений и животных В.Н. РЫЖАНОВСКИЙ В.Д. БОГДАНОВ КАТАЛОГ ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ГОРНО-РАВНИННОЙ СТРАНЫ УРАЛ Аннотирован...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ЯМАЛО-НЕНЕЦКИЙ АВТОНОМНЫЙ ОКРУГ ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ АДМИНИСТРАЦИИ ГОРОДА НОЯБРЬСКА МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА № 7" МУНИЦИПАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ГОРОД НОЯБРЬСК ПРИКАЗ 25.05.2015 г. № 234-од Об участии в основном государственном экзамене...»

«АНАЛИЗ РУКОВОДСТВОМ ОАО "АК "ТРАНСНЕФТЬ" ФИНАНСОВОГО СОСТОЯНИЯ И РЕЗУЛЬТАТОВ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ГРУППЫ ОАО "АК "ТРАНСНЕФТЬ" ЗА ТРИ МЕСЯЦА, ЗАКОНЧИВШИХСЯ 31 МАРТА 2012 ГОДА 1.  Общие сведения и обзор деятельности Группы 1.1. Основные инвестиционные проекты Группы 1.2. Изменения в составе инвестиций 1.3. Экологи...»

«КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА ЖЕНЩИН, УЧИТЕЛЕЙ СРЕДНЕЙ ШКОЛЫ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРА А.Н. Плакуев, М.Ю. Юрьева, Ю.Ю. Юрьев Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, г. Архангельск E-mail: m_yurieva@mail.ru Computer modeling of biological age at school mistresses i...»

«ШВЕЦОВ ЯРОСЛАВ ДМИТРИЕВИЧ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА АРИЛГИДРОКАРБОНОВОГО РЕЦЕПТОРА И ЕГО РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКОВ МЕЖПРЕДСЕРДНОЙ И МЕЖЖЕЛУДОЧКОВОЙ ПЕРЕГОРОДКИ СЕРДЦА 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание...»

«Шадже А.Е., Сиротюк Э.А., Шадже А.И.СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ ПО ЭКОЛОГИИ Майкоп – 2016 УДК 574 (03) ББК 20.1 Ш-16 Рекомендовано научно-техническим советом ФГБОУ ВО "Майкопский государственный технологический университет" Р е ц е н з е н т ы : Акатов В.В. – доктор биологических наук, профессор кафедры...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.