WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«Экспрессия циклинов фазы G1 в В-зрелоклеточных лимфомах человека ...»

На правах рукописи

Гладких Алина Александровна

Экспрессия циклинов фазы G1 в В-зрелоклеточных лимфомах человека

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена на биологическом факультете Московского Государственного

Университета им М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук И.А. Воробьев

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук А.А. Штиль (заведующий лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН) Доктор биологических наук, профессор А.М. Сапожников (заведующий лабораторией клеточных взаимодействий ИБХ РАН)

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Научноисследовательский Институт морфологии человека»

Защита диссертации состоится ___________________________2013 г. на заседании диссертационного совета Д501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. Факс:8(495)939-17-46; e-mail: dis_kalsov@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан _____________________ 2013 г.



Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы В–клеточные неходжкинские лимфомы представляют собой гетерогенную группу злокачественных опухолей, как правило, возникающих из зрелых В–клеток. К основным нозологиям этой группы относят В–клеточный хронический лимфолейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную В–крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) и лимфому Беркитта. Суммарно они составляют около 15 % от общего числа опухолей гематопоэтической и лимфоидной ткани (WHO classification of lymphomas, 2008).

Гетерогенность этой группы проявляется в большом количестве вариантов клинической картины, иммунофенотипа опухолевых лимфоцитов и различии в прогнозах заболеваний. Белки, дерегуляция которых играет центральную роль в патогенезе зрелоклеточных лимфоидных опухолей, с одной стороны должны быть эффекторным звеном нескольких сигнальных каскадов, с другой стороны – обладать плейотропностью действия. С этой точки зрения наиболее перспективными кандидатами на роль центральных белков - переключателей в опухолевых В–лимфоцитах представляются циклины группы D и циклины группы Е, чьей канонической функцией является стимуляция выхода клетки из фазы G1 и переход ее в фазу синтеза ДНК.

Для вхождения дифференцированной клетки в пролиферативный цикл необходим митогенный сигнал, в частности, связывание ростовых факторов (EGF, FGF, PDGF, IGF и т.п.) с рецептором и последующая активация ERK1/ERK2 каскада митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK-каскад). Активируемые этим каскадом транскрипционные факторы Мyc (Daksis et al., 1994) и AP-1 (Albanese et al., 1995) запускают синтез циклинов D1, D2 и D3, которые образуют комплексы с киназами CDK4 и CDK6 (Bates et al., 1994), обусловливая выход клетки из фазы G1 (Murray, 2004). Синтез циклинов D также регулируется FAK киназой и/или Rho семейством ГТФаз (Zhao et al., 1998; Gille et al., 1999), а активация PI3K пути ингибирует GSK3beta-зависимую деградацию циклинов D Переход из поздней G1 фазы в S-фазу контролируется циклин– (Liang et al., 2003).





зависимой киназой CDK2 и циклинами E1 и E2. Комплекс CDK4/6-циклин D частично фосфорилирует Rb-белки, что приводит к диссоциации гистондеацителазы от комплекса HDAC-Rb-E2F и позволяет E2F запустить синтез циклина E. Комплекс циклина Е и CDK2 дополнительно фосфорилирует Rb, и тот отсоединяется от E2F, снимая его ингибирование (Gottlieb et al., 1994; Ribes –Zamora et al., 2007).

Гиперэкспрессия циклинов группы D была показана методами иммуногистохимии, проточной флуориметрии и ИФА в некоторых лимфоидных опухолях, в частности, в опухолевых лимфоцитах фолликулярной лимфомы (Teramoto et al., 1999), диффузной В – крупноклеточной лимфомы (Filipits et al., 2002), в части опухолевых лимфоцитов В– клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) (Komaczewaska et al., 2009). Лимфома из клеток мантийной зоны была выделена из группы В–ХЛЛ по наличию транслокации t(11;14)(q13;q32), перемещающей ген циклина D1 под промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулинов, поэтому в клетках ЛКМЗ наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии циклина D1 (Williams et al., 1995). Несмотря на то, что циклин Е является основным нижележащим эффекторным звеном циклина D (Geng et al., 1999), сведения о его экспрессии в опухолях иммунной системы носят весьма разрозненный и несистематический характер. До недавнего времени оценка уровня экспрессии циклинов проводилась исключительно качественными методами, обладающими относительно низкой чувствительностью, возможно, что использование более чувствительных методов детекции с определением уровня мРНК вместо количества белка позволит выявить не одиночные, а систематические изменения уровня экспрессии циклинов фазы G1 в опухолевых лимфоцитах В–зрелоклеточных лимфом.

Цель исследования Целью данной работы было получение новых знаний об экспрессии мРНК циклинов групп D и Е в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани методом ПЦР в реальном времени.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить коллекцию образцов кДНК из зрелоклеточных опухолей и нормальной лимфоидной ткани.

2. Определить оптимальные референтные гены для нормализации данных ПЦР в реальном времени.

3. Определить уровень экспрессии мРНК генов циклинов D1, D2 и D3 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

4. Определить уровень экспрессии мРНК гена циклина Е1 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

Новизна исследования

1. Впервые исследована выборка образцов кДНК, полученной из свежезамороженных образцов лимфоидной ткани от 165 пациентов с известным имунофенотипом опухолевых клеток.

2. Использование корректной стратегии нормализации и наличие трех стабильно экспрессирующихся референтных генов впервые позволило детектировать повышенный уровень экспрессии мРНК циклинов D1 и Е в опухолевых лимфоцитах по сравнению с нормальной лимфоидной тканью.

3. Предложен новый диагностический метод разделения нозологий В-зрелоклеточных лимфом по уровню экспрессии мРНК циклина D1.

Научно–практическая значимость исследования Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике лимфоидных опухолей, данные об экспрессии циклинов G1 фазы в лимфоидной ткани могут быть использованы в курсах лекций по гематологии, частной гистологии и клеточной биологии.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на: внутреннем семинаре Совета Молодых Ученых в Гематологическом Научном Центре РАМН (2009 год), международной конференции «Experimental Hematology Association» (2010), второй Международной Школе по практической проточной цитометрии (Москва, 2011), 18-й международной конференции «18th Leipziger Workshop on Cytomics and Congenital Heart Disease» (2013) и обсуждены 23 мая 2013 года на специализированном семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии Московского Государственного Университета имени М.В.

Ломоносова.

Публикации по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 тезиса конференций.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 132 страницах машинописи и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», заключения и выводов. Работа содержит 16 рисунков и 14 таблиц. Библиографический материал включает в себя ссылки на 303 источника литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты Для исследования были выбраны образцы тканей селезенок, лимфоузлов и периферических мононуклеаров крови (48 биопсий селезенки, 23 биопсии лимфоузлов и 94 образца периферических мононуклеаров крови) 165 пациентов на базе гематологического Научного Центра (Москва, Россия).
У 33 пациентов был поставлен диагноз ЛКМЗ, и у 97 был поставлен диагноз В–ХЛЛ. Все пациенты не проходили курс лечения в момент взятия образца крови или биопсии лимфоузла. 35 референтных случаев содержали 2 случая фолликулярной лимфомы, 4 случая диффузной В–крупноклеточной лимфомы, 11 случаев лимфомы из клеток маргинальной зоны и 18 случаев с реактивным лимфаденитом (пролиферация клеток неопухолевой природы). Диагнозы «лимфома из клеток мантийной зоны» и «хронический лимфолейкоз» были поставлены с помощью методов трехцветной проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимии, в 1 случае диагноз был поставлен по наличию транслокации и клиническим данным.

Цитогенетические данные по транслокации t(11;14)(q13;q32) были доступны для 12 пациентов из 33. Средний возраст пациентов с В–ХЛЛ составил 62 года (разброс 48–76 лет), средний возраст пациентов с ЛКМЗ составил 58 лет (разброс 39-75 лет).

Иммуногистохимия и проточная флуориметрия.

Непрямая иммуногистохимическая окраска парафиновых срезов толщиной 4-5 мкм проводилась по стандартной методике (Petrosyan et al., 1999). Пробоподготовку образцов для флуориметрии проводили по стандартной методике, описанной ранее (Gretsov et al., 2004). Для окраски использовали моноклональные антитела к CD5-FITC (клон DK23, DAKO, Дания), CD19-Cy5 (клон HIB19, eBioscience, США), CD23-PE (клон MHM6, Dako, Дания), FMC7-FITC (клон MCA792F, AbD Serotec, США), CD20-Cy5 (клон 2H7, eBioscience, США), поверхностное антитело к – легкой цепи иммуноглобулинов и поверхностное антитело к -легкой цепи иммуноглобулинов (-FITC/ –PE, клон AHM4907, Invitorgen, США). Полученные пробы анализировались на проточном цитофлуориметре FACsCalibur (BD). Результаты обрабатывались в программе CellQuest (BD Biosciences, США). Отсечки выставлялись по негативным контролям.

Выделение периферических мононуклеаров крови и получение суспензий Клетки мононуклеаров крови выделяли в градиенте Ficoll-Histopaque (SigmaAuldrich, США) по стандартной методике. Полученные клетки дважды отмывались в среде RPMI-1640 (Панэко, Россия) и замораживались в жидком азоте. Из кусочков ткани лимфатических узлов и селезенок приготавливалась суспензия в medi-machine (BD BioSciences). Суспензии также замораживались в жидком азоте. Нормальные В– лимфоциты из периферических мононуклеаров крови здоровых доноров выделяли на колонках miniMACS (Miltenyi Biotech GmbH, Germany) по протоколу производителя.

Получение РНК и кДНК Выделение РНК из замороженных клеток осуществлялось при помощи RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) по протоколу производителя. После выделения РНК была дополнительно обработана ДНКазой (Fermentas, США) в течение 30 минут при 37 С.

Концентрация РНК измерялась на спектрофотометре (Genesis UV10, Thermo Electron, США). Анализ чистоты выделенной РНК проводился по измерению пиков А260/А280 и А260/А230. Среднее соотношение А260/А280 составило 1,85 (диапазон 1,7-1,9), среднее соотношение А260/А230 составило 1,7 (диапазон 1,65-1,95).

Подбор праймеров Для амплификации ПЦР–РВ использовались е последовательности праймеров, предложенные Vandesompele et al., (2002). Для генов циклинов D2, D3 и циклина Е были написаны следующие праймеры: cyclin D2 sense: 5’ - CTG GGG AAG TTG GAA GTG GA -3’; cyclin D2 antisense: 5’ - CAA TCC ACG TCT GTG TTG G; cyclin D3 sense: 5’- GAC CTT TTT GGC CCT CTG T- 3’; cyclin D3 antisense: 5’ – GCT TCG ATC TGC TCC TGA C;

cyclin E1 sense: 5’ – AGC ACT TCA GGG GCG TCG-3’; cyclin E1 antisense: 5’ – GCC CGC TGC TCT GCT TCT. Результаты ПЦР подтверждались на электрофорезе. Результат ПЦР для гена циклина D1 проверяли с помощью клонирования продукта реакции в вектор pGem-T Easy Vector (Promega) согласно инструкции производителя с последующим сиквенсом вставки. Для того чтобы минимизировать амплификацию геномной ДНК, праймеры были составлены так, чтобы каждую пару разделял хотя бы один интрон. По последним данным, все выбранные нами гены выполняют независимые функции и не имеют общей регуляции.

ПЦР в реальном времени Количественные ПЦР–реакции в реальном времени проводили на приборе MiniOpticon (Biorad Headquaters, Hercules, California) методом неспецифической детекции с красителем SybrGreen I (Синтол, Россия).

Стандартная ПЦР реакция проводилась в объеме 25 мкл с реактивами фирмы «Синтол» (Россия) и включала в себя 2,5 мкл 10 х кратного ПЦР буфера с Sybr Green I, 2,5 мМ MgCl2, 2,5 мМ дНТФ, 1,5 единицы Taq-полимеразы Hot Rescue, 10 пмоль каждого праймера и 5 мкл 5 –кратного разведения кДНК. Условия реакции включали первоначальную денатурацию (при 95 С) и последующие 40 циклов репликации (95 С 15 сек, 64 С 30сек, 72 С 60 сек).

Нормализация данных В работе была использована методика расчета относительного нормализованного количества кДНК с помощью фактора нормализации (Vandesompele et al., 2002).

Результаты были проанализированы с помощью бесплатных приложений для обработки данных ПЦР в реальном времени: GeNorm (Center of medical Genetics, Ghent University hospital, geNorm version 3.5, 2002), NormFinder (Molecular Diagnostic Laboratory, Department of clinical Biochemistry, Aarhus University Hospital, Denmark, 2004) и BestKeeper (FML-Weihenstephan, Centre of Life and Food Science, Technical University of Munich, Для статистического анализа данных и построения графиков Germany, 2003).

использовалась программа GraphPad® Prism (GraphPad Software, version 5, San Diego, Для теста на нормальность распределения использовали критерии CA, USA).

д’Агостино–Пирсона и Холмогорова–Смирнова.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Иммунофенотипирование и иммуногистохимия Классификация исследованных в работе нозологий проводилась по данным проточной флуориметрии (рис.1). Согласно классификации ВОЗ(1), для клеток В–ХЛЛ характерен иммунофенотип CD5+/CD19+/CD23+/FMC7-, для клеток ЛКМЗ характерен иммунофенотип клональность опухолевых клеток CD5+/CD19+/CD23-/FMC7+, подтверждали по экспрессии одного из вариантов легких цепей иммуноглобулинов (каппа или лямбда).

При работе с образцами тканей нозологии «хронический лимфолейкоз» и «лимфома из клеток мантийной зоны» описывали не только по данным проточной цитофлуориметрии, но и по данным иммуногистохимической окраски на циклин D1 и CD23 на парафиновых срезах. Практически все опухолевые лимфоциты В–ХЛЛ экспрессируют CD23, а в лимфоме из клеток мантийной зоны позитивно по CD23 окрашена лишь часть лимфоцитов в редуцированных остаточных фолликулах, тогда как основная масса опухоли вокруг фолликулов является CD23–негативной (Рис. 2 B, C).

Ядра большей части опухолевых лимфоцитов ЛКМЗ ярко окрашиваются антителами к циклину D1, тогда как за небольшим исключением остальные зрелоклеточные лимфопролиферативные заболевания, включая большинство случаев В-ХЛЛ и лимфомы из клеток маргинальной зоны, являются циклин D1–негативными. В исследованной выборке ядерное окрашивание опухолевых лимфоцитов антителами к циклину D1 наблюдалось во всех образцах солидных тканей с нозологией ЛКМЗ (12 из 12), пример такого окрашивания приведен на рис. 2, A. В образце ткани лимфоузла с нозологией В– ХЛЛ окрашивание антителами к циклину D1 детектируется лишь в небольшой части ядер лимфоцитов в центрах пролиферации (Рис. 2 D).

По литературным данным в небольшом числе случаев наблюдается ядерное окрашивание антителами к циклину D1 части клеток лимфоузлов с нозологией В–ХЛЛ (Cheuk et al., 2004). Было установлено, что существует группа образцов В–ХЛЛ с гиперэкспрессией этого белка в части лимфоцитов, хотя в большинстве случаев В–ХЛЛ надежно детектировать экспрессию этого белка методом иммуногистохимии не удалось.

Так как отсутствие гиперэкспрессии белка на качественном уровне не всегда означает отсутствие гиперэкспрессии на уровне мРНК, далее было решено проанализировать уровень экспрессии мРНК гена циклина D1 на выборке пациентов с В– ХЛЛ и лимфомой из клеток мантийной зоны методом количественного ПЦР в реальном времени.

Рисунок 1. Иммунофенотипические характеристики клеток ЛКМЗ и В–ХЛЛ по данным проточной флуориметрии.

(A) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток ЛКМЗ (B) Коэкспрессия CD5/CD19 в клетках ЛКМЗ (C) Коэкспрессия CD19/CD23 в клетках ЛКМЗ (D) Клональность опухолевых клеток ЛКМЗ (E) Экспрессия FMC7 в опухолевых лимфоцитах ЛКМЗ (F) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток В-ХЛЛ (G) Коэкспрессия CD5/CD19 в клетках В-ХЛЛ (H) Коэкспрессия CD19/CD23 в клетках В-ХЛЛ, (I) Клональность опухолевых клеток ЛКМЗ (J) отсутствие экспрессии FMC7 в опухолевых лимфоцитах В-ХЛЛ.

2.2 Подбор референтных генов Статистическое описание уровня экспрессии кандидатов в референтные гены в лимфоидной ткани.

Для оценки уровня экспрессии гена циклина D1 необходимо было выбрать референтные гены, которые можно использовать в качестве внутренних стандартов при расчете относительного нормализованного количества мРНК исследуемых генов циклинов фазы G1. Экспрессия таких генов должна быть сопоставима с нормальным уровнем транскрипции мРНК генов циклинов группы D и Е (относительно низкая экспрессия) и при гиперэкспрессии этих мРНК в опухолевых лимфоцитах, кроме того, их экспрессия должна быть стабильной в клетках крови, селезенки и лимфоузлов как в нормальной лимфоидной ткани, так и при различных вариантах неопластической трансформации (Vandesompele et al., 2002).

Рисунок 2. Иммуногистохимическая окраска на циклин D1 и CD23 на парафиновых срезах лимфоузлов с диагнозами В–ХЛЛ и ЛКМЗ.

(А) Ядерное окрашивание опухолевых лимфоцитов ЛКМЗ на циклин D1, основная масса опухолевых клеток позитивна по циклину D1, x20 (B) Иммуногистохимическое окрашивание лимфоузла с ЛКМЗ на CD23.

Цитоплазматическая окраска CD23 в центрах размножения редуцированных фолликулов, вокруг негативные по CD23 опухолевые лимфоциты, х20 (С) Ядерное окрашивание небольшой части лимфоцитов В–ХЛЛ на циклин D1, циклин D1–позитивные лимфоциты находятся в редуцированных центрах размножения, основная часть опухоли циклин D1– негативна, х20 (D) Цитоплазматическая окраска опухолевых лимфоцитов В–ХЛЛ на CD23, основная масса опухоли позитивна по CD23, х20. На врезках дано увеличение х60.

Для лимфоцитов в качестве кандидатов в референтные гены с предполагаемым высоким уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 20 до 25) были выбраны гены B-ACTIN, GAPDH (Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase), B2M (Beta-2microglobulin) и RPL13A (Ribosomal protein L13a), в качестве референтных генов со средним уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 25 до 30) были выбраны гены UBC (Ubiquitin C) и HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1), в качестве референтного гена с низким уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 30 и выше) был выбран ген YWHAZ (Tyrosine 3-monooxygenase tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide).

На предварительном этапе анализа было показано, что экспрессия мРНК выбранных референтных генов детектируется во всех типах лимфоидной ткани, то есть мРНК всех генов удалось обнаружить в образцах клеток крови, лимфоузлов и селезенки. Продукты каждой ПЦР–реакции детектировались с помощью гель–электрофореза в 1,5% агарозном геле и имели ожидаемую молекулярную массу, совпадающую с размером ампликона В экспериментах ПЦР в реальном времени специфичность амплификации доказывали по наличию единичного пика на кривой плавления. Для каждого из образцов стандартное отклонение в трипликате всегда было меньше 0,2. Диапазон пороговых циклов и средние значения представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Значения пороговых циклов для экспрессии референтных генов в лимфоидной ткани.

EC gene Ct range Ct min Ct max Mean Ct±s.e.m. SD YWHAZ 3,93 32,01 35,94 33,63 ± 0.06 0,71 UBC 6,53 24,33 30,86 26,90 ± 0.08 1,07 HPRT1 5.24 26.33 31.57 28.73 ± 0.09 1,33 B-ACTIN 5,93 19,80 25,73 22,64 ± 0.11 1,44 GAPDH 5,78 21,72 27,51 24,72 ± 0.11 1,37 RPL13A 8,15 20,11 28,26 24,73 ± 0.15 1,93 B2M 8,30 18,18 26,48 22,06 ± 0.16 2,07 В различных типах лимфоидной ткани уровень экспрессии мРНК исследуемых генов не отличался. Эквивалентность экспрессии генов в выборке проверяли с помощью теста Манна-Уитни. По результатам этого теста была доказана эквивалентность экспрессии референтных генов для опухолевой и нормальной лимфоидной ткани (p0,05).

Для проверки на нормальность распределения использовались критерии д’Агостино– Пирсона и Колмогорова–Смирнова. Оказалось, что лишь для 2 из 7 генов, в частности YWHAZ и UBC, выборка данных по экспрессии мРНК имеет вид нормального распределения при проверке двумя критериями (p0,1, = 0,05), для остальных генов (HPRT1, GAPDH, B-ACTIN, RPL13A, B2M) выборки данных по уровню экспрессии мРНК не прошли проверку на нормальность распределения, что делает применение к ним t-теста некорректным.

–  –  –

В группе ЛКМЗ и CD5–негативных лимфом GAPDH, ACTB and HPRT1 менялись местами, но YWHAZ и UBC имели самые низкие значения меры стабильности M, тогда как у RPL13A и B2M значения М были самыми высокими. Анализ значений уровня экспрессии мРНК референтных генов в программе Best Keeper, так же, как и в программе geNorm, в качестве наиболее стабильных выявил гены YWHAZ and UBC как прошедшие установленный порог SD (стандартное отклонение) 1. Для определения стабильности наших генов–кандидатов также была использоваана программа NormFinder. В качестве наиболее стабильного гена в программе NormFinder также оказался ген YWHAZ со значением меры стабильности 0,045 и UBC с мерой стабильности 0,049.

Для того чтобы оценить количество генов, необходимое и достаточное для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени, использовали анализ коэффициентов парной вариации в программе geNorm. Для большинства групп, так же как и для целой выборки, наиболее низкое значение парного отклонения (V) было получено для отношения четвертого и пятого генов (V4/5), и варьировало от 0,18 до 0,25 (Рис. 4). Это означает, что различиями в уровне экспрессии мРНК этих генов можно пренебречь, и для эффективной нормализации достаточно трех генов. В группе образцов лимфоидной тканей с нозологией ЛКМЗ и группе, состоящей из образцов ткани лимфатических узлов, минимальное значение V было получено для отношения пятого и шестого генов (V5/6 = 1,9 и 0,22 соответственно). Однако графики линейной регрессии, построенные в парных осях факторов нормализации, показали, что наиболее удачная линеаризация получается для NF3 напротив NF4 (R2 = 0.81), то есть различия в уровне экспрессии этих генов являются незначительными. Таким образом, отношение уровней экспрессии мРНК этих генов остается практически постоянным, что делает необязательным добавление четвертого гена в расчет фактора нормализации.

По итогам анализа с помощью программ geNorm, NormFinder и BestKeeper, гены YWHAZ и UBC имеют наиболее стабильный уровень экспрессии в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани. Трех рефрерентных генов, YWHAZ, UBC и BACTIN достаточно для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени для лимфоидной ткани.

2.3. Оценка экспрессии циклина D1 в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани Популяция В-клеток из образцов периферических мононуклеаров крови здоровых доноров (n=10) была обогащена на колонках Mylteniy Biotech, клетки сортировали по экспрессии пан В–клеточного антигена CD19, чистота обогащенной популяции составляла от 73 до 93 %. Относительное нормализованное количество кДНК циклина D1 в таких образцах варьировало от 0,00003 до 0,0005. Относительное нормализованное количество кДНК циклина D1 в тех же образцах цельной крови варьировало от 0,00008 до 0,0007, таким образом, в нормальных В- и Т-клетках циклин D1 экспрессируется на очень низком уровне, причем уровень экспрессии циклина D1 не отличается в сортированных Влимфоцитах и несортированных периферических мононуклеарах крови.

Относительное нормализованное количество кДНК в образцах солидных тканей неопухолевой природы D1 варьирует от 0,00001 до 0,002 у разных больных (медиана 0,00007), т. е. экспрессия гена циклина D1 в образцах воспалительной природы ниже, чем в опухолевых клетках (Рис. 5). В клетках ЛКМЗ относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 варьирует от 0,04 до 13,55 у разных больных (медиана 0,226) и превышает относительное нормализованное количество кДНК в клетках реактивного лимфаденита на 3 порядка (Таблица 3). Относительное количество кДНК гена циклина D1 в клетках ВХЛЛ варьирует от 0,00002 до 0,09 (медиана 0,003) и может отличаться на 3 порядка в клетках разных больных с этой нозологией (см. рис. 5).

–  –  –

В группе образцов CD5–негативных лимфом (n = 17), куда входили образцы тканей с нозологиями «фолликулярная лимфома», «лимфома из клеток маргинальной зоны», «диффузная В–крупноклеточная лимфома», относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 варьировало от 0,00005 до 0,004 (медиана 0.0004) (см. табл. 3;

рис. 5). По уровню экспрессии мРНК гена циклина D1 можно получить статистически значимые отличия для этой группы от группы образцов ткани с реактивным процессом (p 0,002, критерий Манна-Уитни), но нельзя различить нозологии внутри нее (p = 0,33 для лимфомы из клеток маргинальной зоны и p = 0,26 для ДВККЛ).

–  –  –

Таким образом, по уровню экспрессии мРНК нозологии В-зрелоклеточных лимфом могут быть расположены следующим образом (начиная с наименьшей) CD5-негативные лимфомы, В-ХЛЛ, ЛКМЗ. При этом уровень экспрессии мРНК циклина D1 повышен во всех опухолевых лимфоцитах по сравнению с нормальными В-клетками. Гиперэкспрессия мРНК циклина D1 наблюдается в клетках В-ХЛЛ в отсутствие транслокации t(11;14).

Различия в уровне экспрессии мРНК циклина D1 между всеми нозологиями являются статистически достоверными.

3.4. Сравнение различных подходов к нормализации данных ПЦР в реальном времени Для того чтобы иметь возможность сравнить полученные данные с данными литературы, относительное количество мРНК гена циклина D1 было нормализовано методом Ct (Livak et al., 2001) по одному референтному гену, для чего был выбран ген YWHAZ, так как его экспрессия является наиболее стабильной в выборке (рис. 6).

Использование этого подхода позволяло разделить выборку по нозологиям, но разница между медианами для групп стала менее достоверной, а различия между группами образцов реактивной лимфоидной ткани и CD5–негативных опухолей стали статистически недостоверными (p=0.11, тест Манна–Уитни, Таблица 4).

Таким образом, использование одного референтного гена для нормализации данных ПЦР в реальном времени не позволяет достоверно различить нозологии с разницей в уровне экспрессии мРНК менее двух порядков.

–  –  –

3.4. Пролиферация клеток с гиперэкспрессией мРНК циклина D1 Пролиферация клеток в образце оценивалась по наличию в клетках пролиферативного маркера Ki-67, оцененного методом проточной флуориметрии. В образцах лимфомы из клеток мантийной зоны пролиферативный индекс варьировал от 0,3 до 44 % (среднее 8,41), пролиферативный индекс в образцах с нозологией В-ХЛЛ варьировал от 0 до 10 % (среднее 3%). На рис. 7 приведен пример типичного окрашивания клеток из суспензии лимфоузлов с нозологиями В-ХЛЛ (рис.7, А, В) и ЛКМЗ (рис.7, C, D). В выборке отсутствовала корреляция между уровнем экспрессии мРНК гена циклина D1 и количеством пролиферирующих клеток в образцах с нозологией ЛКМЗ, оцененному по маркеру пролиферации Ki-67, коэффициент Спирмена для корреляции между количеством опухолевых В-клеток и относительным Ki-67–положительных нормализованным количеством мРНК гена циклина D1 был равен - 0,005. Количество мРНК циклина D1 в образцах с нозологией ЛКМЗ не зависело от типа опухолевого роста в ткани: максимальное количество мРНК циклина D1 было обнаружено в образцах с диффузным типом роста опухоли при отсутствии на срезах митотических фигур, а в образцах с бластоидным вариантом ЛКМЗ оно было относительно низким.

3.5. Иммунофенотипирование лимфом «серой зоны»

В процессе иммунофенотипирования тканей В-зрелоклеточных лимфом была обнаружена группа образцов с имунофенотипическими характеристиками, не соответствующим в полной мере ни одной из нозологий. Такие клетки, как правило, экспрессируют на поверхности маркеры, характерные как для клеток ЛКМЗ (высокий уровень экспрессии поверхностных маркеров CD20 и FMC7), так и маркеры, характерные для опухолевых лимфоцитов В–ХЛЛ (экспрессия поверхностного маркера CD23). Такие образцы были условно отнесены к нозологии лимфом «серой зоны». Пример иммунофенотипа, характерного для опухолевых лимфоцитов лимфом «серой зоны», приведен на рис. 8. В связи с появлением новой нозологической группы была создана отдельная выборка кДНК, состоящая из 27 образцов ЛКМЗ, 27 образцов В–ХЛЛ, 14 образцов лимфомы из клеток маргинальной зоны (ЛМарЗ), 26 образцов лимфом «серой зоны» и 15 образцов реактивной ткани.

Экспрессия циклина D1 в группе лимфом «серой зоны»

3.6.

В новой выборке самый высокий уровень экспрессии мРНК гена циклина D1 по–прежнему наблюдался в опухолевых лимфоцитах ЛКМЗ (медиана 1,99), в клетках В– ХЛЛ (медиана 0,004) он был снижен по сравнению с клетками ЛКМЗ, но выше, чем в реактивной лимфоидной ткани. Данные об уровне экспрессии мРНК гена циклина D1 в новой выборке представлены в Таблице 5. По экспрессии циклина D1 группа лимфом «серой зоны» разделилась на 2 части: в 7 образцах из 26 относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 было больше условного порога в 0,1 (диапазон 0,88что дало возможность отнести эти образцы к нозологии «лимфома из клеток мантийной зоны». В 19 образцах из 26 относительное нормализованное количество кДНК было меньше 0,1 (диапазон 0,003-0,078), для этих образцов был исключен диагноз «лимфома из клеток мантийной зоны».

В новой выборке тканей В-зрелоклеточных лимфом появилась группа образцов с иммунофенотипом, промежуточным для клеток ЛКМЗ, В–ХЛЛ и лимфомы маргинальной зоны. Эта группа образцов была условно названа «лимфомы серой зоны». По уровню экспрессии мРНК циклина D1 в этой группе можно однозначно выделить образцы с гиперэкспрессией мРНК циклина D1, для которых подтверждается транслокация t(11;14)(q13;q32), и которые можно отнести к нозологии «лимфома из клеток мантийной зоны». Остальные образцы без гиперэкспрессии циклина по совокупности иммунофенотипических и D1 молекулярных характеристик были отнесены к нозологиям «хронический лимфолейкоз» и «лимфома из клеток маргинальной зоны». Таким образом, оценка уровня экспрессии мРНК циклина D1 в образцах позволяет разделить нозологии Взрелоклеточных лимфом в тех случаях, когда результаты имунофенотипирования неочевидны.

–  –  –

Рисунок 8. Пример иммунофенотипического описания образца с нозологией «лимфома из клеток серой зоны».

(А) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток (B) Коэкспрессия CD5 и CD19 на опухолевых лимфоцитах (С) Частичная экспрессия CD23 на опухолевых лимфоцитах - (D) Экспрессия FMC7 на части опухолевых лимфоцитов (Е) Клональность опухолевых лимфоцитов

3.7. Экспрессия циклинов D2 и D3 в опухолевых и нормальных лимфоцитах Экспрессия мРНК циклина D2 была выявлена во всех образцах (n=109), за исключением четырех образцов реактивной ткани. Наиболее высокий уровень D2 наблюдался в клетках В–ХЛЛ (медиана 1,424), самый низкий уровень экспрессии наблюдался в опухолевых лимфоцитах лимфомы из клеток маргинальной зоны (медиана 0,0078). По уровню экспрессии мРНК гена циклина D2 можно было достоверно отличить группы образцов CD5 – положительных опухолей (нозологии В-ХЛЛ, ЛКМЗ и лимфомы «серой зоны») от реактивного процесса и группы ЛМарЗ (для всех пар p0.05, тест Манна-Уитни). Различия в уровне экспрессии мРНК гена циклина D2 между группами В–ХЛЛ, ЛКМЗ и лимфомы «серой зоны» были статистически недостоверными (p=0.19, тест Крускала-Уоллиса), так же, как и различия в уровне экспрессии мРНК гена циклина D2 между опухолевыми лимфоцитами лимфомы из клеток маргинальной зоны и нормальными лимфоцитами реактивной лимфоидной ткани (p=0.13, тест Манна-Уитни).

Данные о диапазоне экспрессии циклина D2 в опухолевых и нормальных В– лимфоцитах представлены в Таблице 6.

–  –  –

В опухолевых лимфоцитах В-ХЛЛ при отсутствии транслокации t(11;14)(q13;q32) существует обратная зависимость между уровнем экспрессии мРНК циклинов D1 и D2: малое количество мРНК циклина D1 в таких клетках компенсируется большим количеством мРНК циклина D2.

Экспрессия циклина Е в нормальных и опухолевых лимфоцитах мРНК гена циклина Е детектировалась во всех типах лимфоидной ткани (селезенка и лимфоузел) и в периферических мононуклеарах крови. Самый высокий уровень экспрессии циклина Е наблюдался в опухолевых лимфоцитах при В-ХЛЛ (медиана 1,12), самый низкий уровень экспрессии мРНК гена циклина Е наблюдался в клетках реактивной лимфоидной ткани (медиана 0,0002). Наиболее гетерогенной по уровню экспрессии мРНК циклина Е оказалась группа образцов ЛКМЗ: разброс относительного нормализованного количества кДНК гена циклина Е в образцах тканей с этой нозологией составил 4 порядка (Таблица 7). Данные о диапазоне экспрессии циклина Е в нормальных и опухолевых лимфоцитах приведены на рис. 10 и в Таблице 7. При анализе экспрессии циклина Е наиболее интересной оказалась группа При анализе корреляций выяснилось, что в клетках ЛКМЗ существует обратная корреляция между уровнем экспрессии мРНК генов циклина Е и циклина D1: в клетках с высоким уровнем экспрессии мРНК гена циклина D1 снижена экспрессия мРНК гена циклина Е, коэффициент корреляции Спирмена для двух этих выборок был равен -0,77. При исключении из выборки кДНК четырех образцов ткани с бластоидным вариантом ЛКМЗ (агрессивный вариант лимфомы мантийной зоны с активной пролиферацией клеток, которые морфологически близки к бластам) коэффициент корреляции увеличивался до На рис. 10 видно, что в группе образцов лимфом «серой зоны» есть 5 образцов с очень низким уровнем экспрессии циклина Е (выделены красным цветом). В этих же образцах мРНК циклина D1 экспрессируется на высоком уровне (диапазон 0,53-2,56), то есть по уровню экспрессии мРНК гена циклина D1 эти образцы могут быть отнесены к нозологии ЛКМЗ.

–  –  –

Таким образом, количество мРНК циклина Е повышено в опухолевых лимфоцитах всех нозологий В-зрелоклеточных лимфом по сравнению с клетками неопухолевой лимфоидной ткани. В клетках ЛКМЗ существует обратная зависимость между уровнем экспрессии мРНК циклина D1 и циклина Е: чем больше мРНК циклина D1, тем меньше мРНК циклина Е. Исключением являются случаи ЛКМЗ с бластоидным типом роста опухоли, в которых такая корреляция отсутствует.

Заключение Довольно долгое время уровень экспрессии циклинов в тканях оценивали по экспрессии белка методом иммуногистохимии. При использовании иммуногистохимии возникали сложности, связанные со специфичностью белкового эпитопа и относительно низкой специфичностью метода, которую невозможно повысить без понижения чувствительности. В 2002 году группа Jain et al. показала, что существует 90% корреляция между уровнем мРНК и белка циклина D1 в лимфоидной ткани, после чего исследователи получили возможность использовать для детекции циклинов более трудоемкий, но и более чувствительный метод полимеразной цепной реакции.

В первой части настоящей работы был проведен анализ экспрессии генов домашнего хозяйства в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани, который показал, что наиболее стабильный уровень экспрессии характерен для генов YWHAZ и ubc, причем выбор наиболее стабильных генов не зависит от методики расчета. Нужно отметить, что гены YWHAZ и UBC были единственными, уровни экспрессии мРНК которых имела вид нормального распределения во всей выборке, то есть проведение теста на нормальность распределения в выборке может служить хорошим критерием для предварительной оценки стабильности уровня экспрессии мРНК кандидатов в референтные гены. Таким образом, было показано, что для корректной нормализации данных в реальном времени достаточно использования трех стабильно экспрессирующихся генов, в качестве третьего референтного гена был использован ген BACTIN, но недостаточно одного, даже максимально стабильного, гена домашнего хозяйства, если разница в уровне экспрессии гена мишени для них составляет менее двух порядков.

Использование корректной стратегии нормализации и трех стабильных референтных генов впервые позволило получить данные о систематическом превышении уровня мРНК циклинов G1 фазы в образцах ткани В-зрелоклеточных лимфом по сравнению с нормальной лимфоидной тканью.

Кроме того, использование этой стратегии позволило разделить между собой нозологические группы лимфомы из клеток мантийной зоны и хронического лимфолейкоза, а также отличить их от CD5–негативных лимфом и реактивного лимфаденита. Эти результаты имеют важное значение для диагностики Взрелоклеточных лимфом, так как позволяют быстро проводить дифференциальную диагностику В-зрелоклеточных лимфом в тех случаях, когда результаты иммунофенотипирования неочевидны (лимфомы так называемой «серой зоны»).

Интересно, что повышенный уровень мРНК циклина D1 наблюдался во всех образцах В-ХЛЛ в отсутствие транслокации t(11;14)(q13;q32). В 2012 году вышла статья Gradowski et al. о гиперэкспрессии белка циклина D1 в ядрах клеток пролиферативных центров псевдофолликулов лимфоузлов при В–ХЛЛ, которая подтверждает данные настоящей работы.

Данные о повышенной экспрессии мРНК гена циклина D1 в отсутствие транслокации t(11;14)(q13;q32) в клетках В–ХЛЛ и привели к идее о том, что в таких клетках может быть изменен профиль экспрессии мРНК генов циклинов D2 и D3, а также циклина Е, поскольку именно он является основной нижележащей мишенью для циклина D1.

В настоящей работе впервые было показано повышение уровня циклина D2 и циклина Е в опухолевой лимфоидной ткани, а также наличие отрицательной корреляции между уровнем экспрессии мРНК гена циклина D1 и уровнем экспрессии циклина D2 для хронического лимфолейкоза и циклина Е для лимфомы из клеток мантийной зоны.

В результате сравнения данных по уровню экспрессии мРНК циклинов D и Е и уровня пролиферативной активности клеток в образце, оцененного по экспрессии маркера Ki-67, стало ясно, что в опухолевой лимфоидной ткани клетки с высоким уровнем жкспрессии G1 фазы практически не пролиферируют.

В литературе существуют немногочисленные данные о том, что, гиперэкспрессия циклина D1 может не приводить к ускорению пролиферации. В частности, индукция дифференцировки клеток миелолейкоза in vitro сопровождается повышением уровня экспрессии циклина D1 и остановкой деления этих клеток, причем повышение экспрессии циклина D1 сопровождается резким повышением экспрессии ингибитора циклинзависимых киназ p21 (Ullmannova et al., 2003). Такая же ситуация характерна для опухолевых лимфоцитов волосатоклеточного лейкоза, для которого характерен крайне низкий пролиферативный индекс, гиперэкспрессия циклина и отсутствие D1 транслокации t(11;14) (Bosch et al., 1995). Эти данные свидетельствуют о том, что альтернативной функцией циклина D1 может быть стимуляция дифференцировки клеток с использованием сложных регуляторных механизмов. Первым вариантом такого механизма может быть связывание циклина D1 с PCNA и cdk-2, что ведет к подавлению репликации ДНК и снижению активности cdk-2 (Fukami-Kobayashi et al., 1999). Второй вариант, по-видимому, связан с регуляторной петлей циклин D1-p21cip и запретом на выход в S-фазу (Steinmannet al., 1998).

Другая вероятная функция для циклина D1 в клетках ЛКМЗ, и, возможно других лимфом – защита опухолевых клеток от апоптоза. Однако в 2008 году группа Klier et al.

опубликовала статью о последовательном и двойном нокдауне генов циклина D1 и D2 в клетках культуры ЛКМЗ, и отсутствии изменений ни в скорости пролиферации, ни в апоптотическом индексе для этих клеток. Таким образом, в совокупности полученные результаты заставляют предположить, что накопление опухолевых клеток с повышенной экспрессией циклинов G1 фазы в зрелоклеточных лимфомах не связано с ускорением пролиферации, а обусловлено получением клонального преимущества за счет смены профиля транскрипции опухолевых клеток.

Выводы

1. Для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени в лимфоидной ткани достаточно трех стабильно экспрессирующихся референтных генов. Гены YWHAZ, UBC и B-ACTIN являются оптимальными для нормализации данных ПЦР в реальном времени в нормальной и неопластической лимфоидной ткани.

2. По уровню экспрессии гена циклина D1 нозологии располагаются следующим образом, начиная с максимального уровня экспрессии: лимфома из клеток мантийной зоны (медиана 0,23), хронический В-клеточный лимфолейкоз (медиана 0,003), CD5–негативные опухоли (медиана 0,0004), реактивная лимфоидная ткань (7х10-5). Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 в клетках ЛКМЗ и реактивной лимфоидной ткани отличается на 4 порядка. Различия в уровне экспрессии мРНК циклина D1 между всеми группами образцов являются статистически достоверными.

3. По уровню экспрессии гена циклина Е исследованные нозологии располагаются следующим образом, начиная с максимального уровня экспрессии: хронический Вклеточный лимфолейкоз (медиана 1,12), лимфома из клеток маргинальной зоны (медиана 0,97), лимфомы «серой зоны» (медиана 0,81), лимфома из клеток мантийной зоны (медиана 0,08) и реактивная лимфоидная ткань (медиана 2х10-4).

Различия в уровне экспрессии мРНК циклина Е между образцами нормальной и опухолевой лимфоидной ткани являются статистически достоверными.

4. Уровень экспрессии генов циклинов группы D и циклина Е не коррелирует с пролиферативной активностью опухолевых лимфоцитов В–клеточных лимфом, определяемой по маркеру Ki-67.

5. Существует достоверная обратная корреляция для количества мРНК циклина D1 и циклина D2 (в группе образцов В-ХЛЛ) и для количества мРНК циклина D1 и циклина Е (в группе образцов ЛКМЗ).

6. Дерепрессия циклина D1 и повышение уровня экспрессии циклина Е в опухолевой лимфоидной ткани может играть важную роль в опухолевой трансформации зрелых В–лимфоцитов.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Concurrent epigenetic silencing of wnt/-catenin pathway inhibitor genes in B cell chronic lymphocytic leukaemia.Moskalev EA, Luckert K, Vorobjev IA, Mastitsky SE, Gladkikh AA, Stephan A, Schrenk M, Kaplanov KD, Kalashnikova OB, Ptz O, Joos TO, Hoheisel JD. BMC Cancer. 2012 Jun 6;12:213. doi: 10.1186/1471-2407-12-213.

2) Гладких А.А, Поташникова Д.М., Корнева Е.П., Худолеева О.А., Воробьев И.А.,

2011. Сравнительный анализ экспрессии циклина D1 в клетках В-клеточных лимфом и реактивного лимфаденита. Гематология и трансфузиология, 56, 4, с.3D. Potashnikova, A. Gladkikh, E. Gretsov, N. Barteneva, I. Vorobjev. Expresion of BCR – associated signaling components in sorted B-CLL cells. // Abstracts of the 2nd International Workshop on Practical Cytometry, 26-30 August, 2011. Cytometry B, 82, p. о1-017.

4) Gladkikh A, Potashnikova D, Korneva E, Khudoleeva O, Vorobjev I. Cyclin D1 expression in B-cell lymphomas. Exp Hematol. 2010 Nov;38(11):1047-57.

5) Gladkikh A, Potashnikova D, Korneva E, Khudoleeva O, Vorobjev I. Cyclin D expression in B –cell lymphomas: a comparative study. Haematologica | 2010; 95(s2), p 516

6) Potashnikova D, Barteneva N, Gladkikh A, Gretsov E, Vorobjev I. Expression of BCR associated molecules in normal and malignant lymphocytes. 18th Leipziger Workshop, 2013, P001.

Благодарности Автор благодарит своего научного руководителя д.б.н. И.А. Воробьева за неизменную поддержку на протяжении всего времени выполнения работы, своих коллег Д.М.

Поташникову, Е.П. Корневу, О.А. Худолееву, А.В. Творогову, Т.А. Смирнову, А.В.

Пантелеева, С.М. Таугера, без которых эта работа не могла состояться; врачей к.м.н. О.А.

Губкину, к.м.н. А.В. Губкина, В.И. Воробьева за предоставленные образцы тканей и консультации; своих оппонентов д.б.н. Н.И. Дризе и д.м.н. А.А. Штиля за конструктивную критику; весь коллектив кафедры клеточной биологии и гистологии МГУ имени М.В. Ломоносова и заведующего кафедрой д.б.н., профессора Г.Е. Онищенко.



Похожие работы:

«1. Цель и задачи дисциплины: познакомить магистранта с современными методами определения химического анализа почв, научить магистра самостоятельно проводить основные методы определения химического состава почв.2. Место дисциплины в структуре ООП. Предшествующими курсами, на которы...»

«Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение "Гимназия № 3" Центр экологического образования, краеведения, детско-юношеского туризма и отдыха Рассмотрена на педагогическом совете УТВЕР...»

«ПРОГРАММЫ РАЗВИТИЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И МОНИТОРИНГА НПРА Общая программная цель – развитие научных исследований и мониторинга, направленных на оценку текущего состояния, динамики и прогнозируемых изменений охраняемы...»

«Переводы, ГДЗ, учебное видео — все на www.freestudio21.com – скачай и наслаждайся =============================================================== ЧАСТЬ 4 НЕ БУДЬ РАВНОДУШНЫМ К ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ! №1 с.110 послушайте и прочтите Лили: Позвольте представить Фиону Браун, американскую студентку, изучающую биологию. Она участник...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Юргинский технологический институт Направление подготовки: 280700 Т...»

«ПТИЦЫН Леонид Романович Метаболическая инженерия штаммов Escherichia coli – биосенсоров, продуцентов цитокинов, факторов роста и низкомолекулярных веществ. 03.01.03 – молекулярная биология ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степ...»

«МОУ Барсовская средняя общеобразовательная школа ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ ШКОЛЫ. Авторы: Комракова Ксения, 11 класс. Калинкина Ирина, 11 класс. Руководитель: Комарова Оксана Александровна учитель химии Содержание. Стр. Содержание....»

«Экосистемы, их оптимизация и охрана. 2014. Вып. 10. С. 68–76. УДК 582.594.2:[581.46+581.5] (477.75) ОСОБЕННОСТИ АНТЭКОЛОГИИ ЯТРЫШНИКА ПРОВАНСКОГО (ORCHIS PROVINCIALIS, ORCHIDACEAE) В КРЫМУ: ФЕНОЛОГИЯ, ПРОСТРАНСТВЕННОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ, МОРФОМЕТРИЯ ЦВЕТКОВ И СОЦВЕТИЙ Сволынский...»

«Пояснительная записка Рабочая программа по биологии ориентирована на учащихся 11 класса, изучающих биологию на профильном уровне, разработана на основе следующих документов: Федерального компонента государств...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Кемеровский государственный университет Биологический факультет Рабочая программа дисциплины ИЗБРАННЫЕ ГЛАВЫ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ Направление подготовки 05.03.01 Геология Направленно...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.