WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

Pages:   || 2 |

«Липиды мицелиальных грибов как основа для создания биодизельного топлива ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФГБУН Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН

Лаборатория экспериментальной микологии

На правах рукописи

Ивашечкин Алексей Александрович

Липиды мицелиальных грибов

как основа для создания биодизельного топлива

03.02.03 - микробиология

03.01.06 – биотехнология

(в том числе бионанотехнологии)

Диссертационная работа на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Феофилова Елена Петровна,

проф., д.б.н., засл. деятель науки РФ Москва Оглавление

1. Введение

1.1. Актуальность темы…………………………………………………

1.2. Степень разработанности проблемы…………………………….

1.3. Цели и задачи исследования……………………………………..

1.4. Научная новизна…………………………………………………….

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы………………

1.6. Место проведения работы……………………………………………..

1.7. Объем и структура диссертации……………………………………..

1.8. Апробация работы………………………………………………………

1.9. Благодарности………………………………………………………….

1.10. Список публикаций по теме исследования…………………………

1.11. Положения, выносимые на защиту…………………………………

1.12. Обзор литературы……………………………………………………



2. Экспериментальная часть……………………………………………….

2.1. Объект и методы исследования………………………………………

2.2. Результаты……………………………………………………………….

Глава 1.

Скрининг олеагенных штаммов грибов и выбор наиболее активного продуцента липидов … Определение состава и содержания жирных кислот липидов у представителей р.

Cunninghamella.

Изучение состава липидов гомо- и гетероталличных штаммов C.

I) japonica ……… Глава 2.

Основные характеристики биодизеля на основе липидов C. japonica….

Глава 3.

Оптимизация среды выращивания с целью удешевления конечного продукта:….

Замена источника азота………………………………………………..

I) Замена источника углерода…………………………………………..

II) Использование побочных продуктов производств………………..

III) IV) Подходы к использованию лигнина……………………………..

Глава 4.

Оптимизация получения спорового посевного материала…….

Глава 5.

Улучшение экологии производственного процесса…………

в) Обсуждение……………………………………………………………..

г) Выводы………………………………………………………………… Заключение…………………………………………………………………..

3.

Список цитируемой литературы…………………………………………..

4.

Приложения……………………………………………………………….

5.

Список сокращений и условных обозначений………………………… 6.

1. Введение Данная диссертационная работа посвящена проблеме замены ископаемых исчерпаемых источников энергии на возобновляемое биотопливо.

Различают три главных вида биотоплив:

Твердые (дрова и топливные гранулы) Жидкие (биометанол, биоэтанол, биобутанол, диметиловый эфир, биодизельное топливо) Газообразные (биогаз, биоводород, метан) В данной работе непосредственное внимание будет уделено биодизельному топливу второго и третьего поколения, как топливу наиболее подходящему как по физико-химическим особенностям, так и позволяющему попутно решать проблемы утилизации отходов производств или получения побочных продуктов.





Биодизельное топливо (биодизель) представляет собой смесь моноалкиловых (чаще всего метиловых или этиловых) эфиров жирных кислот, полученных при трансэтерификации возобновляемых биологических ресурсов.

(Krawczyk, 1996).

Традиционно источниками для получения биодизеля служат масличные культуры и животные жиры, так называемые биотоплива первого поколения.

Однако использование этих источников сырья приводит к истощению почв, повышении цен на продукты питания, поэтому в последние 10-15 лет все больше внимания стали уделять таким продуцентам, как микроорганизмы: водоросли, геноинженерные штаммы E.coli, дрожжи (Antoni et al., 2007; Qiang et. al., 2008), мицелиальные грибы.

По сравнению с другими возможными продуцентами биодизельного топлива мицелиальные грибы имеют ряд преимуществ:

Липиды грибов почти не отличаются по составу основных жирных 1.

кислот от липидов высших растений, которые на сегодняшний день являются главными продуцентами биодизеля.

Мицелиальные грибы обладают одной из наибольших скоростей 2.

накопления биомассы, что возможно благодаря наличию апикального роста.

Процесс культивирования грибов лучше отработан с 3.

биотехнологической точки зрения, нежели выращивание водорослей, особенно, в высоких широтах, и способен к большему масштабированию, чем выращивание растений.

Выход продукта не зависит от сезонных колебаний температуры и 4.

величины посевных площадей.

Возможно круглогодичное получение продукта.

5.

Имеется возможность варьирования ацильных цепей липидов при 6.

помощи изменения параметров среды и других факторов.

–  –  –

Более ста лет назад общество добровольно поставило себя в нефтяную зависимость, и с каждым годом все большее обсуждение вызывает теория “пика нефти”, предложенная в 1956 году американским геофизиком Кингом Хаббертом (1), согласно которой предсказывалось, что добыча нефти в материковой части США достигнет пика между 1965 и 1970; и что мировая добыча достигнет пика в 2000 г. Добыча нефти в США достигла максимума в 1971 (2). И хотя модель Хабберта не предсказала наступление пика мировой нефтедобычи, возможно изза нефтяных эмбарго ОПЕК 1973 и 1979 годов, специалисты International Energy Agency (IEA) прогнозируют наступление нефтяного пика к 2030 году (3).

По оценкам разных экспертов объемы разведанных запасов нефти оцениваются величиной от 1,2 трлн. баррелей1 до 4,5 трлн. баррелей углеводородного сырья. Данные различия объясняются тем что, во-первых, сведения такого рода относятся к государственной тайне, а во-вторых - слишком разные мнения существуют у ученых. Так, по оценке американского геологоразведочного агентства USGS, запасы нефти в мире достигают 3 трлн.

баррелей. Сюда входят как уже используемые ресурсы, так и остающиеся на будущее, как уже разведанные, так и неразведанные запасы. USGS помещает эти 3 трлн. баррелей в "вилку" между 2,5 и 3,9 трлн. баррелей (4). Для сравнения: со времени начала эксплуатации нефтяных ресурсов человечество уже добыло и потребило в общей сложности около 0,9 трлн. баррелей.

Многочисленные аналитики, учитывая данные по разведанным и предполагаемым запасам нефти, а также данные по росту потребления энергии, сходятся во мнении, что нынешних запасов нефти хватит на срок от 30 до 60 лет.

Причем в отдельных странах соотношение “запасы/добыча” может сильно отличаться, так, например, “резервная жизнь” Венесуэлы составляет больше 200 лет, для Ирака – 100-120 лет, для США – 10 – 15 лет (5).

Истощение запасов горючих ископаемых вынуждает искать пути использования возобновляемых источников энергии, таких как солнечная энергия, энергия ветра, волн, приливно-отливных течений, процессов термоядерного синтеза, а также использование биологического сырья.

Широкое распространение в Европе получил биодизель – смесь моноалкиловых эфиров жирных кислот – полученный из рапсового масла. Но стоимость такого биотоплива сейчас в 2 раза выше, чем минерального дизельного топлива.

Поэтому особую актуальность приобретает проблема поиска подходящего олеагенного продуцента и создание экономически конкурентоспособной биотехнологии получения биодизельного топлива. В последнее время создание такой биотехнологии все теснее связывают с проблемой биоконверсии лигнина, в т.ч. и мицелиальными грибами.

В настоящее время все больше внимания уделяется и экологическому аспекту использования биотоплива. С точки зрения баланса углерода биотопливо является углерод-нейтральным, т.е. в результате его сгорания в атмосферу возвращается столько углерода, сколько было потрачено на образование биомассы, переработанной в топливо (Mathews, 2008).

Таким образом, разработка проблемы получения биотоплива, в частности, дизельного, является актуальной проблемой современной биотехнологии.

–  –  –

История использования биодизельного топлива.

Биотопливо известно человечеству со времен открытия огня. Дерево было первым типом биотоплива, которое стал использовать человек для приготовления пищи и обогрева. Этот тип топлива использовался задолго до открытия ископаемых видов топлива. Оливковое масло и животный жир использовали в светильниках задолго до н.э. по всему Средиземноморью.

(Sussman, 1983).

В ХХ веке впервые в сознании людей появилась мысль о том, что мировые запасы нефти и газа могут быть исчерпаны, и следует заранее искать возобновляемые источники энергии. В начале XXI века эта мысль стала уже реальной проблемой, и развитие работ в этом направлении стали также значительно стимулировать наблюдения о том, что интенсивное использование нефти и газа являются факторами, приводящими к резкому потеплению (« парниковый эффект») и загрязнению окружающей среды, что может стать причиной мировой катастрофы. Таким образом, возникла проблема поиска иных, альтернативных традиционным, источников энергии и топлива, которые были бы регенерируемыми и экологически безопасными.

Первую попытку использования масел, полученных из растительных источников, предпринял изобретатель двигателя, впоследствии названного его именем, Рудольф Дизель. В 1890 г. он развил теорию «экономичного термического двигателя», который, благодаря сильному сжатию в цилиндрах, значительно улучшает свою эффективность. Дизельный двигатель был разработан как замена неэффективному (КПД~10-12%), громоздкому, а иногда и опасному паровому двигателю. С самого начала проектирования двигателя была возможность использования различных источников энергии, от керосина до угольной пыли.

Ранние эксперименты, проводимые Дизелем по заказу французского правительства, были направлены на выяснение возможности использования чистых растительных масел в качестве топлива, что было важно в отдаленных африканских колониях, где ископаемое топливо не всегда было доступно все время. Опытный образец двигателя, который демонстрировался на Международной выставке 1900 г. в Париже и получивший Гран-при, работал на арахисовом масле (Shay, 1993).

Рудольф Дизель считал, что превращение биомассы в топливо для его двигателя станет реальной перспективой. В 1911 г. он сказал “Дизельный двигатель может использовать растительные масла и значительно помогать развитию сельского хозяйства в тех странах, где он используется”, а в 1912 г.

в своей речи в Технологическом Институте Великобритании отметил:

“Использование растительных масел в качестве топлива для машин может казаться сегодня несущественным, но такие масла, со временем, могут стать столь же важны, как продукты угля и нефти сегодня” (Knothe, 2001).

В Америке же в период с 1890х до 1920х годов работами по созданию дизельных двигателей и продвижению топлива, полученного из биологического сырья, занимались Адольф Буш и Клесси Камминс.

Но вследствие открытия месторождений нефти в Техасе и Пенсильвании и быстрого развития нефтедобывающей промышленности во всем мире, цены на ископаемое топливо упали, и идея использования растительных масел в качестве источника энергии на какое-то время потеряла свою актуальность.

Биодизельное топливо в современном понимании данного термина появилось в 1930х годах в Бельгии. Тогда возник интерес в разделении растительных масел на жирные кислоты и глицерин, который использовался, в частности, для получения взрывчатых веществ. В 1937 г. Шаванн получил бельгийский патент на способ получения этиловых эфиров пальмового масла и предложил использовать их в качестве замены дизельному топливу (Chavanne, 1937). А уже в 1938 г. первый автобус на биодизеле, полученном из пальмового масла, совершил маршрут из Брюсселя в Лёвен (Chavanne, 1942).

К развитию этой темы вернулись в некоторых странах, в частности, Аргентине, Бразилии, Индии, Китае и Японии, во время второй мировой войны, когда поставки топлива резко сократились, и возникла необходимость замены ископаемому топливу (Ma, Hanna, 1999). Например, в Бразилии во время войны был запрещен экспорт хлопкового масла, которое могло быть использовано в качестве замены дизельному топливу (Anonymous, 1943). В Китае масло из тунга (Aleurites) и других видов растений использовалось для получения заменителей газолина и керосина (Cheng, 1945.; Chang, Wan, 1947). В Индии проводились исследования по получению дизельного топлива из различных растительных масел (Chowhury et al., 1942). Однако с окончанием войны и возобновлением поставок данная идея была забыта.

В 1973-1979 годах разразился нефтяной кризис и Организация странэкспортеров нефти (Organization of the Petroleum-Exporting Countries; OPEC) наложила эмбарго на поставки нефти в страны не входящие в OPEC. Также на добычу нефти негативно повлияла Иранская революция 1978-1979 годов.

В 1978 году при поддержке Организации экономического сотрудничества и развития (Organization for Economic Co-operation and OECD) было основано Международное энергетическое Development;

агентство по биоэнергии (International Energy Agency (IEA) Bioenergy), главной целью которого являлось развитие сотрудничества и информационного обмена между странами по вопросам разработки, развития и внедрения биоэнергетических исследований. В 2007 г. при ООН был основан Международный форум по биотопливу в который вошли Бразилия, Китай, Индия, Южная Африка, США и Европейский Союз (Press Conference Launching International Biofuels Forum, 2007).

К началу двадцать первого века идея использования биотоплива становится популярной (Hill, 2000) по многим причинам. По мере истощения запасов нефти и газа вопрос энергетической безопасности приобретает все большую значимость для развития биотопливной индустрии, хотя при нынешней технологии биотопливо лишь весьма незначительно удовлетворяет потребность в моторном топливе.

Дело в том, что пока объем внутреннего производства сырьевых культур покрывает малую толику потребности в транспортном топливе, но есть несколько исключений:

например, этанол в Бразилии. (Доклад о мировом развитии, 2008). Также вносят свою лепту колебания цены на нефть, используемые часто как средство давления и общая политическая нестабильность. В настоящее время все больше внимания уделяется и экологическому аспекту использования биотоплива: поскольку с каждым днем появляется все больше доказательств того, что интенсивное использование нефти и газа являются факторами, приводящими к резкому потеплению (« парниковый эффект») и загрязнению окружающей среды. С учетом сказанного очень существенным является тот факт, что любое топливо является углерод-нейтральным.

Цели и задачи исследования 1.3.

Цель работы:

1. Разработать способ получения биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов.

Задачи:

1. Учитывая собственные и литературные данные о липогенной активности мицелиальных грибов, провести скрининг штаммов с целью отбора наиболее продуктивного организма-продуцента.

2. Определить основные характеристики биодизельного топлива полученного из липидов организма-продуцента и их соответствие международным нормам.

3. Оптимизировать схему получения биодизельного топлива в плане снижения себестоимости его производства:

а) Выяснить возможность замены источников азота и углерода более дешевыми веществами и отходами различных производств.

б) Оптимизировать схему получения посевного материала путем: изучения его олеагенной способности и связи этого процесса с липогенной активностью мицелия; установить активаторы прорастания спор организмапродуцента для интенсификации процесса.

в) Обеспечить экологическую безопасность процесса экстракции липидов путем замены растворителей на сверхкритический углекислый газ.

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая ценность проведенных исследований состоит в установлении новых закономерностей в области липидообразования:

1) установлена связь этого процесса со стадиями цитодифференцировки, в частности, с особенностями спорообразования, с возрастом спор, количеством и составом их липидов, установлена прямая зависимость между содержанием липидов в спорах и выросшем из них мицелии.

2) выяснено действие ингибиторов и стимуляторов прорастания спор, установлен тип покоя спор C. japonica ВКМ F-1204(-) и скорость их прорастания.

3) впервые изучено влияние такого продукта вторичного метаболизма как трегалоза на процесс липидообразования. Установлен концентрационный эффект действия экзогенной трегалозы на рост, липогенную активность и состав липидов C. japonica.

4) впервые получены данные, свидетельствующие о ряде отличий грибов рода Cunninghamella от других мукоровых грибов в отношении липидообразования гетероталличных штаммов, в частности способность (+) и (–) штаммов C. japonica синтезировать линоленовую кислоту (C18:3), что, вероятно, может свидетельствовать о другом типе гормональной регуляции полового процесса.

С практических позиций новизна настоящей работы определяется следующим:

1) найден активный продуцент липидов, способный образовывать до 50% липидов и предложен способ получения биодизельного топлива.

2) установлены основные характеристики биодизеля полученного на основе липидов организма-продуцента и установлена их идентичность принятым международным стандартам.

3) для оптимизации среды выращивания с целью снижения ее стоимости апробирована замена источника азота на легкодоступный и дешевый нитрат аммония, а глюкоза заменена на ряд отходов других производств, в том числе, отход от производства биодизеля – глицерин.

4) Обсуждаются подходы к использованию лигнина. Впервые исследуется роль антиоксидантов в биодеградации лигнина в сравнении с грибами неспособными использовать лигнин и высказывается предположение о смене основного мессенджера при росте гриба на лигнине.

5) на основании теоретических исследований найдены новые подходы к подготовке посевного материала, предложено внесение 0,5% глюкозы для улучшения прорастания спор.

6) впервые изучено влияние экзогенной трегалозы при внесении ее в среду выращивания на рост, липидный состав гриба и выход конечных продуктов.

7) для создания экологически чистого производства рекомендуется заменить извлечение липидов растворителями, в т.ч., канцерогенным хлороформом, на сверхкритический CO2.

8) получен патент на изобретение RUS 2468077 “Способ получения липидов” 11.02.2011г.

9) разработана принципиальная схема получения биодизельного топлива на основе липидов C. japonica, позволяющая получать одновременно с этим глицерин и ряд противоожоговых препаратов на основе обезжиренных клеточных стенок.

1.5. Место проведения работы

Работа была проведена в лаборатории экспериментальной микологии ФГБУН института микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН с октября 2011 г.

по сентябрь 2014 г.

–  –  –

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, __ глав собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ___ источников, в том числе __ иностранных источников Работа выполнена на __ страницах машинописного текста, имеет иллюстрированное приложение с __ таблицами и __ рисунками.

1.7. Апробация работы

Основные результаты работы были представлены в виде докладов и публикации тезисов на научных конференциях и молодежных научных школах, среди которых: 7ая всероссийская научная молодежная школа с международным участием “Возобновляемые источники энергии” (Москва, 2010 г.), XXIII международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 7-10 февраля 2011г.), конкурс молодежных инновационных научно-технических проектов “УМНИК – конкурсе научных работ Института микробиологии им. С.Н.

2013”, Виноградского РАН 2014 г.

Диссертационная работа апробирована ______ на совместном заседании _____.

1.8. Благодарности

Феофиловой Елене Петровне, Сергеевой Яне Эдуардовне, Андрияновой Диане Алексеевне, Галаниной Людмиле Алексеевне, Меморской Анне Сергеевне, Маргарите Дмитриевне, Лунину Валерию Васильевичу, Богдану Виктору Игнатьевичу, Кочкиной Галине Александровне.

–  –  –

По теме диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ, в том числе 6 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России и 7 тезисов, получен патент на изобретение.

–  –  –

1. Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Меморская А.С., Ивашечкин А.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Новые биотехнологии получения биодизеля на основе липидов мицелиальных грибов, материалы Московской международной научно-практической конференции “Биотехнология:

экология крупных городов” (Москва, 15-17 марта, 2010 г.), стр. 295-296.

2. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Биотехнология получения нового биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Материалы седьмой всероссийской научной молодежной школы с международным участием “Возобновляемые источники энергии” (24-26 ноября 2010 года, Москва), стр. 168-171.

3. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Новая биотехнология получения биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII международной зимней молодежной научной школы “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (7-10 февраля 2011 г., Москва), стр. 147.

4. Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Ивашечкин А.А., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Производство биодизеля на основе инновационной биотехнологии и получение активного посевного материала, Материали за VII международна научна прктична конференция “Найновите постижения на европейската наука - 2011” (17-25 юни 2011), Том 32. Ветеринарна наука. Биологии, София “Бял ГРАД-БГ” ООД, 2011, стр. 41-43.

5. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Богдан В.И., Лунин В.В., Феофилова Е.П., Получение нового биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Успехи медицинской микологии, по ред. Сергеева Ю.В., т.XII, Материалы VI всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, Национальная академия микологии, 2014

6. Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Богдан В.И., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Влияние лигнина и кислорода на рост и липидообразование Lentinus tigrinus,, Успехи медицинской микологии, по ред. Сергеева Ю.В., т.XII, Материалы VI всероссийского конгресса по медицинской микологии, Москва, Национальная академия микологии, 2014

7. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Изучение закономерностей липидообразования у мицелиальных грибов, как основа для создания новой отрасли биотехнологии – микробной олеобиотехнологии, Липидология – наука XXI века, I международная научно-практическая Интернет-конференция: материалы конф. (Казань, 26 ноября 2013 г.), 2014

Научные статьи в рецензируемых журналах:

1. Феофилова Е.П., Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Биодизельное топливо:

состав, получение, продуценты, современная биотехнология (обзор), Прикладная биохимия и микробиология, 2010, т. 46, №4, с. 405-415.

2. Феофилова Е.П., Ивашечкин А.А., Алехин А.И., Сергеева Я.Э., Споры грибов: покой, прорастание, химический состав и значение для биотехнологии (обзор), Прикладная биохимия и микробиология, 2012, т.48, №1, с. 5-17

3. Лунин В.В., Сергеева Я.Э., Галанина Л.А., Мысякина И.С., Ивашечкин А.А., Богдан В.И., Феофилова Е.П., Получение биодизельного топлива на основе липидов мицелиальных грибов, Прикладная биохимия и микробиология, 2013, т. 49, №1, с. 1-8.

4. Богдан В.И., Коклин А.Е., Красовский В.Г., Лунин В.В., Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Феофилова Е.П., Получение метиловых эфиров жирных кислот – основы биодизельного топлива – из липидов мицелиальных грибов, экстрагированных сверхкритическим CO2, Сверхкритические флюиды: теория и практика, 2013, т.8, №4, стр. 46-52

5. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Богдан В.И., Сорокин В.В., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П. Влияние лигнина и кислорода на рост и липидообразование Прикладная биохимия и Lentinus tigrinus, микробиология, 2014, т. 50, № 3, с. 318-323.

6. Ивашечкин А.А., Сергеева Я.Э., Лунин В.В., Мысякина И.С., Феофилова Е.П., Влияние антиоксиданта на рост и липидообразование базидиомицетного гриба Lenthinus tigrinus, растущего на среде с лигнослуфонатом. В печати.

–  –  –

1. Сергеева Я.Э., Ивашечкин А.А., Алехин А.И., Андриянова Д.А., Мысякина И.С., Гальченко В.Ф., Галанина Л.А., Феофилова Е.П., Лунин В.В., Патент на изобретение RUS 2468077 Способ получения липидов 11.02.2011

1.10. Положения, выносимые на защиту В качестве продуцента для создания биотехнологии производства 1) биодизельного топлива найден олеагенный штамм, относящийся к пор. Mucorales, Cunninghamella japonica F-1204, накапливающий до 50% липидов от сухой биомассы, основной частью которых являются триацилглицериды.

Обнаружены отличия в липидном составе гетероталличных штаммов р.

2) Cunninghamella: все гетероталличные штаммы Cunninghamella синтезировали линоленовую кислоту, при этом содержание данной кислоты в липидах (+) штаммов превышало соответствующий показатель (–) штаммов более чем в 2 раза. Таким образом, впервые показано, что существуют различия в метаболизме липидов у грибов порядка Mucorales. В отличие от других Choanephoraceae, у представителей рода Cunninghamella не только не увеличивался выход нейтральных липидов при копуляции разнополых штаммов, но (+) и (–) штаммы имели практически идентичный состав жирных кислот.

Проведено сравнение липидного и жирнокислотного состава 3) и Brassica napus. Получены образцы биодизеля и Cunninghamella japonica определены его основные характеристики. Биодизель, полученный из липидов мицелиального гриба, соответствует принятым международным стандартам.

Проведена работа по оптимизации среды культивирования, в частности 4) источник азота – аспарагин – замене на более дешевый и доступный нитрат аммония без потери качества продукта, исследованы различные отходы в качестве замены источника углерода, проведена работа по оптимизации посевного материала: установлено, что использование 5 сут спор обеспечивало наиболее высокий выход липидов.

Показано, что процесс биодеградации лигнина грибами белой гнили можно 5) модифицировать аэрацией среды культивирования. Опыты с антиоксидантами показали, что начальные этапы разложения лигнина связаны с процессами СРО.

Предложено использовать для извлечения липидов критический CO2 с 6) целью создания экологически чистой биотехнологии получения биодизеля.

1.11. Обзор литературы Влияние физико-химических факторов в процессе культивирования на образование липидов и их жирнокислотный состав.

При рассмотрении микроорганизмов в качестве потенциальных источников липидов необходимо принять во внимание тот факт, что на накопление липидов, на их жирнокислотный состав и на распределение жирных кислот в липидных фракциях влияет ряд различных факторов. Количество липидов и их состав у грибов зависят от стадии роста: процесс образования липидов совпадает по времени с накоплением биомассы и заканчивается в стационарныю фазу роста культуры, после чего содержание липидов начинает уменьшаться. На рис. _ представлена схема накопления липидов у микроорганизмов, которая является типичной для олеагенных видов дрожжей и грибов, и показывает, что накопление липидов в биомассе не начинается до тех пор, пока не истощаются запасы азота.

Одним из важных факторов, определяющих процесс липидообразования, является температура культивирования. Для каждого гриба существует температурный оптимум развития культуры. Однако он не всегда соответствует наиболее интенсивному образования липидов. Обычно повышение температуры в определенных пределах сопровождается увеличением общего количества липидов (Wassef, 1977).

Кроме того, для мицелиальных грибов наблюдается прямая зависимость между степенью ненасыщенности липидов и температурой культивирования.. Так культивирование при пониженных температурах приводит к увеличению активности __12 и __ 15 десатураз, ответственных за синтех ПНЖК.

Увеличение температуры приводит к снижению относительного содержания ПНЖК, и сопровождается увеличением доли C18:1 C18:2. Температура влияет и на фракционный состав как нейтральных, так и полярных лпидов, что указывает на наличие механизма адаптации к низким температурам (Феофилоа и др., 1996).

Как фракционный состав липидов, так и содержание отдельных ЖК изменяется при синтезе de novo в зависимости от качественного состава питательной среды на которой был выращен микроорганизм (Rose, 1989).

Важной характеристикой является соотношение углерода и азота (C/N) в среде культивирования (Галанина и др., 1989, Rose, 1989, Stredanska, 1993). Как уже отмечалось, накопление липидов преимущественно происходит в конечных фазах роста культуры, когда количество азота в среде культивирования очень мало или данный компонент питательной среды почти исчерпан. Низкое содержание азота в среде способствует синтезу липидов, приводя у ряда мицелиальных грибов к преимущественному синтезу ненасыщенных ЖК.

Следовательно, высокое значиние показателя соотношения C/N в среде способствует усилению синтеза липидов.

Также следует подчеркнуть, что фракционный состав липидов изменяется в зависимости от типа соединений азота в питательной среде. Согласно (Stredanska, 1993), еслив среде азот присутствует в ивде нитратов, то увеличивается содержание полярных липидов, тогда как доля ТАГ уменьшается. Надо отметить, что для каждого микроорганизма характерны специфические требования к форме и содержанию азота в среде. Среди наиболее распространенных соединений азота, используемых в качестве компонента питательной среды, можно назвать дрожжевой экстракт, нитрат натрия, хлорид аммония, мочевина, нитрат аммония, сульфат аммония.

Характеристика биодизельного топлива.

Биодизельное топливо (биодизель) представляет собой смесь моноалкиловых (чаще всего метиловых или этиловых) эфиров жирных кислот, полученных при трансэтерификации возобновляемых биологических ресурсов.

[Krawczyk, 1996].

Основными компонентами растительных и животных жиров являются триацилглицерины (ТАГ) (до 80%). При получении биодизельного топлива происходит реакция этерификации ТАГ со спиртом (чаще всего используются метанол и этанол) в присутствии катализатора. В результате из одной молекулы ТАГ образуются три молекулы сложных эфиров жирных кислот и одна молекула глицерина (рис.1). Реакция протекает поэтапно: сначала триглицериды последовательно превращаются в ди-, моноглицериды, и, в результате, в глицерин. Процесс проводится при нагревании и атмосферном давлении.

Параметры протекания реакции зависят от состава исходного сырья. Массовый выход метиловых эфиров, т.е. биодизеля, превышает 98% [Fukuda et al., 2001]. В качестве катализаторов реакции применяются кислоты, щелочи [Fukuda et al., 2001; Meher et al., 2006], в последнее время большое внимание уделяется использованию липаз, в т.ч. грибного происхождения [Enoch, Masashiro 2005;

Funda et al., 2007; Masaru et al., 2007; Sulaiman Al-Zuhair, 2007].

Побочным продуктом при производстве биодизеля является глицерин, который после очистки может использоваться в парфюмерии, медицине, при микробиологическом синтезе этанола, янтарной кислоты, 1,3-пропандиола [Дебабов, 2008]. Также разрабатываются методы получения из глицерина бутанола, пропионовой кислоты [Biebl, 2001; Lee et al., 2001]. Глицерин может использоваться дрожжеподобным организмом Cryptococcus curvatus [Meesters et al., 1996] и представителями рода Mortierella [Ching, 2008] в качестве субстрата для роста и накопления липидов. Что особенно важно, представители рода Morteirella, в частности M. alpina, используются при производстве арахидоновой кислоты C20:4, относящейся к разряду незаменимых и входящей в состав витамина F, в промышленных масштабах. Также разрабатываются методы получения из глицерина, образовавшегося в ходе получения биодизеля, и ацетона, полученного в результате микробного синтеза, 2,2-метил-1,3-диокслана-4-ил-метанола (www.nano.msu.ru) - присадки к топливу, повышающей его октановое число на 10единиц (рис.3). Выход продукта достигает 95%.

Рисунок 1. Схема получения биодизельного топлива.

R1-R3 – ацильные цепи, R=CH3, реже - C2H5

Биодизельное топливо характеризуется рядом параметров [Bajpai, Tyagi, 2006]:

Поверхностное натяжение Вязкость Химическая стабильность, йодное число Химическая стабильность характеризуется показателем индукционного периода – временем до начала окисления топлива при определенных условиях испытания. Чем выше индукционный период, тем выше стойкость топлива к окислению. Также она связана с йодным числом, которое является показателем содержания в топливе непредельных углеводородов.

Температура кристаллизации Цетановое число Температура воспламенения (наиболее низкая температура жидкости, при которой возможно воспламенение находящейся над ней смеси её паров с воздухом) Удельный вес Теплотворная способность Реологические свойства Данные характеристики регламентируются в большинстве стран принятыми стандартами (европейские EN 14213 и EN14214, немецкий DIN 51606, американский ASTM В 6751 и др.) [Knothe, 2006].

3. Преимущества и недостатки в сравнении с дизельным топливом.

Биодизельное топливо обладает рядом преимуществ по сравнению с минеральным дизельным топливом [The Biodiesel Handbook, 2005.]:

1. Биодизель, как и любое биотопливо, является возобновляемым источником энергии, в отличие от нефти, запасы которой конечны, как и запасы других ископаемых топлив.

2. Биодизель имеет более высокую по сравнению с ископаемыми топливами температуру воспламенения, что делает его сравнительно безопасным топливом.

3. Оно не оказывает токсичного действия на окружающую среду и легко разлагается в естественных условиях. Так при попадании в почву или воду за 28 дней под действием микроорганизмов происходит разложение 99% биодизеля.

4. В составе выхлопных газов ископаемого топлива содержится более 300 соединений, наносящих вред окружающей среде [Топлива, смазочные материалы, технические жидкости, 1999]. К ним относятся углеводороды различного состава, моно- и диоксид углерода, оксиды азота, серный и сернистый ангидриды. Биодизель по сравнению с обычным дизельным топливом характеризуется значительно меньшим содержанием моно- и диоксида углерода, полициклических ароматических углеводородов, аэрозоля в выхлопе. Также биодизельное топливо отличается значительно меньшим содержанием серы (0,0001%), что не только обеспечивает меньшую долю токсических веществ в выхлопе, но также и позволяет во время работы двигателя обеспечивать смазку подвижных частей, тем самым, продлевая срок службы двигателя [27]. Также уменьшение содержания вредных веществ происходит за счет большего процентного содержания кислорода, а, значит, и более полного сгорания топлива.

–  –  –

1. Высокая вязкость и поверхностное натяжение биодизельного топлива по сравнению с дизельным топливом могут приводить к образованию бльших по размерам капель, что может служить причиной проблем связанных с системой впрыска топлива. При этерификации с использованием спиртов с малой длиной углеродной цепи образуется биодизель с вязкостью близкой к таковой натурального дизельного топлива.

2. Окислительная устойчивость является одной из главных проблем биодизельного топлива. По сравнению с дизелем биодизельное топливо более склонно к окислению. Окислительная устойчивость зависит от ряда факторов:

присутствия воздуха, тепла, металлов, пероксидов, света. Также этот параметр коррелирует со степенью насыщенности углеводородной цепи, а, следовательно, и с таким параметром, как йодное число.

3. Биодизельное топливо имеет меньшую температуру кристаллизации по сравнению с дизельным топливом, что может приводить замерзанию топлива, и необходимости подогрева топлива идущего в топливный насос.

Особенности состава основных жирных кислот разных продуцентов биодизельного топлива.

Масличные растения.

Сырьём для производства биодизеля служат липиды масличных растений.

Основными возделываемыми культурами являются рапс (ЕС), подсолнечник (Франция, Италия), соя (США, Бразилия, страны Африки), канола разновидность рапса (Канада), пальмовое масло (Индонезия, Малайзия), ятрофа (Jatropha curcas) (Индия, страны Африки) (Дебабов, 2008).

Как видно из табл.1 наибольшей урожайностью обладает масличная пальма. В странах Юго-Восточной Азии, основном регионе ее возделывания, существуют обширные программы по производству биодизеля. Хотя производство пока еще не развило весь потенциал, в 2006г. было произведено примерно 200 тыс.т. топлива (Burill, 2006).

Основными жирными кислотами, входящими в состав липидов масличных культур являются пальмитиновая C16:0, олеиновая C18:1 и линолевая C18:2 кислоты (табл.2).

На данный момент существует два противоположных мнения о том, к каким социально-экономическим последствиям может привести использование с/х масличных культур в качестве продуцентов биодизеля. С одной стороны, выращивание таких культур позволит ввести в оборот неиспользуемые посевные площади (Воздействие биотоплива на окружающую среду, 2008). С другой стороны, во многих регионах мира почти иссяк потенциал расширения посевных площадей, и таким образом, интенсивное выращивание масличных растений может сдвинуть соотношение посевных площадей не в сторону продовольственных культур. В результате развитие биотопливной индустрии может стать причиной повышения цен на продовольствие. Также изменение соотношения “площади, отводимые под биодизель”/“площади, отводимые под с/х культуры” может стать причиной увеличения пастбищной нагрузки на неприспособленные для этого территории (Доклад о мировом развитии, 2008).

Помимо роста цен на продовольствие эксперты прогнозируют усиление конкуренции за пользование земельными и водными ресурсами и возможное сведение лесов.

Одной из важных особенностей возделывания масличных культур является зависимость урожая от сезонных изменений климата. Помимо названых проблем существует необходимость защиты посевов от вредителей, что, в свою очередь, приводит к использованию больших количеств химикатов.

В последние 10-15 лет все больше внимания уделяется таким продуцентам биодизеля, как микроорганизмы: водоросли, геноинженерные штаммы E.coli, дрожжи (Antoni et al., 2007; Qiang et. al., 2008). Помимо того, что триацилглицерины микроорганизмов сходны с таковыми высших растений, большое значение при промышленном производстве биодизеля имеет бльшая скорость роста (Meng et al., 2009).

–  –  –

Также как и другие организмы, некоторые виды бактерий в определенных условиях способны накапливать липиды до 80% от сухого веса (Mona et al., 2008).

В большинстве своем липидный состав бактерий заметно отличается от такового у других организмов. Преобладающими липидами у бактерий являются фосфолипиды (30-60%) и галактолипиды, в отличие от триацилглицеринов у эукариотических микроорганизмов. Лишь некоторые виды бактерий могут использоваться в качестве источника для производства биодизеля (Yi, Zheng, 2006). Способность бактерий накапливать часть липидов в клеточной оболочке создает трудности при их извлечении. Эти факты, а также малая продуктивность бактериальных организмов ограничивают их применение в производстве биодизельного топлива.

5.3. Автотрофные водоросли.

Катализатором для развития биотехнологических процессов получения биотоплива из микроводорослей послужил энергетический кризис 1970-х годов (8). С 1978 года по 1996 год по заказу Департамента Энергетики США проводились исследования водорослей, принадлежащих родам Chlamydomonas, Chlorella, Nannochloropsis, Navicula, Nannochloris, Nitzschia по программе «Aquatic Species Program» (A Look Back at the U.S. Department of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, 1998), в результате которых ученые пришли к выводу, что Калифорния, Гавайи и Нью-Мексико пригодны для промышленного культивирования водорослей в открытых водоемах. В течение 6 лет водоросли выращивались в прудах площадью 1000 м2. Урожайность достигала более 50 гр.

водорослей с 1 м2/день.

Содержание липидов в клетках большинства водорослей колеблется от 20 до 50% (табл. 3), но у некоторых видов может достигать до 80% от сухого веса (Metting, 1996; Spolaore et al., 2006).

Состав липидов также зависит от видовой принадлежности организма, в основном в составе липидов микроводорослей преобладают ненасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты:

пальмитолеиновая, олеиновая, линолевая и линоленовая, что отрицательно сказывается на окислительной устойчивости биодизеля полученного из таких масел.

Хотя на данный момент культивирование микроводорослей с целью получения биодизеля приобретает все бльшую популярность, у технологии еще остаются проблемы. Например, для культивирования водорослей лучше подходит жаркий климат, но требуется температурная регуляция при ночных перепадах температур. Также не исключена возможность заражения ферментеров посторонней микрофлорой (Chisti, 2007).

Кроме культивирования водорослей в открытых прудах существуют технологии выращивания водорослей в малых биореакторах, расположенных вблизи электростанций. Сбрасываемое ТЭЦ тепло способно покрыть до 77 % потребностей в тепле, необходимом для выращивания водорослей. Эта технология не требует жаркого климата, но необходимость использования проточных ферментеров и фотобиореакторов, увеличивает стоимость конечного продукта.

5.4. Гетеротрофные водоросли.

Помимо культивирования автотрофных водорослей для получения биодизеля могут быть использованы гетеротрофные водоросли, использующие органический источник углерода для роста и накопления масел (Qiang et al., 2008;

Ratledge, Wynn, 2002). Подобные организмы могут быть получены методами генной инженерии или являться разновидностями автотрофных организмов, но выращиваемых без доступа света. Например, содержание липидов в клетках геноинженерного штамма Chlorella protothecoides превышает таковое у автотрофного более чем в четыре раза (Miao, Wu, 2004). Поскольку для роста гетеротрофных видов не нужно освещение, то культивирование можно проводить в обычных ферментерах, а не фотобиореакторах.

Следует отметить, что в отличие от растительных масел, липиды микроводорослей богаты полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК, PUFA), т.е. кислотами, имеющими 2 двойных связей (табл. 4). Данный факт отражается на необходимости гидрогенации биодизеля, поскольку европейские стандарты EN14213 и EN 14214 ограничивают содержание ненасыщенных кислот, определяемое по величине йодного числа.

5.5. Дрожжи.

Среди дрожжей олеагенными штаммами считаются представители родов Lipomyces, Rhodoturula, Cryptococcus, Trichosporon.

В соответствующих условиях культивирования дрожжи способны накапливать до 50-76% липидов от сухой биомассы (Li et al., 2006; Kong et al., 2007) (табл. 7). У большинства видов дрожжей преобладающими ЖК являются пальмитиновая C16:0, олеиновая C18:1 и линолевая C18:2 (табл. 8). С помощью данных организмов можно получать ТАГ, сходные по составу срастительными маслами. Например, липидный состав Lipomyces starkeyi напоминает по составу пальмовое масло, Lipomyces lipofer – масло какао (Феофилова, 1991).

5.6. Мицелиальные грибы.

Идея использования мицелиальных грибов в качестве продуцентов липидов начала развиваться в начале прошлого века. В период первой мировой войны немецкие фирмы “Zellstoff-Fabrik Mannheim Waldhof” и “Henkel und Co” осуществили ряд попыток культивирования грибов, принадлежащих роду Fusarium, с целью получения жиров из биомассы (Ratledge, 1978). В 80-е годы прошлого столетия в СССР активно стали использовать в качестве продуцентов в биотехнологических процессах мицелиальные грибы и дрожжи.

Функционировали три завода по получению нейтрального липида – -каротина (в Краснодаре, Верхнеднепровске и Екатеринбурге) и был утвержден проект по получению из грибов липидов – заменителей растительных масел, который координировался Институтом биосинтеза белковых веществ (Синтезбелок).

По составу липидов мицелиальные грибы являются весьма гетерогенной группой. Содержание липидов в клетках грибов (табл. 5) и состав жирных кислот зависит от таксономического положения продуцента (табл. 6), его стадии развития, условий культивирования (Stahl, Klug, 1996), и может достигать до 86% от сухого веса (Meng et al., 2009). Основными компонентами липидной фракции грибов являются триацилглицериды, что особенно важно при производстве биодизеля. Мицелиальные грибы могут синтезировать насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с диной цепи от 10 до 24 углеродных атомов.

Преобладающими жирными кислотами у большинствавидов являются пальмитиновая C16:0, олеиновая C18:1 и линолевая C18:2 (табл. 6).

Наибольшей способностью к накоплению липидов, как видно из табл.5, обладают представители кл. Zygomycetes s.s., в частности, пор. Mucorales, причем 80-90% липидов составляет фракция ТАГ (Феофилова и др., 1991). Липидный состав низших мицелиальных грибов незначительно отличается от такового у масличных культур, традиционно использующихся для производства биодизеля (табл. 2, табл. 6).

Помимо высокого содержания липидов важным фактором является способность грибов к направленному росту, скорость которого может достигать 100 мкм/мин. Направленный рост и возможность перераспределения энергии между стареющими и растущими участками мицелия определяют самую высокую скорость накопления биомассы среди известных организмов. Такой параметр как продуктивность (количество липидов с единицы объема среды за сутки) у олеагенных (видов, способных накапливать липиды более 20% от сухого веса) (Ratledge, Wynn, 2002) грибов выше, чем у водорослей и бактерий.

Изменяя такие параметры как температуру, соотношение C:N в среде, можно варьировать строение ацильных цепей липидов. Так, низкое соотношение C:N способствует накоплению липидов, а уряда грибов приводит к преимущественному синтезу ненасыщенных ЖК (Дедюхина, 1969). Отсутствие в среде факторов роста (витаминов, некоторых аминокислот) способствует уменьшению содержания липидов (Prasad, 1985). Также на состав ЖК могут влиять специфические ингибиторы десатураз (Moreton, 1985), температура культивирования (Феофилова, Кузнецова1989), освещение (Полотебнова, Феофилова, 1988).

Возможность культивирования биомассы в ферментерах позволяет масштабировать этот процесс, и избавляет от необходимости использования потенциально плодородных земель. Важно и то, что выход продукта мало зависит от погодных и других случайных факторов. Возможность культивирования биомассы в обычных ферментерах, в отличие от водорослей, удешевляет процесс.

Также для уменьшения стоимости выходящего продукта в качестве компонентов питательной среды возможно использование производственных отходов, а также получение побочных продуктов: полисахаридов – хитина, хитин-глюканового комплекса, хитозана, глицерина (Сергеева и др., 2008). Важным отличием от культивирования водорослей являются разработанные для грибов подходы к хранению посевного материала и вывода его из состояния покоя.

Подытожим главные преимущества использования грибов в качестве продуцентов липидов:

Мицелиальные грибы обладают одной из наибольших скоростей накопления биомассы.

Процесс культивирования грибов лучше отработан с биотехнологической точки зрения, нежели выращивание водорослей, и способен к большему масштабированию, чем выращивание растений.

Выход продукта не зависит от сезонных колебаний температуры и величины посевных площадей, возможно круглогодичное получение продукта.

Имеется возможность варьирования ацильных цепей липидов при помощи изменения параметров среды и других факторов (изменение температуры, наличие факторов роста, соотношения C:N).

Современное биотехнологическое производство выдвигает ряд требований к организму – продуценту липидов (Биологические науки, 1991, №1):

1. Продуцент должен иметь высокое содержание липидов (не меньше 40%) в совокупности с высокой продуктивностью

2. Необходимость безотходной технологии получения липидов.

3. Большая часть липидов должна быть представлена триацилглицеринами.

4. Среды для ферментации должны быть дешевыми, не вызывающими потерю качества липидов.

Разработанные условия культивирования микроорганизмов в больших масштабах, способность к быстрому размножению, успехи в области генной инженерии и селекции – все эти критерии делают микроорганизмы наиболее подходящими продуцентами для промышленного получения липидов.

Возможны следующие пути оптимизации производства: скрининг потенциально олеагенных штаммов; последующий отбор штаммов, отличающихся наибольшей скоростью наращивания биомассы; внесение изменений путем сайт-направленного мутагенеза в ферменты, ответственные за метаболизм липидов; оптимизация условий культивирования; получение нужных побочных продуктов.

При использовании микроорганизмов, в частности мицелиальных грибов, в качестве продуцентов биодизеля возможно создание экологически чистого производства. Так, липиды, экстрагированные из биомассы, могут этерефицироваться с использованием липаз грибного происхождения; глицерин, полученный в результате той же реакции этерификации, может использоваться как в парфюмерии, медицине, так и как источник углерода для олеагенных микроорганизмов; хитин и хитин-глюкановый комплекс, полученные из обезжиренной биомассы могут использоваться для получения препаратов, помогающих в лечении ожогов и незаживающих ран (Феофилова и др., 1999);

Таким образом, на сегодняшний день наиболее перспективными продуцентами биодизельного топлива нам представляются мицелиальные грибы, в частности представители пор. Mucorales.

В настоящее время биотехнологии грибных производств имеют в качестве основной составляющей подготовку активного спорового посевного материала и разработку способов его сохранения для проведения целевых ферментаций. В современных опытно-промышленных регламентах (ОПР) обычно указывается скорость прорастания посевного материала и процент его всхожести, но практически до сих пор не приводятся данные о типе покоя спор, активаторах прорастания и возрастной активности спорового посевного материала. Между тем эти данные позволяют значительно увеличить выход конечного продукта. В последние годы в инновационной биотехнологии за рубежом все чаще используют активаторы прорастания спор или ингибиторы этого процесса, что позволяет более тонко управлять ферментационным процессом и влиять, таким образом, на его стоимость.

Полученные в этом направлении данные могут быть использованы для создания биотехнологии получения активного посевного материала.

Так, знание типа покоя спор, используемых в биотехнологическом процессе, позволяет судить о скорости их прорастания; определение соединений, стимулирующих выход из состояния покоя, дает возможность сократить время лаг-фазы, что может значительно удешевить процесс ферментации. Определение возраста спор, способных к более активному прорастанию, может влиять не только на время ферментации, но и на выход конечного продукта.

Воздействие на процесс прорастания как один из приемов биотехнологического производства.

Активация спор позволяет им интенсивнее прорастать и может быть вызвана присутствием химических активаторов или воздействие факторов среды (температуры, света). Процесс активации обратим до определенной стадии, после прохождения, которой прорастание уже необратимо. Следует обратить внимание на то, что популяция покоящихся спор гетерогенна. Часть спор может прорастать даже без активации, часть нуждается в активирующем воздействии и есть очень небольшая часть спор – “сверхпокоящиеся” споры – которые требуют особо длительной активации.

Прорастание спор зависит от типа их покоя. Экзогенно покоящиеся клетки прорастают достаточно быстро и для процесса набухания достаточно присутствие воды, причем некоторые грибы, например C. japonica, на таком же субстрате способны проходить и вторую фазу прорастания. Быстрота прорастания спор C. japonica обусловлена, видимо, двумя причинами: тем, что основным резервным веществом являются углеводы, и тем, что в составе углеводов присутствует не только дисахарид трегалоза, но и самый легко усвояемый моносахарид – глюкоза (Феофилова, Терешина, Полотебнова, 1987).

К экзогенно покоящимся спорам, также способным прорастать в дистиллированной воде, относятся споры Alternaria и Cladosporium (Dickinson, Bottomley, 1980).

Выход спор из состояния покоя может контролироваться внутренними ингибиторами прорастания, наличием метаболического блока, барьерами проницаемости для питательных веществ, низкой активностью воды (Smith, 1978).

4.1. Химические соединения.

Соединения, стимулирующие активацию прорастания спор грибов достаточно многочисленны: сахара, аминокислоты, органические кислоты, альдегиды, ароматические соединения, тиофены, фураны, фурфуролы и гетероциклические соединения, алкены, жирные кислоты, парафины, терпены, пирролы, рибофлавин и др..

У других видов прорастание может требовать присутствия низкомолекулярных питательных веществ, таких как сахара, аминокислоты или неорганические соли (Carlile, Watkinson 1994). Например, A. niger, P. notatum, Trichoderma lignorum могут проходить первую стадию прорастания в бидистиллированной воде, но для перехода ко второй стадии необходимо присутствие источника азота или углерода (Martin, Nicolas, 1970), в то время как для прорастания конидий A. nidulans достаточно присутствия только источника углерода (Osherov, May, 2000).У N. crassa активация прорастания требует солей и источника углерода (Schmit, Brody, 1976). У Rhizopus arrhizus прорастание инициируется присутствием глюкозы или фруктозы (Ekundayo, Carlile, 1964).

Часто недостаток резервных соединений является основной причиной того, что конидии не способны без экзогенных питательных веществ переходить во вторую фазу прорастания (Морозова, Баранова, Козлов и др., 2001).

Эндогенно покоящиеся споры грибов не прорастают в бидистиллированной воде и нуждаются в более длительном периоде покоя.

Споры, находящиеся в эндогенном покое, прорастают значительно хуже и требуют либо богатых субстратов, либо специальной активирующей обработки, например нагревания. Например, для нарушения покоя спор Agaricus bisporus необходимо их длительное пребывание в воде с добавлением не более 0,5-1% сахара (Клюшникова, 1940). Для прорастания ряда грибов, например F.

oxysporum, необходимо достаточно высокое содержание углерода и азота в спорах (Билай, 1977).

Углерод- и азотсодержащие соединения.

4.1.1.

Компоненты питательных сред также оказывают влияние на скорость прорастания конидий, на величину биомассы и образование новых спор.

Наиболее общим стимулирующим прорастание веществом является глюкоза, она способствует значительному ускорению набухания и прорастания конидий C. japonica, в 1,5-2 раза увеличивает количество проросших спор A.

niger, как на фосфатно-цитратном буфере, так и в бидистиллированной воде, глюкоза одна может стимулировать прорастание конидий определенных штаммов M. anisopliae.

Следует отметить, что метаболизм углеводов не только видо-, но и штаммоспецифичен. Например, штаммы выделенные из M. anisopliae, Coleoptera, не используют глюкозу в качестве питательного субстрата для инициации прорастания спор, тогда как штаммы, выделенные из Hemiptera и Lepidoptera, способны усваивать глюкозу (Leger, Bidochka, Roberts, 1994; James, 2001). На прорастание конидий культуры B. bassiana AIG углеводы (глюкоза, сахароза, крахмал) оказывают ингибирующее влияние (Искандаров, Гузалова, Давранов, 2006).

Помимо глюкозы стимулирующее действие, но в меньшей степени, способны оказывать рибоза, ксилоза и манноза (на C. japonica), D-рибоза, Dфукоза, L-арабиноза, D-ксилоза, D-глюкоза, D-галактоза, D-манноза; глицерин, эритрит, D-арабит, D-маннит, мезо-инозит; сахароза, трегалоза, мальтоза (на A.

niger). Слабое ингибирующее действие оказывает фруктоза, но совместно с глюкозой она даже стимулирует прорастание у C japonica. Аналоги глюкозы – 6дезокси-D-глюкоза и 2-дезокси-D-глюкоза полностью ингибируют прорастание спор (Полотебнова, Феофилова, Шадрина и др.,1987; Морозова, Баранова, Козлов и др., 2001).

В противоположность углеводам большинство азотсодержащих веществ оказывают ингибирующее действие на прорастание спор большинства видов.

Дрожжевой экстракт и белкозин оказывают сильный ингибирующий эффект на процесс прорастания у C. japonica. Пептон вызывает сильное набухание спор и задерживает вторую фазу прорастания, Из всех проверенных азотсодержащих веществ только способствует интенсификации прорастания L-пролин (Полотебнова, Феофилова, Шадрина и др.,1987).

Примером вида, прорастание которого стимулируется азотсодержащими веществами может служить A. niger. Добавление пептона, (NH4)2SO4, NH4NO3, Lаспарагина, L-пролина, L-треонина, L-цистеина, L-метионина, L-серина, Dглюкозамина в 3-5 раз увеличивает количество проросших спор. Это отличает исследованный штамм A.niger от других грибов, у которых прорастание экзогенно покоящихся спор стимулируется в большей степени углеводами, чем азотсодержащими соединениями (Морозова, Баранова, Козлов и др., 2001).

В действии стимуляторов отмечается видоспецифичность. Так, споры C.

japonica активно прорастают при добавлении пролина и миристиновой кислоты, но добавление пептона заметно ингибирует процесс (Полотебнова, Феофилова, Шадрина и др.,1987). Прорастание энтомопатогенного гриба Metarhizus anisopilae можно вызвать путем культивирования на декстрозном агаре и добавлением 0,03% твина 80 (Dilon, Carnley, 1985). Наиболее общими соединениями, активирующими прорастание спор многих грибов, являются АМФ и цАМФ.

Механизм стимулирующего действия активаторов прорастания изучен на примере P. blakesleanus (Van Laere, 1986). Конститутивный покой этих спор можно нарушить нагреванием или действием одноатомных органических кислот. При этом происходит общая стимуляция метаболизма, т.е. дыхания, синтеза белков, РНК и компонентов КС. Этот процесс сопровождается делением ядра и появлением зародышевой трубки. Первый эффект действия стимуляторов сопровождается увеличением уровня цАМФ и изменениями фосфодиэстеразной активности (Van Laere, 1986). Активация этих ферментов, как уже упоминалось, может влиять на содержание глицерина и трегалозы. Трегалоза может использоваться в процесс прорастания как источник питания, но предварительно метаболизировавшись в глицерин. В то же время трегалоза утрачивает свою функцию стабилизатора мембранных липидов, т.к. состав последних значительно изменяется в процессе прорастания и происходит обогащение клеток антиоксидантами.

Минеральные элементы, металлы.

4.1.2.

Как было показано в работах (Kerwin, Washino, 1986; Rasmussen, 1983,) добавление минеральных элементов в состав питательной среды при выращивании патогенных грибов влияет на осмотические процессы грибной споры и, следовательно, на процессы прорастания.

Чаще всего для прорастания спор необходимо присутствие Ca2+, который может стимулировать прорастание двумя путями: через усиление адгезии спор к гидрофобному субстрату, как у Phyllosticta ampelicida, или через создание градиента Ca2+, определяющего будущее место образования ростковой трубочки (The Mycota. Biology of the fungal cell. 2nd edition, Ed. by K.Esser, Springer, p.341).

Также присутствие ионов кальция необходимо для прорастания M. anisopliae (St.

Leger et al., 1990), C. gloeosporioides (Kim et al., 1998), Sporothrix schenckii (Rivera, Rodriguez 1992).

Для многих оомицетов Ca2+ является стимулятором не только прорастания спорангиев, но и стимулятором инцистирования. Причем при низких концентрациях Ca2+ спорангий прорастает зооспорами, при высоких – гифой (Xu, Morris, 1998).

Также ионы могут оказывать ингибирующее воздействие на прорастание спор. Так ионы Fe3+ ингибируют прорастание спор C. musae и C. acutatum in vitro.

Процент прорастания спор линейно падает с увеличением концентрации Fe3+ в конидиях (Harper et al., 1980). Различные хелатирующие агенты, как антраниловая кислота (anthranilic acid) (Swinburne, 1976) и ее производное 2,3дигидроксибензоевая кислота (2,3-dihydroxybenzoic acid (DHBA)) (Harper, Swinburne, 1979), а также различные нехелатированные формы сидерофоров (McCracken, Swinburne, 1979; McCracken, Swinburne, 1980), образуемые сапротрофными бактериями, снимают данный эффект. Также добавление к конидиям 5 x 10-5 M сидерофора, образуемого Pseudomonas sp. (изолят UV3) увеличивало не только процент проросших конидий, но и процент конидий образовавших аппресории, в т.ч. и темноокрашенные.

Стимулирующий эффект хелаторов основан на их способности связывать ионы железа и освобождать сайты связывания, которые, скорее всего, находятся на рибосомах, от ингибирующего действия.

Также предполагается, что стимулирующее действие хелатирующих агентов обусловлено их связыванием с ионами железа, находящимися в КС споры, и соединяющими молекулы хитина между собой, наподобие того, как это делают ионы кальция в пектине. При связывании данных ионов прочность КС уменьшается достаточно для появления ростковой трубки.

Однако в работе (Horowitz et al., 1976) показано, что при нахождении конидий N. crassa в воде с активностью 0,95 из спор во внешнюю среду выходит необходимое для прорастания вещество, которое было определено как сидерофор или другое железо-переносящее соединение.

В действии различных ионов также проявляется специфичность. В то время как Na+ стимулирует прорастание зооспор Blastocladiella emersonii (Soll, Sonneborn, 1972; Van Brunt, Harold, 1980), этот же ион оказывает токсическое действие на Pythium aphanidermatum (Donaldson, Deacon, 1992).

4.2. Дополнительные факторы.

Помимо углеводов и азотсодержащих веществ на прорастание могут влиять различные специфические ингибиторы, например, на C.elegans оказывает ингибирующее воздействие фенантрен. (Silva, Moraes Filho, Jara et al., 2007).

Добавление в среду 0,8% хитозана подавляет прорастание спор и рост мицелия фитопатогенов F. solani, Sclerothium rolfsii, P. aphanidermatum и Macrophomena phaseolina. (Tamthong, Boonchoo, Photchanachai, 2006).

Для прорастания спор патогенных видов часто требуются дополнительные факторы, например, прорастание конидий M. grisea запускается после контакта спор с гидрофобной твердой поверхностью и соединениями, выделяемыми растением-хозяином (Talbot, 1995). У видов Coleotrichium триггером служат воска кутикулы и этилен, продуцируемый хозяином (Nicholson, 1992), у F. solani

– питательные вещества и пизатин, изофлавоноид, образуемый корнями растений (Ruan, Kotraiah, Straney, 1995).

4.3. Ингибиторы прорастания, в т.ч. самоингибиторы.

В этом случае прорастание контролируется более сложной системой биохимических механизмов, состоящей из активаторов прорастания, находящихся под контролем специфических репрессоров белкового типа, способных изменять свойства мембран и подавлять аутоингибиторы, присутствующие в среде. Такими самоингибиторами являются триметиламины, изолированные из спор Tilletia tritici. Нелетучие самоингибиторы – пгидроксибензойная, ферулиновая, ванилиновая, проткатехиновая кислоты – выделены из уредоспор Puccinia graminis f.sp. tritici. Наиболее сильным ингибирующим действием на уредоспоры обладает метил-цис-ферулят, циннамат, гибереллиновая кислота и канавалин. Базидиоспоры A. bisporus не выходят из состояния покоя, если их поддерживать в атмосфере CO2, который ингибирует сукцинатдегидрогеназу, образуя тем самым метаболический блок (Danlberg, Etten, 1982). Такое же действие оказывает -глутаминил-4-оксибензол и -глутаминил-3,4-бензохинон (Rast, Stussi, Zobrist, 1979). Предполагают, что производное бензохинона может присутствовать в базидиоспорах A. bisporus, являясь тем самым природным аутоингибитором.

4.4. Влияние физических факторов на прорастание.

Активность воды.

4.4.1.

Влажность и активность воды являются важными факторами, влияющими на способность микроорганизмов к росту и развитию (Snow, 1949).

Споры большей части видов грибов прорастают при достаточно высоких значениях aw (0,85-0,99). Так, минимальное значение aw, при котором прорастают споры T. viride – 0,9, P. roqueforti – 0,85 (Gervais, Fasquel, Molin, 1988).

Уменьшение же активности воды приводит к увеличению времени прорастания и падению скорости роста (Scott, 1957). Механизм влияния низкой активности воды на прорастание спор до конца не ясен (Charlang, Horowitz, 1974).

Предполагается, что в растворах с высоким осмотическим давлением происходит выход из спор в среду неизвестного фактора прорастания (Charlang, Horowitz, 1971). Также предполагается, что дегидратация приводит к перестройке липидных связей в мембране и последующей потере ее проницаемости (Quinn, 1985).

4.4.2. pH.

Прорастание спор большинства видов грибов стимулируется слабокислыми значениями pH, например, наиболее благоприятным для прорастания спор C. japonica является значение pH 4,4 (Полотебнова, Феофилова, Шадрина и др., 1987).

Часто прорастание спор проходит в значениях более узких, чем те, при которых существует данный вид, и этот интервал может сужаться при увеличении времени их хранения (Морозова, Баранова, Козлов и др., 2001).

Свет.

4.4.3.

Еще одним фактором является наличие света. Основное влияние на прорастание оказывают синяя и дальняя красная области спектра. Например, облучение светом (=310-320 нм) ингибирует прорастание спор C. japonica и задерживает этот процесс в среднем на 2 ч (Полотебнова, Феофилова, Шадрина и др.,1987). Прорастание уредоспор P. graminis частично и временно ингибируется белым светом, основное же влияние оказывает синяя (=419-425 нм) и дальняя красная области (=720 нм). (Calpouzos, 1971).

Температура.

4.4.4.

Температурный шок, как холодовой, так и тепловой, часто служит триггером прорастания. Изменение температуры может вызывать активацию ферментов, приводить к изменениям проницаемости мембраны (Isaac, 1998).

Нагревание при 50 C в течение 3 мин активирует прорастание спорангиоспор P.

blakesleanus (Medwid, Grant, 1984). В этом процессе участвует КС, при этом в ней происходят резкие изменения в липид-липидных связях, что приводит к тому, что активированные споры не “лопаются” при нагревании в отличие от покоящихся (Феофилова, 2003).

Для видов, прорастание которых инициируется или активируется повышением температуры, значение температуры и продолжительность воздействия специфичны, но при увеличении времени воздействия или значений температуры происходит снижение выраженности эффекта активации вплоть до полной потери всхожести (Искандаров, Гузалова, Давранов, 2006; Полотебнова, Феофилова, Шадрина и др.,1987).

Также стоит отметить большую термостабильность покоящихся стадий по сравнению с мицелием, и большую стабильность эндогенно покоящихся спор по сравнению с экзогенно покоящимися.

Как и по отношению к большинству факторов, популяция спор отличается большой гетерогенностью к температуре. Менее 0,5% спор A. niger не теряют способность к прорастанию после нагревания до 98C, в то время как основная часть (50%) термостабильны до 50C. (Морозова, Баранова, Козлов и др., 2001).

Липиды спор.

9.

По сравнению с мицелием споры могут содержать как меньшее, так и большее количество липидов. Содержание липидов в большинстве видов колеблется от 5 до 17%, но споры ржавчинных могут содержать до 35% липидов (Shan, 1966). Содержание липидов зависит от типа энергоемкого субстрата, используемого при прорастании (Weber, Hess, 1975; Van Etten, Dunkle, Freer, 1977). Споры грибов содержат два типа таких веществ – липиды и углеводы.

Так, в спорах N. crassa содержится до 27% липидов и мало углеводов (Reiscner, 1975), тогда как в спорах мукоровых наблюдается обратное соотношение – у C.

липидов и 15-17% углеводов (Феофилова, Терешина, japonica 3-4% Полотебнова, 1987), споры R. arrhizus содержат 8% липидов (Lawler, Weber, 1980).

Такое различие в типе основного резервного субстрата отражает физиологические различия в процессах инициации и прорастания спор.

Известно, что углеводы легко и быстро метаболизируются в процессе прорастания, тогда как липиды усваиваются значительно медленнее – часть их превращается через глиоксилатный цикл в сахара, другая часть идет на синтез фосфолипидов (Weber, Hess, 1975; Reiscner, 1975). Таким образом, скорость прорастания спор зависит от того, какой тип энергоемкого субстрата преобладает в спорах. Также на примере R. stolonifer было показано, что в спорах с низким содержанием липидов протекает синтез липидов на ранних стадиях, в отличие от спор с высоким содержанием липидов (Weete, Lawer, Laseter, 1973).

9.1. Особенности липидного состава покоящихся стадий по сравнению с физиологически активными стадиями.

Основными липидами спор являются НЛ (50-75%), среди которых, преобладает фракция ТАГ (40-60%). Основные ЖК фракции НЛ: C16:0, C18:0, C18:1, C 18:2. В ФЛ фракции состав ЖК может значительно отличаться, преобладающей становится C18:2, и в целом, ФЛ являются более ненасыщенными. Основными компонентами фракции являются ФХ, ФС, ФЭА, минорные компоненты представлены ДФГ и ФА. Помимо основных ЖК в некоторых видах обнаружены необычные ЖК. В частности, в спорах представителей Uredinales может содержаться до 40% цис-эпоксиоктадекановой кислоты (Tulloch, Craig, Ledingham, 1959; Tulloch, Ledingham, 1962), в спорах Sphaerotheca humuli обнаружено до 42% бегеновой кислоты (Tulloch & Ledingham, 1960), склероции Claviceps purpurea содержат до 34% рицинолеиновой (12-гидроксистеариновой) кислоты, в то время как у других представителей Hypocreales эта кислота не обнаружена (Shaw, 1965). В целом же ЖК состав спор и мицелия сходен как в качественном, так и в количественном отношении (Summer, Morgan, 1969;

Olsson, Johansen, 2000).

9.2. Различия в липидном составе стадий разных степеней покоя.

Покоящиеся стадии по своему липидному составу больше защищены от изменения внешних условий, т.е. они имеют более насыщенные и трудноокисляемые ФЛ, в составе которых меньше ненасыщенных ЖК и больше энергоемких субстратов (ТАГ). Несмотря на этот факт, для некоторых исследованных видов характерна большая ненасыщенность липидов спор (Beilby, Kidby, 1980; Weete, 1974).

Также имеются различия не только между активно растущими мицелием и покоящимися стадиями, но и между спорами, находящимися в покое разного типа. Обычно споры грибов более богатые липидами имеют более длительный период покоя (Феофилова, Михайлова, Садовова, 1993).

У представителей порядка Mucorales, установлены следующие отличия в составе липидов, так, зигоспоры отличаются от спорангиоспор тем, что содержат значительно больше липидов, в составе которых преобладает ФХ (до 50%), присутствуют лизоформы ФЛ, что свидетельствует о значительных перестройках в конформации мембран зигот. Нейтральные липиды представлены ТАГ, составляющими более 90%. Кроме того, в составе липидов зигот отсутствует C18:2, в то время как в экзогенно покоящихся клетках, в частности спорангиоспорах B. trispora, эта кислота является преобладающей (Терешина, Кочкина, Меморская и др., 2002). Также в зиготах мукоровых нет СЖК и ЭСт, являющихся стимуляторами прорастания. В то же время, у спорангиоспор эти соединения присутствуют, что может объяснить более быструю способность к прорастанию находящихся в экзогенном покое спорангиоспор (Феофилова, 2003). Также в покоящихся клетках содержится больше самого устойчивого к окислению полярного липида - ФХ и меньше ФЭА по сравнению с более активно метаболизирующими клетками.

Имеются отличия и в составе преобладающих стеринов. Мукоровые грибы содержат холестерин, эргостерин и 22-дигидроэргостерин в качестве основных стеринов. Более редкими стеринами являются эпистерин и эргоста- -5,7-24(28)триэнол. Эти стерины свойственны мицелию грибов, а в покоящихся клетках преобладают фунгистерин и эргостерин.

9.3. Метаболизм липидов при прорастании спор.

Липидный метаболизм играет важную роль при прорастании спорангиоспор, о чем известно из многих исследований, проведенных с разными видами грибов. Липиды грибных спор наряду с углеводами являются резервным энергетическим и строительным материалом, который используется клетками на этапе прорастания, участвуют в регуляции биохимических процессов (Wette, 1981). Также липиды используются и для синтеза фосфолипидов de novo (Wette, 1974).

При прорастании спор важную роль играют эндогенные липиды (Reiscner, 1976). На ранних этапах прорастания в спорах активируются липазы, и инициируется расщепление липидов, как ТАГ, так и ФЛ. Происходит отщепление ЖК, которые далее подвергаются -окислению. Освобождающаяся энергия, используется в анаболических процессах, происходящих при прорастании споры, в том числе и синтеза de novo ЖК и ФЛ для построения клеточных мембран новой клетки.

В процессе прорастания происходят изменения в составе липидов.

Происходит постепенное уменьшение доли ТАГ, СЖК и возрастание ФЛ, 1,2- и 1,3-ДАГ, МАГ, стеринов (Gaspar, Pollero, Cabello, 1994; Beilby, Kidby, 1980).

Изменения затрагивают и фракцию ФЛ, в начале активного роста возрастает уровень ФС и ФЭА, содержание ФХ снижается (Михайлова, Феофилова, Розанцев и др., 1983). Эти изменения согласуются со сделанными ранее наблюдениями о том, что чем ниже уровень метаболизма, тем больше содержание ФХ, т.е. наименьшее содержание этого ФЛ должно быть в активно метаболизирующих клетках, например в мицелии в стадии трофофазы, наибольшее – в клетках, находящихся в состоянии эндогенного покоя. Падение содержания общих липидов может достигать 30-40% на ранних стадиях прорастания (Smith,Silverman, 1973). Выход споры из состояния покоя сопровождается изменениями в жирнокислотном составе и степени ненасыщенности липидов. (Полотебнова, Терешина, Широкова и др., 1987). При прорастании спор зигомицетов возрастает содержание стеариновой и олеиновой кислот и уменьшается количество линолевой (Wette, 1974). В покоящихся спорах R. arrhizus основными ЖК являются пальмитиновая, олеиновая и линолевая кислоты, а в проросших – стериновая и олеиновая (Gunasekarana, Webera, 1972).

По мере созревания спор A. niger изменяется соотношение олеиновой и линолевой кислот, в зрелых конидиях преобладающей становится C18:1 (Морозова, Козлов, Терешина и др., 2002).

Согласно литературным данным у некоторых грибов возраст спор влияет на их способность к прорастанию, у многих мукоровых увеличение продолжительности культивирования мицелия приводит к постепенной потери жизнеспособности образующихся на нем спорангиоспор. Также отмечено, что в процессе развития спорангиоспор состав их липидов меняется.

Липиды спор характеризуются высоким содержанием ненасыщенных ЖК.

На начальном этапе развития спорангиоспор липиды содержат больше насыщенных ЖК – пальмитиновой и стеариновой. В дальнейшем их уровень снижается с возрастанием доли линолевой и -линоленовой кислот.

Содержание общих липидов в спорах достигает максимума к 7 суткам роста, а на позднем этапе культивирования вновь возрастает, что можно объяснить частичной дегидратацией спор старой культуры. В дальнейшем по мере старения культуры содержание НЛ снижается, а ПЛ увеличивается.

В спорах старой культуры в нейтральных липидах увеличивается содержание СЖК, ДАГ и свободных стеринов. Снижение доли резервных липидов может существенным образом сказаться на выживаемости спор и их способности прорастать в мицелий.

В спорангиоспорах стареющей культуры происходят катаболические процессы, сходные с теми, которые описаны для прорастающих спор. Катаболизм липидов в спорах более старой культуры в большей степени затрагивает мембранные ФЛ, которые наряду с выполнением структурных функций в клетках осуществляют регуляцию внутриклеточных процессов (Мысякина, Фунтикова, 2003; Фунтикова, Мысякина, 2003; Мысякина, Фунтикова, 2007).

2. Экспериментальная часть

–  –  –

Объекты исследования В работе исследования проводили со следующими культурами мицелиальных грибов, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ), коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ и коллеции культур лаборатории экспериментальной микологии: Absidia caerulea ВКМ F-858(+), Cunninghamella echinulata ВКМ F-470(-), C.

echinulata ВКМ F-626(C. echinulata ВКМ F-471(+), C. echinulata ВКМ F-775(-), C. echinulata ВКМ FC. homotallica ВКМ F-930, C. japonica ВКМ F-1204 (-), Penicillium chrysogenum штамм кафедры микологии и альгологии МГУ, P. expansum штамм ИНМИ РАН, P. lanosum ВКМ F-297, P. lanosum ВКМ F-304, P. lanosum ВКМ FP. lanosum ВКМ F-1956, P. luteum ВКМ F-307, Agaricus bisporus штамм кафедры микологии и альгологии МГУ, Pleurotus ostreatus штамм штамм кафедры микологии и альгологии МГУ, Lenthinus tigrinus ВКМ F -160, Stereum hirsutum ВКМ F-1449, Kuehneromyces mutabilis штамм кафедры микологии и альгологии МГУ, Ceraporia viridians штамм кафедры микологии и альгологии МГУ, Hericium corraloides штамм кафедры микологии и альгологии МГУ.

Основным объектом исследования служил представитель низших мицелиальных грибов Cunninghamella japonica.

Таксономическое положение объекта:

Царство: Fungi Класс: Zygomycetes Порядок: Mucorales Семейство: Cunnighamellaceae Род: Cinninghamella Вид: название Cunninghamella japonica (Saito) S. Ito (нынешнее Cunninghamella echinulata (Thaxt.) Thaxt. ex Blakeslee) Грибы рода Cunninghamella относятся к низшим мицелиальным грибам, представителям класса Zygomycetes. Представители данного рода – сапрофиты, чаще всего встречающиеся в средиземноморских и субтропических зонах.

Представители рода развиваются в почве, на плодах, семенах растений, гниющих субстратах растительного происхождения, некоторые виды могут быть оппортунистическими (Пидопличко, Милько, 1971).

Главной морфологической особенностью рода Cunninghamella отличающей их от других представителей пор. Mucorales является наличие моноспорового спорангия. Особенностью спор является наличие двухслойной стенки, что делает этот род схожим с высшими грибами (Белякова, Дьяков, Тарасов, 2006).

Стоит отметить также особое значение этих грибов в биотехнологии, особенно в получении изопреноидных соединений, например убихинонов ().

Поддержание культур Культуры поддерживались в пробирках на скошенном сусло-агаре (7°Б, 2.5%) при комнатной температуре в течение 4 сут, затем хранили при температуре 4–5°С. Пересевы культуры в ходе работы осуществляли не реже одного раза в месяц..

Культивирование на твердых питательных средах Для изучения процесса прорастания спор осуществляли поверхностное культивирование на матрацах и чашках Петри с сусло-агаром (7B; 2,5%) с целью сбора спор.

Культивирование на жидких питательных средах Глубинное культивирование с целью сбора биомассы осуществляли на круговой качалке при 220 об/мин при 27-28C в колбах на 250 мл с 50 мл питательной среды. Инокулятом, если не оговорено другого, служили 7-суточные конидии, полученные смывом культуры со скошенного сусло-агара. Водную суспензию клеток вносили в питательную среду в количестве 2-2,5%.

Определение количества кислорода в среде Определение количества кислорода в жидкой фазе проводили на приборе “Oxi 340i” (WTA, Germany).

Питательные среды, использовавшиеся в работе

Для выращивания грибов использовали среды следующего состава:

В качестве исходной среды использовали среду Гудвина следующего состава (%): глюкоза – 5.0, аспарагин – 0.2, KH2PO4 – 0.1%, MgSO4 7H2O – 0.025%, дрожжевой экстракт – 0.1%.

В процессе оптимизации среды при изучении возможности замены источника азота аспарагин заменяли на более дешевые источники азота, взятые в эквивалентном по азоту количестве (42 мг%, т.е. в каждой среде содержание азота составляло 42 мг на 100 мл среды): NaNO3 – 0.26%, NH4NO3 – 0.12%, NH4Cl – 0.16%, мочевина – 0.09%. Также была испытана мучная среда: кукурузная мука – 1,73%, соевая мука – 4%, KH2PO4 – 0,05%.

В дальнейшем глубинное культивирование проводили на среде следующего состава: глюкоза – 5%, NH4NO3 -0,12%, KH2PO4 – 0,1%, MgSO4·7H2O – 0,025%, дрожжевой экстракт – 0,1%, pH 5,6.

В ходе поисковых работ по изучению возможности замены источника углерода глюкозы на различные типы отходов производств, в том числе и сельскохозяйственных, отходов лесной промышленности (лигнин), использовали среду: NH4NO3 – 0.12%, дрожжевой экстракт – 0.1%, KH2PO4 – 0.1%, MgSO4 7H2O – 0.025%.

В качестве опытных сред использовали среды следующих составов:

Мезга 1: картофельная мезга – 3,2%, дрожжевой экстракт – 0.1%, 1) KH2PO4 – 0.1%, MgSO4 7H2O – 0.025%, дрожжевой экстракт – 0.1%.

–  –  –

Гидролизат древесины: арабиноза – 0,033%, глюкоза – 2,284%, 16) ксилоза -0,91%, дрожжевой экстракт – 0.1%, KH2PO4 – 0.1%, MgSO4 7H2O – 0.025% В опытах по скринингу грибов осуществляющих биодеградацию лигнина использовали природные лигноцеллюлозные субстраты: сосновые опилки (СО) и лузгу подсолнечника (ЛП).

При использовании СО твердофазную ферментацию проводили на 4 вариантах сред:

СО-1: к 5 г опилок добавляли 40 мл водопроводной воды и 1) стерилизовали при 1 атм СО-2: аналогично СО-1 с предварительным измельчением опилок 2) СО-3: аналогично СО-1 с предварительной обработкой опилок 3) ультразвуком в течение 5 мин СО-4: аналогично СО-1 с предварительной глубокой заморозкой СО в 4) течение 5 сут. и последующим оттаиванием при комнатной температуре Опыты проводили в чашках Петри, куда помещали обработанные соответствующим образом СО, 12-15 мл жидкой питательной среды с нитратом аммония, лишенной источника углерода, и посевной мицелий испытуемого гриба.

В опытах с ЛП предварительно выдерживали в водопроводной воде в течение 1 сут при комнатной температуре. Далее ЛП помещали в чашку Петри, вносили 5-20 мл стерильной воды (среда ЛП-1) или дополнительно добавляли 0,5% глюкозы в качестве “затравки” (среда ЛП-2).

После отбора наиболее активного биодеструктора лигнина проводили опыты по культивированию на жидкой питательной среде. В опытных вариантах была использована среда следующего состава: : лигносульфонат натрия – 2%, NH4NO3 -0,12%, KH2PO4 – 0,1%, MgSO4·7H2O – 0,025%, дрожжевой экстракт – 0,1%. Лигносульфонат натрия (содержание лигнина в препарате более 60%) брали в эквивалентном по углероду количестве. Ко второму варианту данной среды дополнительно вносили 0,5% глюкозы.

Определение влагосодержания биомассы мукорового гриба C. japonica Определение влагосодержания образца проводили путем высушивания навески биомассы (не более 250 мг) в сушильном шкафу при температуре 93±1 оС до постоянного веса.

Процентное содержание воды (X) в биомассе вычисляли по формуле:

m начальная m конечная Х 100, % m начальная где Х - содержание воды в биомассе (%);

mначальная - масса образца до высушвания (г);

mконечная- масса образца биомассы после высушивания (г).

Экстракция общих липидов из влажной биомассы мукорового гриба C.

japonica Экстракцию липидов проводили по методу Фолча (Folch, Lees, SloaneStanley, 1957) с модификациями. Для экстракции липидов использовали следующие системы растворителей: система А - хлороформ-этанол (1:2); система B - хлороформ-этанол (2:1).

К навеске влажной биомассы (1,5-2,0 г) добавляли небольшое количество кварцевого песка и растирали в ступке до получения мелкой кашицы. К гомогенату порционно добавляли 25 мл системы A и смесь гомогенизировали в течение 10-15 минут. Гомогенат отфильтровывали в воронке Бюхнера через матерчатый фильтр и переносили фильтрат в делительную воронку. Остаток биомассы с фильтра повторно гомогенизировали с эквивалентным объемом системы B. Гомогенат отфильтровывали, фильтрат также переносили в делительную воронку. Фарфоровую ступку, фильтр с биомассой и приемную колбу промывали 25 мл системы B, этот объем также переносили в воронку. К объединенному фильтрату в делительной воронке добавляли 75 мл дистиллированной воды. После расслоения водно-эспиртового и хлороформенного слоев, нижний хлороформенный слой переносили в предварительно взвешенную колбу через слой безводного сульфата натрия.

Растворитель удаляли на ротационном испарителе, после чего колбу сушили на масляном насосе до постоянного веса. Содержание общих липидов в биомассе определяли гравиметрически.

Сверхкритическое извлечение липидов из биомассы Извлечение нейтральных липидов проводили в токе сверхкритического CO2. Для этого в стальной реактор 3 проточной установки высокого давления (рис. _) помещали навеску 20 г высушенного до постоянного веса в сушильном шкафу при 55C измельченного мицелия гриба. После продувки системы гелием жидкий CO2 (25C, 50 МПа) подавали со скоростью 12 мл/ч шприцевым насосом высокого давления 1. Экстракцию липидов из сухой биомассы проводили сверхкритическим CO2 при температурах 80-100C и давлении 50 МПа.

Извлеченные липиды собирали в коллекторе 10 после декомпрессии CO2.

–  –  –

Состав фракицй нейтральных липидов (НЛ) и полярных липидов (ПЛ) анализировали методом восходящей тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с закрепленным слоем силикагеля фирмы “Merck” (Германия).

Для разделения НЛ использовали системы растворителей:

1) для нейтральных липидов (Кейтс, 1975):

Система №1 – гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (80:20:2) Система №2 – петролейный эфир - диэтиловый эфир - уксусная кислота (80:20:2)

2) для полярных липидов (Brennan et al., 1974):

Система №3 – хлороформ: метанол: вода (65:25:4) (Lepage, 1964), Система №4 – хлороформ – ацетон – метанол – уксусная кислота – вода (50:20:10:10:5) На пластинки наносили 50 мкг нейтральных липидов или 100 мкг полярных липидов. В качестве универсального проявителя использовали 10%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле. После опрыскивания, просушивания и прогревания пластинки в печи при температуре 160-180оС на желтом фоне проявляются интенсивные синие пятна.

В качестве специфических проявителей использовали (Кейтс, 1975):

1) Раствор нингидрина (для обнаружения липидов, содержащих свободные аминогруппы).

В 100 мл ацетона растворили 0,3 г нингидрина. К полученному раствору добавили 3 мл ледяной уксусной кислоты.

После высушивания пластинку нагревали в печи 5 мин при температуре 85оС. Проявляются розовые пятна холинсодержащих липидов.

2) На фосфор.

Раствор 1. 1,25 г молибдата аммония растворяют в 50 мл дистиллированной воды.

Раствор 2. 0,85 г хлорида натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Суммарный раствор (обнаружитель для фосфатов): 12 мл раствора 1 + 10 мл раствора 2 + 2 мл концентрированной соляной кислоты.

Раствор 3. В 50 мл концентрированной соляной кислоты растворяют 20 г хлористого олова.

Перед использованием данный запасный раствор разбавляют дистиллированной водой (1 : 10).

Сухую хроматограмму опрыскивают свежеприготовленным обнаружителем для фосфатов и прогревают 2-2,5 мин при температуре 100оС, после этого опрыскивают разбавленным раствором хлористого олова и выдерживают при комнатной температуре. Фосфатиды проявляются голубыми пятнами, но фон быстро становится голубым.

3) -Нафтол (для обнаружения гликолипидов).

В 100 мл смеси метанол: вода (1:1) растворяют 0.5 г -нафтола.

Хроматограмму опрыскивают раствором реагента до увлажнения слоя силикагеля; высушивают на воздухе и слегка опрыскивают 95%-ным раствором серной кислоты. Нагревают в сушильном шкафу при температуре 120 оС до максимального проявления окраски. Гликолипиды проявляются синефиолетовыми, другие полярные липиды – желтыми, а холестерин – серокрасными пятнами.

4) Реактив Драгендорфа (для обнаружения холинсодержащих липидов).

Раствор А. В 100 мл 20%-ой уксусной кислоты растворяли 1.7 г Bi(NO3)3.

Раствор Б. В 25 мл дистиллированной воды растворяли 10 г KI.

Для опрыскивания смешали 20 мл раствора А, 5 мл раствора Б и 70 мл воды.

После опрыскивания высушивали при комнатной температуре. Свободный холин дает пурпурное пятно, холинсодержащие – оранжевые пятна.

5) Реактив для обнаружения стеринов и их эфиров.

Хроматограмму опрыскивают раствором СН3СООН : Н2SО4 (1:1), нагревают 15 мин при 90оС. Стерины и их эфиры дают красные пятна на белом фоне.

Типичные ТСХ как нейтральных, так и полярных липидов с использованием универсального и специфических проявителей представлены в приложении.

После идентификации липидных фракций для определения их количественного содержания был проведен денситометрический анализ с использованием программ “Dens” и “Sorbfil” (Россия). В качестве стандартов для построения калибровочных кривых использовали стандартные растворы ФХ, ТАГ и СЖК.

Определение качественного и количественного состава жирных кислот Получение метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) МЭЖК получали методом кислотного метанолиза. К 5-10 мг липидов добавляли 5 мл 8,4% раствор хлористого ацетила в метаноле и 1-2 стеклянных капилляра. Реакцию проводили на водяной бане при температуре 78C в течение 120 мин. в специальной колбе с боковым отростком (Кейтс, 1975) с обратным холодильником, снабженной хлоркальциевой трубкой. Контроль над ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ в системе для нейтральных липидов (Rf МЭЖК – 0,77).

По окончании реакции полученные МЭЖК экстрагировали гексаном. Для чего переносили остывшую реакционную смесь в делительную воронку, куда добавляли 25 мл гексана и 75 мл дистиллированной воды, после чего гексановый (верхний) слой промывали дистиллированной водой (3х50мл) и отфильтровывали через слой безводного сернокислого натрия. Полученный гексановый раствор метиловых эфиров концентрировали в вакууме на роторном испарителе.

Анализ МЭЖК методом ГЖХ

Качественный и количественный анализ состава жирных кислот общих липидов гриба проводили на газожидкостном хроматографе Хроматэкс Кристалл 5000.1 (Россия). Капиллярная колонка: Optima–240 (0,25 мм – 60 м – 0,25 мкм Macheray-Nagel Gmbh&Co (Germany)) неподвижная фаза: 33% cyanopropylmethyl-67% dimetylpolysiloxane. Газ-носитель – гелий, скорость расхода газаносителя – 30 мл/мин. Режим изотермический: температура колонки 180оС, температура испарителя 250оС.

Жирные кислоты идентифицировали по относительному времени удерживания на колонке компонентов смеси по сравнению со стандартами.

Расчет степени ненасыщенности, йодного числа и цетанового числа.

Степень ненасыщенности липидов рассчитывали по формуле:

–  –  –

Йодное число рассчитывали согласно (Глушенкова и др., 1970) по формуле:

ЙЧ = = где ai – коэффициент для каждой ЖК: C16:1 – 90; C18:1 – 86,07; C18:2 – 173,33;

C18:3 – 261,79; i – содержание данной кислоты в сумме ЖК.

Цетановое число рассчитывали согласно (Bamgboye, 2008) по формуле:

ЦЧ=61,1 + 0,088 C14:0 + 0,133 C16:0 + 0,152 C16:1 – 0,101 C18:0 – 0,039 C18:1 – 0.243 C18:2 – 0,395 C18:3, где С – содержание каждой кислоты.

Расчет характеристик биодизельного топлива на основании данных о содержании инивидуальных жирных кислот.

Низшую теплоту сгорания определяли согласно (Семенов, 2001).

Для определения низшей теплоты сгорания необходимо определение молекулярной массы, приближенной суммарной формулы ацилглицеридов, относительных долей углерода, водорода и кислорода в них.

Расчет молекулярной массы ТАГ проводили по формуле:

–  –  –

где Mжкi – молекулярная масса жирной кислоты i, i, - содержание данной кислоты в сумме жирных кислот.

Зная молекулярные массы ЖК и их процентное содержание в липидах определяли суммарные молекулярные массы каждого из элементов. После этого, зная элементарный состав ацилглицеридов, можно определить низшую теплоту сгорания липидов, расчётным способом в соответствии с формулой Д. И.

Менделеева:

Qн = 34,013 C + 125,6 H – 10,9 (O-S) – 2,512 (9 H + W) (МДж/кг), где C, H, O, S, W – массовые доли в топливе углерода, водорода, кислорода, серы и воды соответственно.

Определение степени прорастания спор Получение споровой суспензии

Для получения споровой суспензии проводили культивирование C. japonica в чашках Петри с сусло-агаром. Для приготовления споровой суспензии в чашку Петри наливали 25-30 мл холодной воды, затем шпателем собирали мицелий со спорами. Споры отделяли от мицелия через слой капроновой ткани. Контроль над процессом отделения осуществляли с помощью микроскопирования. Общую концентрации спор определяли с помощью камеры Горяева.

Изучение прорастания спор в тонком слое агара

Изучение прорастания спор в тонком слое агара проводили согласно (патент №2177993), (Бехтерева, Медведева, Поглазова и др., 1965.). На обезжиренные предметные стекла наносили 0,2 мл горячей агаризованной среды (сусло-агар или голодный агар 2,5%). На стекла с застывшей агаризованной средой наносили 1 каплю (0,02-0,04 мл) суспензии спор и равномерно распределяли ее шпателем по поверхности среды. Стекла помещали во влажные камеры и инкубировали при температуре 27±1 C. Препараты просматривали под микроскопом через 1, 2, 3, 3,5, 4, 4,5 и 5 ч экспозиции. Фотографировали 10 случайно выбранных полей зрения. Измерение линейных размеров спор производили в программе ScopePhoto Табл._. Вспомогательные данные для расчета низшей теплоты сгорания

–  –  –

Изучение прорастания спор в жидкой среде Изучение прорастания спор жидкой среде проводили на круговой качалке при 220 об/мин при 27-28C в колбах на 250 мл с 25 мл жидкой среды (дистиллированной воды или дистиллированной воды с добавлением различных экзогенных источников азота и углерода (см. ниже). Отбор проб проводили стерильно каждый час в течение 8 часов после начала эксперимента.

Изучение влияния различных соединений на прорастание спор

Для изучения влияния различных веществ на прорастание спор исследуемых организмов были испытаны следующие добавки: цАМФ (cAMP) (25; 250 мкл/мл), глюкоза (Glc) (0,2; 0,4%), манноза (Man) (0,2; 0,4%), трегалоза (Tre) (0,2%), пролин (Pro) (0,2%), пептон (Pep) (0,2%), глюкоза совместно с пролином (Glc+Pro) (0,2%; 0,2%). Данные добавки вносились к 25 мл дистиллированной воды. Культивирование и отбор проб проводили согласно предыдущему параграфу.

Определение сохранения способности спор к прорастанию

При оценке сохранения способности спор к прорастанию микроорганизмов в качестве количественного показателя пользуются отношением концентрации колониеобразующих единиц к общей концентрации клеток. Анализ этого показателя по образованию колоний отражает способность клеток к размножению в определенных условиях (культивируемость) (Пучков, 2009). Концентрацию спор в исходной суспензии определяли в камере Горяева, затем готовили серии последовательных десятикратных разведений в стерильной водопроводной воде (1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000; 1:10000). Из разведения 1:100000 брали 0,1 мл суспензии и равномерно распределяли по поверхности питательной среды, разлитой в чашки Петри стерильным стеклянным шпателем. Учет колоний проводили после инкубации при температуре 27±1 C на третьи сутки.

Количество повторностей – 3.

Обработка результатов.

Обработка результатов проводилась с использованием метода медианы (), а также с помощью пакетов программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.) и Microsoft® Office Excel® 2003, Microsoft® Office Excel® 2007.

Результаты

–  –  –

Определение состава и содержания жирных кислот липидов представителей р Cunninghamella.

На втором этапе скрининга мы изучили накопление биомассы и липидооборазование, а также качественный и количественных состав липидов и ЖК нескольких штаммов C. japonica и родственных видов.

Результаты представленные в табл._. показывают, что на 5е сутки культивирования для всех исследуемых штаммов величина накопленной биомассы составила более 14 г/л, при этом наибольшая величина (19,16 г/л) отмечена для штамма F-1204 (-). При определении содержания липидов в биомассе гриба было установлено, что все штаммы характеризуются Таблица _. Накопление биомассы и способность к липидообразованию исследованных штаммов Cunninghamella.

–  –  –

высокой липогенной активностью и содержание липидов находилось в пределах 37-47%.

На основании полученных данных и величине биомассы и содержании в ней липидов был рассчитан такой показатель как выход липидов с объема среды (г/л). Поскольку все штаммы обладают более-менее одинаковой способностью к синтезу и накоплению липидов, но штамм 1204 за 5 суток роста накопил большее количество биомассы, то и выход липидов с литра среды для этого штамма был выше и составил 8,12 г/л.

Исследование состава жирных кислот липидов исследуемых штаммов р. Cunninghamella (табл._.) показало, что они содержат насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с четным числом атомов углерода от C14 до C24, с преобладанием олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) жирных кислот. Количество олеиновой кислоты достигает высокого уровня – 41-51%. Пальмитиновая кислота составляет 15-25%, на чуть меньшем уровне находится содержание линоленовой кислоты – 10-20%.

Все рассмотренные штаммы синтезируют в значительном количестве и линоленовую кислоту – 7-15%.

Как видно из табл._. у всех штаммов суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот достигает 61-82%, и степень ненасыщенности составляет 0,77-1,17.

–  –  –

Таким образом, показано, что все исследованные штаммы обладают высокой липогенной активностью и содержание липидов в клетках превышает 40%, по составу и содержанию ЖК рассмотренные липиды можно отнести к маслам олеинового типа (Тетюнников, 1966).

Изучение состава липидов гетероталличных штаммов представителей р Cunninghamella.

На данном этапе нашей работы мы исходили из предположения, что некоторые разнополые штаммы мукоровых грибов, например Blakeslea trispora, способны при совместном культивировании (+) и (–) штаммов образовывать во много раз больше нейтральных липидов, чем при раздельном выращивании Таким образом, целью этого этапа ().

исследований было изучить способность различных видов разнополых штаммов Cunninghamella к синтезу липидов при копуляции (+) и (-) штаммов.

В качестве объектов исследования были взяты разнополые штаммы C.

echinulata 470 (-), 471 (+), 775 (+), 776 (-) и гомоталличный штамм C.

homotallica 930.

Результаты выращивания штаммов и накопление ими липидов представлены в табл._. Как видно из табл._, все исследованные штаммы грибов на 5 сут роста накапливали более 15 г/л биомассы. Содержание липидов в мицелии всех штаммов превышало 35%, но совместное культивирование не увеличило содержания липидов в мицелии продуцентов, что еще раз подтвердило существование физиологических различий между грибами семейств Cunninghamellaceae и Choanephoraceae ().

–  –  –

Анализ состава жирных кислот липидов исследуемых штаммов (табл.

_) показал присутствие насыщенных и ненасыщенных жирных кислот С14– С20 с преобладанием пальмитиновой, олеиновой и линолевой кислот, суммарное содержание С20 жирных кислот составляло менее 2%. Как видно из данных, представленных на рис._. у всех штаммов сумма ненасыщенных кислот превышает 60%, при этом отмечена общая закономерность большей ненасыщенности липидов (+) штаммов. У обоих (+) штаммов: 471(+) и 775(+) содержание ненасыщенных кислот в 1,5-2 раза ниже, чем у соответствующих (-) штаммов: 470(-) и 776(-) соответственно.

При этом содержание олеиновой кислоты осталось на постоянном уровне (42-45%), содержание линолевой кислоты увеличилось у 471 (+) по сранению с 470(-) в 1,65 раза, у 775(+) по сравнению с 776 (-) – в 1,35 раза.

Более резкое увеличение (более чем в два раза) отмечено для линоленовой кислоты: у 471(+) по сравнению с 470(-) с 6,58% до 14,69%, а у 775 (+) по сравнению с 776(-) с 7,31% до 17,09%.

Гомоталличный штамм F-930 проявлял сходство с (-) штаммами.

–  –  –

Исследованные разнополые штаммы р. Cunninghamella характеризовались по сравнению с другими Mucorales (например, B.

trispora) более высоким содержанием ненасыщенных ЖК. Повышение содержания линолевой и линоленовой кислот на фоне снижения пальмитиновой и стеариновой кислот может указывать на большую активность 12 и 15 десатураз у грибов сем. Cunninghamellaceae, ответственных за синтез С18:2 и С18:3 кислот соответственно.

Интересным представляется тот факт, что все штаммы, независимо от их половой принадлежности, синтезировали линоленовую кислоту (С18:3), при этом содержание данной кислоты в липидах (+) штаммов превышало соответствующий показатель (–) штаммов более чем в 2 раза. Более того, в отличие от других мукоровых грибов, например Blakeslea trispora (10), (+) штаммы Cunninghamella синтезировали больше С18:3, чем (–) штаммы.

Таким образом, впервые показано, что существуют различия в метаболизме липидов у грибов порядка Mucorales. В отличие от других Choanephoraceae, у представителей рода Cunninghamella не только не увеличивался выход нейтральных липидов при копуляции разнополых штаммов, но (+) и (–) штаммы имели практически идентичный состав ЖК. Все исследованные штаммы обладали способностью накапливать липиды, содержание которых в мицелии превышало 35%.

Для таксономии Mucorales важны данные, свидетельствующие о ряде отличий грибов рода Cunninghamella и других мукоровых грибов в отношении липидообразования гетероталличных штаммов, в частности способность (+) и (–) штаммов C. japonica синтезировать линоленовую кислоту. Для других Mucorales, например B. trispora, эта кислота рассматривается в настоящее время как надежный критерий при определении половой принадлежности гетероталличных штаммов (19), так как отличительной особенностью (–) штаммов B. trispora является неспособность синтезировать -линоленовую кислоту.

Таким образом, данное исследование внесло определенный вклад в понимание такого важного процесса как гетероталлизм. Если у каротинообразующих представителей Mucorales достаточно данных о половых гормонах, регулирующих процесс гетероталлизма, то у других Mucorales, в частности Cunninghamellaceae – данных о гормональной регуляции полового процесса недостаточно. Поэтому интерес представляют полученные результаты о способности (+) и (-) штаммов C japonica синтезировать разное количество линоленовой кислоты, в частности, тот факт, что у C japonica наиболее активно линолевую и линоленовую кислоты синтезируют именно (+) штаммы.

Глава 2. Основные характеристики биодизеля на основе липидов C.

japonica.

В странах Европы наиболее часто для получения биодизеля используется рапс. Поэтому целью следующего этапа исследований было проведение сравнительного анализа состава липидов рапса и гриба-продуцента, а также определение и сравнение основных характеристик биодизельного топлива полученного на основе липидов данных организмов.

Было проведено изучение качественного и количественного состава фракций НЛ и ПЛ, а также изучен ЖК состав ОЛ. Основываясь на результатах анализа фракций НЛ и ПЛ (табл._), можно говорить о сходстве липидов гриба C.

japonica и рапса B. napus, однако гриб обладает более сложным набором как нейтральных, так и фосфолипидов.

–  –  –

Как видно из приведенной таблицы (табл._.) качественный состав ЖК ОЛ исследуемых организмов идентичен. Спектр ЖК включает молекулы с длиной углеродной цепи от С14 до С24, с преобладанием ненасыщенных олеиновой (С18:1) и линолевой (С18:2) кислот. С20 ЖК присутствуют в следовых количествах.

Основным отличием в ЖК составе липидов гриба и рапса является степень ненасыщенности липидов: СН липидов мукорового гриба составила 1.06, липидов рапса – 1.34, это определяется почти 3хкратным превышением содержания насыщенных ЖК (в особенности пальмитиновой кислоты) в составе липидов мукорового гриба, по сравнению с липидами рапса.

–  –  –

Также в составе липидов обоих организмов следует отметить отсутствие ПНЖК негативно влияющих на окислительную устойчивость биодизельного топлива.

Полученные данные показывают значительную идентичность ЖК состава липидов гриба C. japonica и рапса B. napus, что позволяет сделать предположение о сходстве характеристик биодизельного топлива полученного из этих источников.

Сравнение некоторых характеристик биодизеля, полученного на основе липидов мукорового гриба C. japonica F-1204 и рапса B. napus.

Йодное число Иодное число (ЙЧ) – величина, характеризующая содержание двойных связей в ненасыщенном соединении, и определяющая, в частности, общую ненасыщенность жиров. ЙЧ тесно связано с таким показателем как химическая стабильность топлива, которая в свою очередь, характеризуется показателем индукционного периода – временем до начала окисления топлива при определенных условиях испытания. Чем выше индукционный период, тем выше стойкость топлива к окислению На основании данных о количественном и качественном составе ЖК (табл._.) были рассчитаны ЙЧ для липидов мукорового гриба и рапса. Величина ЙЧ оказалось равной 90,81 и 114,91 соответственно. Согласно литературным данным () величина ЙЧ для рапса находится в пределах от 94 до 120. В России нет принятых стандартов для биодизеля, поэтому мы будем ориентироваться на европейские стандарты (EN14213 и EN 14214), согласно которым для биодизеля величина показателя ЙЧ не должна превышать 130 и 120 единиц соответственно.

Кроме того, стандартами установлено, что содержание линолевой кислоты в биодизеле не должно превышать 12%, а также суммарное содержание ПНЖК не должно превышать 1% от суммы ЖК.

От состава и содержания ЖК в биодизеле помимо такого показателя как ЙЧ, зависят еще и такие регламентированные характеристики биодизеля как теплота сгорания и цетановое число.

Удельная теплота сгорания Теплота сгорания является одной из важнейших характеристик топлива, служащих для оценки его энергетических возможностей и экономической эффективности.

Удельная теплота сгорания – физическая величина, показывающая какое количество теплоты выделяется при полном сгорании 1 кг топлива в кислороде.

Она определяет энергию, которую сообщает топливо двигателю, и выражается в джоулях или калориях. Количество теплоты, выделяемое при сгорании топлива, зависит от химического состава, а, следовательно, от содержания в нем углерода и водорода.

Различают высшую теплоту сгорания Qв – количество теплоты, которое выделяется при полном сгорании вещества, включая теплоту конденсации водяных паров при охлаждении продуктов сгорания, и низшую теплоту сгорания Qн – количество теплоты, которое выделяется при полном сгорании, без учёта теплоты конденсации водяного пара. Теплоту конденсации водяных паров также называют скрытой теплотой парообразования (конденсации). Таким образом, высшая теплота сгорания — это количество теплоты, выделившейся при полном сгорании единицы массы или объема (для газа) горючего вещества и охлаждении продуктов сгорания до температуры точки росы.

На практике, не удается охладить продукты сгорания до полной конденсации и потому введено понятие низшей теплоты сгорания (Q H), которую получают, вычитая из высшей теплоты сгорания теплоту парообразования водяных паров как содержащихся в веществе, так и образовавшихся при его сжигании.

Низшая и высшая теплота сгорания связаны соотношением:

, где k — коэффициент, равный 25 кДж/кг (6 ккал/кг); W — количество воды в горючем веществе, % (по массе); Н — количество водорода в горючем веществе, % (по массе).

В автомобильных двигателях продукты сгорания отводят из цилиндров при температурах значительно более высоких, чем температура конденсации паров воды, поэтому рабочей теплотой сгорания бензинов и других жидких топлив считают Qн.

Полученные результаты показали, что низшая теплота сгорания биодизеля, полученного из липидов гриба, составила 37,27 МДж/кг, а биодизеля, полученного на основе рапсового масла – 37,31 МДж/кг. Следует отметить, что помимо теоретического расчета, низшая теплота сгорания биодизеля на основе липидов гриба, была определена экспериментально (в РГГУ нефти и газа им. И.М.

Губкина) и составила 37,13 МДж/кг, т.е. расхождение теоретически рассчитанной и экспериментально полученной величины составило менее 1%. Данное значение полностью удовлетворяет требованиям стандарта EN 14214, согласно которому минимальная граница данного показателя составляет 35 МДж/кг.

Цетановое число.

Цетановое число (ЦЧ) – показатель характеризующий воспламеняемость дизельного топлива. Это число характеризует способность топлива к воспламенению и определяет период задержки горения рабочей смеси, т.е.

промежуток времени от впрыска топлива в цилиндр до начала его горения. Оно влияет на запуск двигателя, жесткость его работы, расход топлива и дымность отработавших газов. Чем выше цетановое число, тем лучше способность топлива к воспламенению, тем короче промежуток времени между началом впрыска и воспламенением и, как следствие, более спокойное и плавное горение дизельного топлива, которое определяет высокие мощностные и экономические показатели работы двигателя ().

Цетановое число численно равно объёмной доле цетана (С16Н34, гексадекана), цетановое число которого принимается за 100, в смеси с метилнафталином (цетановое число которого, в свою очередь, равно 0), когда эта смесь имеет тот же период задержки воспламенения, что и испытуемое топливо в тех же условиях. В новых версиях стандарта ASTM D613 для смешения используется не -метилнафталин (который крайне токсичен), а 2,2,4,4,6,8,8гептаметилнонан (ГМН или изоцетан), которому присвоено цетановое число 15.

Поэтому шкала ЦЧ составляет от 15 до 100.

Оптимальную работу стандартных двигателей обеспечивают дизельные топлива с цетановым числом 40—55. Это связано с тем, что как слишком высокие, так и слишком низкие показатели ЦЧ вызывают различные проблемы работы двигателя. При цетановом числе меньше 40 резко возрастает задержка горения (время между началом впрыскивания и воспламенением топлива) и скорость нарастания давления в камере сгорания, увеличивается износ двигателя.

Стандартное топливо характеризуется цетановым числом 48-51, а премиальное топливо имеет цетановое число 51-55. Согласно российским стандартам, цетановое число летнего и зимнего дизтоплива должно быть не менее 48 единиц.

При цетановом числе больше 60 снижается полнота сгорания топлива, возрастает дымность выхлопных газов, повышается расход топлива.

ЦЧ определяется химическим составом топлива. На величину ЦЧ ЖК и их эфиров влияют два фактора: длина и степень разветвленности углеродной цепи и степень ненасыщенности ЖК.

Анализ литературных данных позволяет сделать вывод о том, что величина ЦЧ для углеводородов уменьшается как при укорачивании углеродной цепи, так и при увеличении ее разветвленности. Однако на примере различных эфиров ЖК было показано, что разветвленные эфиры, полученные при использовании таких спиртов как изопропанол, имеют ЦЧ соизмеримое с аналогичным показателем метиловых или иных неразветвленных алкиловых эфиров ЖК. Т.о., соединение с длинной неразветвленной цепью будет обладать достаточно высоким значением ЦЧ, даже если какой-то его фрагмент будет иметь разветвленную структуру.

Следует отметить, что разветвленные эфиры (производные изопропанола) представляют особый интерес в связи с тем, что они обладают улучшенными свойствами при низкой температуре (). Однако к недостаткам получения разветвленных эфиров можно отнести высокую стоимость спирта и изменения в технологическом процессе переэтирификации для получения разветвленных эфиров ЖК.

Согласно литературным данным, СН ЖК является более существенным фактором влияния на величину ЦЧ, чем степень ее разветвленности ().

Насыщенные ЖК и их эфиры характеризуются высоким значением ЦЧ. Так, например, ЦЧ метилового эфира миристиновой кислоты (C14:0) составляет 66,2, пальмитиновой (C16:0) - 74,5, стеариновой (C18:0) – 86,9. Появление же в молекуле кислоты одной двойной связи приводит к резкому снижению величины ЦЧ: так в случае метилового эфира пальмитолеиновой кислоты (C16:1) величина ЦЧ составляет 51,5, метилового эфира олеиновой кислоты (C18:1) – 46,1. Дальнейшее увеличение СН приводит к снижению ЦЧ и для метилового эфира линолевой кислоты (C18:2) ЦЧ составляет 31,4, эфира линоленовой кислоты (C18:3) – 22,7 ().

Экспериментальное определение ЦЧ топлива весьма трудоемкая работа связанная с наличием громоздкого, дорогостоящего и шумного оборудования, требующая специально оборудованного машзала, также необходим большой объём пробы, (до 1 л); сам анализ занимает иногда до нескольких часов, и сам метод имеет низкие показатели прецизионности. Поэтому в последние годы начали появляться работы по построению математических моделей для определения (предсказания) ЦЧ на основе нескольких известных параметров ().

Поскольку величина ЦЧ биодизеля зависит от состава и содержания эфиров ЖК, то наиболее распространенными являются математические модели по оценке величины ЦЧ на основе состава МЭЖК ().

Исторически сложилось, что впервые определение ЦЧ было проведено на примере этиловых эфиров пальмового масла (). Полученные результаты повлекли множество дальнейших исследований, продолжающихся и по сей день, как индивидуальных ЖК и их эфиров, так и дизельного топлива, полученного на основе различных растительных масел. Подобные исследования описаны в ряде экспериментальных и обзорных статей ().

Полученные нами результаты показали, что величина ЦЧ биодизеля, полученного из липидов гриба, составила 55,68, а биодизеля, полученного на основе рапсового масла – 51,74. В требованиях европейских стандартов установлена минимальная граница данного показателя – 51 единица.

Таким образом, основываясь на полученных результатах и литературных данных (табл._,) можно сказать, что биодизель, полученный на основе липидов мукорового гриба C. japonica, по ряду показателей соответствует требованиям европейских стандартов для биодизеля и аналогичен наиболее широко используемому в странах ЕС биодизелю на основе рапсового масла.

–  –  –

Исследование возможности замены источника азота в питательной среде.

При удешевлении стоимости среды ферментации в биотехнологии используют “оптимальный показатель (ОП) выхода конечного продукта”, который получают без учета стоимости процесса. Скрининг и начальные ферментации грибов для получения биодизеля проводили на среде Гудвина, высокая стоимость которой определяется наличием аспарагина (источник азота) и глюкозы (источник углерода), поэтому основные усилия по оптимизации среды были направлены на снижение стоимости источника азота и углерода.

Целью этого этапа исследований было проведение опытов по изучению возможности замены аспарагина на другие источники азота, взятые в эквивалентном по азоту количестве (42 мг%): нитрат натрия, нитрат аммония, хлорид аммония, мочевину, а также среду с кукурузносоевой мукой.

Результаты влияния различных источников азота на показатели роста и выход липидов на примере C. japonica F-1204 представлены в табл. _.

–  –  –

Как видно, из всех испытанных источников азота наименее благоприятным для роста является хлорид аммония – максимальная величина биомассы данного варианта была ниже контрольной величины почти в 2 раза. Замена аспарагина на остальные из испытанных источников азота благоприятно повлияла на активность ростовых процессов, и количество накопленной биомассы превысило контроль на 23-76%.

Содержание липидов в биомассе гриба C. japonica, выращенного на среде с аспарагином, составляло около 50%. При использовании прочих источников азота содержание липидов в биомассе было ниже. Так, наименьшее (11,96%) содержание липидов было отмечено на кукурузносоевой среде, а наибольшее (46,59%) – на среде с нитратом аммония.

На основании полученных данных о величине биомассы и содержании в ней липидов был рассчитан такой показатель как выход липидов с объема среды (г/л). Наибольший выход липидов, превысивший контроль почти на 40%, был отмечен при культивировании на среде, содержащей нитрат аммония.

Поскольку согласно литературным данным, замена одного из компонентов питательных сред может привести к изменению состава жирных кислот, на примере C. japonica F-1204 было проведено сравнительное исследование состава ЖК липидов полученных при культивировании гриба на средах с аспарагином и нитратом аммония.

Полученные результаты (табл._.) показывают, что замена источника азота в среде привела к снижению СН липидов за счет увеличения содержания пальмитиновой кислоты и снижения олеиновой.

–  –  –

Поскольку состав ЖК влияет на ряд характеристик биодизеля, то были рассчитаны теплота сгорания и цетановое число с учетом изменившегося состава ЖК (табл._). При замене аспарагина на нитрат аммония в среде культивирования мукорового гриба увеличилось содержание насыщенных ЖК, что практически не повлияло на величину теплоты сгорания, которая составила 37,19 МДж/кг и на величину цетанового числа – 56,54.

Аналогичные опыты по замене аспарагина на нитрат аммония были проведены для 3 штаммов C. echinulata F-470, F-626, F-657 (табл._.).

–  –  –

Полученные результаты указывают на то, что замена аспарагина на нитрат аммония:

1) вызывает интенсификацию ростовых процессов у всех исследованных штаммов, накопление биомассы превышало контроль более чем в 1,5 раза;

2) использование минерального источника азота практически не влияет на липогенную активность культур, выход липидов у всех штаммов увеличивался более чем в 1.5 раза за счет увеличения количества биомассы.

Таким образом, наиболее благоприятным для роста гриба и накопления клеточных липидов из всех испытанных источников азота является нитрат аммония, стоимость которого значительно ниже аспарагина, и для дальнейших исследований была выбрана среда, где в качестве источника азота используется нитрат аммония.

Замена источника углерода Задачей следующего этапа исследования было проведение работ по изучению возможности замены источника углерода – глюкозы – в среде культивирования C. japonica на различные отходы производств.

Картофельная мезга Была рассмотрена возможность замены источника углерода в среде на различные производные картофельных отходов. Было рассмотрено несколько типов сред с мезгой: мезга 1 – только картофельная мезга вместо глюкозы; мезга 2 – картофельная мезга и 0,5% глюкозы. Полученные результаты представлены в табл._.

–  –  –

Во всех вариантах опыта замена глюкозы на картофельную мезгу не оказала какого-либо влияния на активность ростовых процессов, и величина накопленной биомассы была на уровне контроля. Что касается липогенной активности культуры, содержание липидов во всех рассмотренных вариантах сред с использованием мезги было ниже соответствующей величины контроля.

Выход липидов на всех вариантах сред с использованием картофельной мезги были ниже, чем на контрольной среде с глюкозой.

Наибольший выход отмечен на среде мезга 1.

Был проведен анализ жирнокислотного состава липидов, результаты которого представлены в табл._.

–  –  –

Анализ состава и содержания ЖК липидов при культивировании гриба на различных средах показал, что качественный состав индивидуальных ЖК оставался неизменным; отмечены колебания в содержании таких ЖК как пальмитиновая, олеиновая и линолевая, что привело к некоторому увеличению содержания насыщенных ЖК в опытных вариантах до 34,5%.

Следует отметить, что замена глюкозы на картофельную мезгу практически не повлияло на величину низшей теплоты сгорания биодизеля (37,17 МДж/кг) и величину цетанового числа (56,58).

Таким образом, показано, что использование картофельной мезги в качестве источника углерода практически не сказывается на интенсивности ростовых процессов мукорового гриба, при этом синтез и накопление липидов идет менее интенсивно, чем на контрольной среде.

Картофельные очистки и картофельная шелуха Следующими в процессе поиска подходящего источника углерода были рассмотрены питательные среды с использованием картофельных отходов: очистки 1 – картофельные очистки; очистки 2 - картофельные очистки и дополнительно азот; шелуха 1 – картофельная шелуха; шелуха 2 картофельная шелуха и дополнительно 0,5% глюкозы, а также крахмал.

Результаты представлены в табл._.

Как видно, замена глюкозы на картофельные очистки и шелуху, а также крахмал негативно сказывается как на активности ростовых процессов, так и на липогенной активности гриба: содержание липидов в биомассе в опытных вариантах было меньше контроля более чем в 3 раза.

Таким образом, показано, что замена источника углерода в среде культивирования на картофельные очистки, шелуху и крахмал приводит к снижению активности ростовых процессов и липогенной активности гриба, и использование данных отходов в качестве основного компонента питательной среды нецелесообразно.

Глицерин В биотехнологии известен еще один путь удешевления стоимости конечного продукта – использование побочных продуктов производства. С этой целью исследовали возможность применения глицерина – побочного продукта при получении биодизеля в качестве источника углерода вместо глюкозы (). Было рассмотрено несколько вариантов сред: глицерин 1 – 2% глицерина; глицерин 2 – 4% глицерина; глицерин 3 – глицерин с дополнительным внесением мезги; глицерин 4 – среда с картофельной мезгой с дополнительным внесением к 48-часовой культуре. Как видно из приведенной таблицы (табл. _), гриб обладал способностью к росту на среде с глицерином, и совместное применение глицерина и картофельной мезги дает лучшие результаты, чем глицерин. Повысить выход липидов можно также за счет увеличения начального содержания глицерина в среде. Кроме того, внесение вместе с посевным материалом 0.2% глюкозы увеличивает потребление глицерина и повышает выход липидов до 19–20%.

Другие виды отходов Также в качестве замены источника углерода были рассмотрены различные виды отходов: белый лепесток (пищевой соевый шрот), кофейный шлам, свекольный жом, лузга подсолнечника.

Как видно из табл. _, гриб способен утилизировать все испытанные виды отходов, величина накопленной биомассы составила более 10 г/л. Что касается содержания липидов в клетках гриба, то наибольшее их содержание, составившее около 60% от контроля, было отмечено на среде с кофейным шламом. Наилучший результат был получен при использовании отходов от маслодельных заводов (сточные воды производства оливкового масла) при значении редуцирующих веществ (РВ) 2.5%. В состав РВ входили в основном глюкоза, сахароза, ксилоза и арабиноза. В данном случае выход липидов составил около 40%.

Гидролизат древесины Сотрудниками лаборатории биотехнологии ферментов Института биохимии им. А.Н. Баха (зав. лаб. проф. Синицын А.П.) был любезно предоставлен образец гидролизата древесины хвойных пород для изучения возможности замены глюкозы на данный тип гидролизата. Следует отметить, что ранее (Галанина и др., 1988) при работе с C. japonica было показано, что для роста гриба можно использовать смеси различных моносахаридов (как пентоз, так и гексоз).

Предоставленный для исследований гидролизат древесины был получен из хвойных пород деревьев (отходы лесоперерабатывающей промышленности) под действием ферментов карбогидраз (целлюлаз и сопутствующих ферментов), синтезированных промышленными штаммами Trichoderma sp. и Penicillium sp. – суперпродуцентами карбогидраз, выделенных в Институте биохимии им. А.Н. Баха (18). Суммарное содержание сахаров в гидролизате составило 3.2%, при этом преобладающим компонентом была глюкоза, в меньших количествах присутствовали ксилоза и арабиноза.

Полученные результаты указывают на то, что среда с гидролизатом древесины пригодна для роста гриба, при этом величина накопленной биомассы и содержания в ней липидов несколько меньше соответствующих величин контроля, что может быть объяснено меньшим начальным содержанием сахаров в среде. Был рассчитан экономический показатель как для синтетической среды с глюкозой, так и для опытной среды с гидролизатом древесины. Для синтетической среды величина данного показателя составила 3.2 и 3.6 для штамма F-470 и F-930 соответственно и на среде с гидролизатом древесины – 3.3 и 3.4 соответственно.

Таким образом, с учетом экономического показателя среда с гидролизатом древесины может рассматриваться в качестве перспективной замены среды с глюкозой.

Подходы к использованию лигнина для производства биодизеля Среди отходов до настоящего времени слабо используемых для получения продуктов, необходимых для жизнедеятельности человека, на первое место следует поставить лигнин. Лигнин является вторым по распространенности после целлюлозы природным соединением, имеющим ароматическую структуру и играющим ключевую роль в цикле углерода (1). Стоит отметить, что в отличие от целлюлозы и других распространенных природных полимеров молекула лигнина: 1) состоит из мономеров имеющих ароматическую, а не углеводную структуру; 2) имеет не линейную, а объемную жесткую структуру.

Лигнин в отличие от целлюлозы используется в природных условиях значительно медленнее, и поэтому скорейшая ликвидация запасов лигнина и использование его в виде необходимых человеческому социуму продуктов (фурфурола, гидролизного спирта, сахаров) возможны при создании экологически безопасных биотехнологических производств, в которых в качестве продуцента можно использовать базидиомицетные грибы (2). Грибы-возбудители белой гнили являются единственными организмами, способными в определенных условиях интенсивно разлагать лигноцеллюлозные субстраты.

Несмотря на то, что изучением деградации лигнина дереворазрушающими грибами занимаются с 18-го столетия, имеющиеся в литературе данные о деградации лигноцеллюлозных субстратов позволяют заключить, что процесс разрушения целлюлозы изучен значительно лучше, чем предполагаемые схемы деградации лигнина, которые носят иногда гипотетический характер (46).

Между тем, освоение биопереработки лигнина обеспечивало бы такие производства, как биодизель, животноводство и растениеводство, лишь малая его часть вовлекается в технологические процессы в целлюлознобумажной промышленности (около 70 млн.т/год). При этом только 1 млн.т./год реально используется, причем на 95% в виде лигносульфоната.

В предварительных опытах была предпринята попытка использовать один из биотехнологических приемов – совместное выращивание на лигносульфонате натрия (ЛСН) базидиальных лигнинразрушающих грибов, в частности Lenthinus tigrinus,и внесение в ферментационную реду на 3-4 сутки спорового материала C. japonica, не давшая положительных результатов. Поэтому было принято решение провести скрининг базидиальных грибов, целью которого было выявление организма, обладающего наибольшей способностью к разрушению лигнина, а в дальнейшем найти условия культивирования усиливающие рост отобранного штамма на среде с лигносульфонатом и изучить процесс липидообразования.

В процессе были испытаны следующие культуры грибов: Lentinus tigrinus, Stereum hirsutum, Kuehneromyces mutabilis, Ceraporia viridians, Hericium corolloidas, Pleurotus ostreatus.

Культивирование проводили на природных лигноцеллюлозных субстратах – сосновых опилках (СО) и лузге подсолнечника (ЛП).

Наибольшее обрастание мицелием СО было отмечено для L.tigrinus на вариантах среды СО-1 (см. Питательные среды, использовавшиеся в работе) и СО-4, наименьшее – для H.corolloides. У всех исследованных грибов наиболее интенсивное обрастание СО отмечалось после 10 суток выращивания.

В следующих опытах в качестве природного источника лигнина использовали ЛП. Обрастание мицелием наблюдалось на 8 сутки в варианте среды ЛП-1 только у L.tigrinus, у остальных грибов слабое обрастание наблюдалось после 10 суток культивирования. В этих опытах отметили еще одну закономерность – на среде ЛП-2 (с добавлением 0.5% глюкозы) рост всех грибов на данном типе субстрата значительно ускорялся, причём данная тенденция наиболее заметна у L.tigrinus – на 10 сутки практически вся поверхность чашки с лузгой была покрыта растущим мицелием.

Таким образом, на основании проведенного скрининга грибов, отобранных согласно литературным данным, как наиболее активные биоразрушители лигнина, для дальнейших исследований был выбран L.

tigrinus.

Основные опыты проводили на жидких питательных средах. В качестве контроля была среда, где в качестве источника углерода использовали глюкозу (5%). В опытных вариантах глюкоза была заменена на ЛСН или же в среду с ЛСН дополнительно вносили 0.5 % глюкозы для интенсификации ростовых процессов и индукции лигнолитических ферментов. Рост L. tigrinus контролировали в условиях глубинного культивирования с интенсивным перемешиванием (8,0-8,2 мг O2/л) и поверхностной культуры (2,5-2,6 мг O2/л). Установлено, что количество кислорода в среде оказывает значительное влияние на рост гриба. В условиях сильной аэрации (глубинное культивирование на качалке, скорость вращения 250 об./мин) на среде с добавлением «затравки» получен наиболее высокий выход биомассы, почти на одну треть превышающий количество биомассы в контроле (табл._). Из полученных результатов можно также заключить, что для разрушения лигнина необходим начальный, более доступный источник углерода, который обеспечил бы начало ростовых процессов и индукцию лигнолитических ферментов.

Интересно, что в природных условиях базидиальные лигнинразрушающие грибы сосуществуют обычно совместно с бактериями, причем в древесном опаде первоначально происходит разрушение целлюлозы, продукты деградации которой могут служить источниками для первоначальных ростовых процессов (4).

Новые данные были получены при изучении липидообразования L.

tigrinus в зависимости от условий культивирования (табл._). На среде с лигносульфонатом натрия при усиленной аэрации, и особенно на среде с доволнительной затравкой глюкозы, выход липидов был выше, чем в контроле, по сравнению с поверхностным культивированием. Следует отметить, что усиленная аэрация повышает выход липидов и на среде с одним лигнином.

Насыщенность среды кислородом влияет и на состав липидов L.

tigrinus. Наибольший интерес представляет тот факт, что на среде I обнаружено самое высокое содержание фосфатидной кислоты (ФК), особенно в условиях более высокого уровня аэрации. При этом отмечались значительные изменения в составе фосфолипидов мембран – уменьшением уровня содержания фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и фосфатидилсерина (ФС). При этом в клеточных липидах происходили изменения в соотношении этерифицированных (ЭСт) и свободных стеринов (CCт) (табл._). Содержание ЭСт уменьшалось, отмечалось снижение уровня свободных жирных кислот (СЖК). В составе жирных кислот (ЖК) общих липидов во всех вариантах опыта преобладала линолевая кислота (табл._). Изложенные данные об изменениях в составе мембранных липидов у L. tigrinus хорошо соответствуют теории перекисного окисления липидов грибов под влиянием поражающего действия свободнорадикального окисления (15), и позволяют предположить, что разрушение лигнина является результатом этого процесса. Предположение о том, что потребление грибами лигнина связано с действием свободных радикалов, разрушающих липидные мембраны, возможно связано с интенсификацией синтеза ФК (14). В связи с этим заслуживают внимания данные о том, что при добавлении глюкозы в качестве «затравки» ростовых процессов в условиях усиленной аэрации сохраняется липидный состав, близкий к контрольному, значительно уменьшается уровень ФК, что обеспечивает интенсификацию ростовых процессов.

В настоящее время известно, что в мицелии грибов активные формы кислорода (АФК) функционируют также как сигнальные молекулы, регулирующие фитологические ответы на процессы роста и развития грибов [5_]. Поэтому большой интерес в настоящее время вызывает гипотеза, появившаяся ещё в 70 годах прошлого столетия, о том, что в разрушении древесины мицелиальными грибами значительная роль принадлежит экстрацеллюлярным реактивированным формам кислорода, которые делают ригидную структуру лигнина более доступной для атаки лигнолитическими ферментами гриба (5,6). Предполагают также, что воздействие СРО должно быть первоначальным, и только в дальнейшем участвуют активные ферменты типа лакказ и происходит разрушение лигнина. В атаке на полимерный лигнин особое значение придают гидроксильным радикалам (ОН), пероксил-радикалам (ROO) и оксипероксил радикалам (ООН). В пользу значительной роли СРО в разложении лигнина грибами свидетельствует тот факт, что деградация лигнина является облигатно аэробным процессом (7), что подтверждается и результатами, описанными выше.

Мы предположили, что проверить значение СРО в деградации лигнина грибами можно ингибируя генерацию свободных радикалов путем введения антиоксидантов (АО), так как известно, что имеются два пути гашения СРО:

ферментный – супероксиддисмутаза (СОД) и наличие АО (4). Вероятно, присутствие АО должно повлиять на рост гриба, так как затруднит потребление лигнина, что должно отразиться на выходе биомассы.

В качестве антиоксиданта применяли 3-гидрокси-6-метли-2-этилгидрохлорид, который в концентрации 2 10-4 М вносили в 48 ч культуру гриба L.tigrinus. Культивирование продолжали 7 суток.

При внесении АО в среду выращивания L.tigrinus происходит ингибирование роста гриба (почти на 50%). Как отмечалось ранее, добавление «глюкозной затравки» к среде с ЛСН приводит к значительной интенсификации ростовых процессов, и выход биомассы увеличивается.

Однако, и в этом случае внесение АО также приводит к некоторому ингибированию ростовых процессов,но выход биомассы подавляется незначительно по сравнению с контролем (табл._). Введение АО в среду с ЛСН влияет на выход липидов, при этом их количество уменьшается.

Как отмечалось ранее рост гриба в присутствии ЛСН оказывает значительное влияние на состав фосфолипидов (ФЛ) мембраны (табл._).

Основным отличием было резкое повышение уровня фосфатидной кислоты (ФК), превышающей уровень фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и фосфатидилхолина (ФХ) почти в два раза и низкое содержание фосфатидилинозитола (ФИ). Введение АО изменяет состав ФЛ – содержание ФК несколько уменьшается, уровень ФЭА остается практически без изменений, но почти вдвое уменьшается содержание ФХ на фоне значительного увеличение ФИ. Известно, что передачу сигналов при изменении внешних условий у грибов осуществляют в основном два мессенджера – ФК и инозитол-4,5-дифосфат, образующиеся из ФИ ().

Изменения в составе ФЛ позволяют предположить, что введение АО влияет на состав мессенджеров и кроме ФК передача сигналов осуществляется по инозитидному пути, о чем может свидетельствовать почти 4-5 кратное увеличение инозита в мембране и снижения уровня ФХ (11).

Интерес представляют данные, свидетельствующие о том, что действие АО на интенсивность ростовых процессов сильно зависит от источника углерода. В присутствии глюкозы АО увеличивает выход биомассы у L.tigrinus (табл._) в среднем на 15-20%, но ингибирует процесс липидообразования.

В дальнейших исследованиях представляет интерес сопоставить данные о влиянии АО на рост и липидообразование грибов белой гнили и грибов, например, мукоровых, не способных разрушать лигнин.

Данные по влиянию АО на рост и липидообразование мукоровых грибов, в частности Cunninghamella japonica, представлены в табл._, (источник углерода – глюкоза). Из этих данных следует, что добавление АО в трофофазе увеличивает выход биомассы и липидов.

Изучили также влияние АО на состав липидов C.japonica. У C.japonica АО значительно увеличивает выход ФЭА и ФС, но ингибирует образование ФИ, содержание которого уменьшается. Обращает на себя внимание, что у C.japonica АО стимулирует синтез в мембранах гриба ФЭА и ФС, что делает липидный бислой более ненасыщенным. В то же время у L.tigrinus на среде с ЛСН при действии АО содержание этих липидов практически не меняется, но в мембране увеличивается содержание гликолипидов и ФИ.

Таким образом, в проведенном исследовании показано положительное действие кислорода и впервые показано, что внесение АО в культуру L.tigrinus. растущего на ЛСН, приводит к подавлению ростовых процессов, синтеза липидов и изменению их состава в липидном бислое.

Обогащение культуры L.tigrinus АО приводит к подавлению реакций СРО, а это по существующей гипотезе может подтверждать роль ОН-радикалов в начальных этапах разложения лигнина.

Несомненный интерес представляет тот факт, что рассмотренные выше закономерности не подтверждаются, если к ЛСН добавить 0,5% глюкозы (табл._) и тогда различие в интенсивности ростовых процессов становится незначительным. Более того, при выращивании L.tigrinus на среде без лигнина, где источником углерода служит одна глюкоза, мы можем отметить те же закономерности в действии АО, что и у грибов, не способных использовать лигнин, т.е. АО выступает, как стимулятор ростовых процессов. Эти данные ещё раз подчеркивают субстратную специфичность лигнина и предполагают определенную роль СРО в его использовании в конструктивном метаболизме.

Особый интерес представляет различное влияние АО на фосфолипиды ( ФЛ ) мембраны грибов, растущих на ЛСН и глюкозе. Из сравнения состава ФЛ L.tigrinus, культивируемого на этих средах, можно предположить ещё одну особенность в метаболизме грибов, растущих на лигнине: вторичным мессенджером здесь, вероятно, является ФИ, который служит ключевым компонентом в сигнально трансдукционным механизме (11,12). В то же время при росте на ЛСН без добавления АО сигнальным мессенджером является ФК.

Таким образом, настоящее исследование подтверждает гипотезу (5,6) о роли СРО в биодеградации лигнина и участие биогенных пероксидрадикалов в этом процессе. Полученные данные открывают также пути создания биотехнологии биодеградации лигнина - это использование соединений – стимуляторов свободных радикалов – т.е. обогащения среды выращивания Н2О2 или кислородом. Однако, тут надо найти тонкую грань между интенсивностью СРО и необходимостью АО для поддержания ростовых процессов, так как без последних не могут осуществляться рост грибов и сохраняться липидный бислой (5).

В целом, данные, изложенные в настоящей главе позволили оптимизировать среду для выращивания продуцента, введя в нее дешевый источник азота – аммонийный азот, при этом ОП липидов не понижается и не меняется их жирнокислотный состав. Наиболее дешевым источником углерода могут служить отходы от картофельных производств или отход от производства биодизеля – глицерин, которые могут заменить почти половину глюкозы в ферментационной среде без снижения выхода конечного продукта. Хотя в настоящее время глюкоза, получаемая из целлюлозы за рубежом является дешевым источником углерода и широко используется в биотехнологии, проведенные исследования о роли СРО в начальных этапах деградации лигнина открывают новые перспективы для создания биотехнологии его биодеградации.

Глава 4. Оптимизация получения спорового посевного материала В настоящее время при создании биотехнологии грибных производств очень много внимания уделяется такой составляющей как подготовка активного спорового посевного материала и разработка способов его сохранения для проведения целевых ферментаций.

В современных опытно-промышленных регламентах (ОПР) обычно указывается скорость прорастания посевного материала и процент его всхожести, но очень редко приводятся данные о типе покоя спор, активаторах прорастания и возрастной активности спорового посевного материала. Между тем, эти данные позволяют значительно увеличить выход конечного продукта. В ряде биотехнологий уже используются стимуляторы прорастания, контролирующие этот процесс. Так, у многих грибов жирные кислоты, в частности С18:2, являются необходимым компонентом в процессе спорогенеза. Так для у которой процесс Alternaria tomato, конидиообразования протекает только в присутствии света, линолевая (С18:2) и линоленовая (С18:3) кислоты являются спорогенными факторами. В последние годы все чаще используют активаторы прорастания спор или ингибиторы этого процесса, что позволяет более тонко управлять ферментацией и влиять, таким образом, на его стоимость. Полученные в этом направлении данные могут быть использованы для создания биотехнологии получения активного посевного материала.

Для создания биотехнологии производства биодизельного топлива необходимо иметь активный, т.е. быстро и синхронно прорастающий посевной материал. Посевным материалом в биотехнологии служат спорангиоспоры, конидии, стилоспоры, характеризующиеся различным типом и продолжительностью покоя, способностью к хранению и прорастанию. Поэтому установление особенностей прорастания спор грибов может не только способствовать пониманию общих биологических закономерностей, но и помогать оптимизации производства. Разработки в этом плане мы основываем на следующих теоретических обобщениях: 1) о влиянии химического состава посевных спор на выход конечного продукта; 2) роли трегалозы в процессе хранения посевных спор, и 3) типах покоя, стимуляторах и ингибиторах прорастания спор.

Впервые в работе было изучено влияние экзогенной трегалозы при внесении ее в среду выращивания на рост, липидный состав и выход конечных продуктов. В этих опытах мы исходили из следующих соображений: 1) концентрация трегалозы в среде определяет ее функцию как ингибитора или стимулятора ростовых процессов (патент РФ №2403794); 2) обычно трегалоза появляется в процессе роста грибов в идиофазе, и ее присутствие связывают с интенсификацией липидообразования, что позволяло предположить, что таким способом можно будет увеличить выход липидов. ().

Таким образом, целью данного этапа работы было изучение процесса прорастания спор гриба – продуцента биодизеля, связь этого процесса с продолжительностью хранения посевного материала, с энергетическим запасом клетки – нейтральными липидами, и их составом, изучение закономерностей изменения состава полярных липидов с целью повышения его всхожести, стабильности хранения и увеличения выхода конечного продукта.

Установление типа покоя спор C. japonica.

В отличие от большинства мукоровых грибов C. japonica не имеет многоспоровых спорангиев или спорангиолей, а образует на поверхности апекса конидиеносца споры на коротких стеригмах, которые многие микологи трактуют как односпоровый спорангий, имеющий двухслойную стенку.

В ходе работы было установлено, что для выхода из состояния покоя спорам C. japonica не требуется каких-либо дополнительных факторов, кроме присутствия воды. Так уже через 1 час после помещения спор в дистиллированную воду происходит активное формирование тонких разветвленных гиф, к 3му часу почти все (99%) споры прорастают (рис. _).

–  –  –

Изучение процесса прорастание спор C. japonica в тонком слое суслоагара (СА) и голодного агара (ГА).

При изучении прорастания спор на СА установлено, что споры через 1-1,5 ч начинают набухать, происходит постепенное увеличение диаметра спор. Еще спустя 1-1,5 ч. происходит появление зачатков будущих ростковых трубочек. К 3му ч появляются ростковые трубочки, а к 5-му – ростковые трубочки имеются у 60-70% спор, у некоторых спор по 2-3 трубочки (рис._). Как видно из графика, диаметр спор увеличивается на протяжении всего процесса прорастания (рис. ).

Характер прорастания спор на ГА отличается от такового на СА (рис.). Так, уже через 1 ч споры начинают образовывать тонкие сильно разветвленные гифы.

Также менее выражено увеличение диаметра спор на стадии набухания. Степень прорастания спор на ГА была больше по сравнению с СА, уже к 3 ч почти все споры прорастали.

Выявлена зависимость способности к прорастанию спор гриба от их возраста: отмечено снижение способности прорастания по мере увеличения возраста спор, особенно резко это снижение выражено между 21 и 28 сутками (рис._).

–  –  –

Рис.. Сохранение способности к прорастанию спор C. japonica в зависимости от их возраста.

Изучение влияния экзогенных источников азота и углерода, а также цАМФ на прорастание спор C. japonica.

Полученные результаты показали, что при добавлении Glc, Pro, Tre и Pep проросшие споры C. japonica появляются уже на 2-ой час. При добавлении же cAMP, Man, Glc+Pro прорастание спор начинается спустя 3 часа (рис._).

Следует отметить, что различия в проценте проросших спор, имеющиеся на 3-4 час нивелируются уже к 5-му часу после начала опыта (рис. _).



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Программы вступительных испытаний по магистерским программам в 2016 году "Технологии параллельного программирования и высокопроизводительные вычисления" 3 "Микробиология и вирусология" "Расчет и конструирование зданий и сооружений промышленного и гражданского назначения" "Интеллектуальные сист...»

«Некоторые моменты суеверии Автор: Administrator 03.02.2009 23:22 v:* {behavior:url(#default#VML);} o:* {behavior:url(#default#VML);} w:* {behavior:url(#default#VML);}.shape {behavior:url(#default#VML);} Normal 0 false false false MicrosoftInternetExplorer4 /*...»

«2 1. Цели и задачи дисциплины: Целями освоения дисциплины "Экология" являются получение теоретических знаний в области взаимосвязей между живыми организмами и средой их обитания понимание непрерывности и взаимообусловленности при...»

«Перевозкина Маргарита Геннадьевна ТЕСТИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Монография Новосибирск УДК 54+615 ББК 24+52.8 П26 Главный редактор: Дмитриева Н.В., кандидат медицинских наук, доктор психологических наук, профессор....»

«VI МЕЖВУЗОВСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ПО ИТОГАМ ПРАКТИК ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ РАЗВЕДКА И ДОБЫЧА ГОРЮЧИХ ИСКОПАЕМЫХ ГЕОЛОГИЯ ГЕОГРАФИЯ БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ Москва, 2014 УДК 553.9 ББК 26.343я43 Р 17 Редакторы: И.Д. Агапитов, В.В. Панков, Т.В.Попова, В.Д. Скарятин Р 17 Разведка и добыча горючих ископа...»

«РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНСТИТУТ МАТЕМАТИКИ, МЕХАНИКИ И КОМПЬЮТЕРНЫХ НАУК ИМ. ВОРОВИЧА И.И. ИНСТИТУТ АРИДНЫХ ЗОН ЮЖНЫЙ НАУЧ...»

«ISSN 0869-4362 Русский орнитологический журнал 2013, Том 22, Экспресс-выпуск 916: 2413-2422 Георгий Александрович Новиков (к 60-летию со дня рождения) А.С.Мальчевский Второе издание. Первая публикация в 1970* 7 ноября 1970 года Георгию Александровичу Новикову – известному специалисту в области изучения биологии млекопитающих и птиц, доктору...»

«Министерство образования Российской Федерации Томский государственный педагогический университет В.П. Перевозкин, М.И. Гордеев ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ НИША Методическая разработка Томск ББК 20.1я73 Печатается по решению П 27 редакционно-издательского совета Томского государственног...»

«Утверждаю: ПОЛОЖЕНИЕ о XIX реСllуБЛIIЮIIIСКОМслёте ЮIIЫХэкологов 1. Общие положення 1.1. XIX республиканский слёт юных экологов (далее Сл,;:т) про водится с целью развития исследовательской и природоохранной деятельности обучающ...»

«УДК 631.4 ББК40.3 С81 Серия "Приусадебное хозяйство" основана в 2000 году Подписано в печать 03.02.05. Формат 84x108/32. Усл. печ. л. 8,4. Тираж 5000 экз. Заказ № 5390. Сто и один секрет плодор...»

«М. А. Григорьева, Д. А. Маркелов, А. В. Маркелов и др. Технологии распознавания территории по образу на карте, космо-, аэрофотоснимке, фотографии (ГИС-технологии "с одного взгляда") УДК 911:574 ТЕХНОЛОГИИ РАСПОЗНАВАНИЯ ТЕРРИТОРИИ ПО ОБРАЗУ НА КАРТЕ, КОСМО-, АЭРОФОТОСНИМКЕ, ФОТОГРАФИИ (ГИС-ТЕХНОЛОГИИ "С ОДНОГО ВЗГЛЯДА")...»

«ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАФЕДРА БИОЛОГИИ А.Б. ХОДЖАЯН, Э.Н. МАКАРЕНКО, А.К. МИХАЙЛЕНКО, Н.Н. ФЕДОРЕНКО, М.Г. ГЕВАНДОВА, М....»

«24 ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА 2012. Вып. 1 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ Ботанические исследования УДК 58.006 : 502.75 (470.023-25) (026) К.Г. Ткаченко РЕДКИЕ ВИДЫ И УНИКАЛЬНЫЕ ЭКЗЕМПЛЯ...»

«ЦАТУРЯН Людмила Дмитриевна СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОРГАНИЗМА ОБСЛЕДОВАННЫХ РАЗНЫХ ЭТНИЧЕСКИХ ГРУПП 03.00.13 – физиология АВТОРЕФЕРАТ дисс...»

«РАСТИТЕЛЬНЫЙ МИР КАРЕЛИИ ЦВЕТКОВЫЕ РАСТЕНИЯ П Е Т Р О З А В О Д С К " К А Р Е Л И Я " 1983 А. С. ЛАНТРАТОВА, Н. В. ЛЕБЕДЕВА, М. В. ЧЕХОНИНА, Н. В. ШТАНЬКО Рецензенты: кандидат биологических наук В. Ф. Юдина и кандидат сельскохозяйственных наук И. В. Ильина Ц27 Цветковые растения. А. С. Л а н т р а т о в а, М. В. Ч е ­ хонина, Н. В. Ш т а н ь к о. — П...»

«РОЖКОВАН КОНСТАНТИН ВАСИЛЬЕВИЧ Молекулярная эволюция 18S рДНК и генетическое разнообразие осетров Амура Acipenser schrenckii Brandt, 1869 и Huso dauricus (Georgii, 1775) 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владиво...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов РБ по естественнонаучному образованию Учебно-методическое объединение вузов РБ по экологическому образованию УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Министра образования Республики Беларусь А.И. Жук _15_ 06 2009 г. Регист...»

«УДК 574.42, 547.23 + 502.75:581.5, 581.524.34, 581.527.7, 581.55 К.М. Преображенская ВЛИЯНИЕ УВЛАЖНЕННОСТИ МЕСТООБИТАНИЯ НА ЧИСЛЕННОСТЬ И ВИДОВОЙ СОСТАВ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ (OLIGOCHAETA, LUMBRICIDAE) В САНК...»

«Лынов Александр Васильевич ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЖУКОВ-ЖУЖЕЛИЦ (INSECTA, COLEOPTERA, CARABIDAE) АГРОЭКОСИСТЕМ ВОРОНЕЖСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность: 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук ВОРОНЕЖ – 2008 Работа выполнена на кафедре экологического образования Воронежского...»

«М И Н О БРН А У К И РО С С И Й С К О Й Ф ЕД ЕРА Ц И И Н иж егородский государственны й технический университет им. Р.Е.А лексеева К аф едра "П роизводственная безопасность, экология и химия" В.И. Миндрин ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ Рекомендовано Ученым советом Нижегородского...»

«ГЕНЕТИКА ПРОКАРИОТ Лекция 2. раздел ГЕНЕТИКА КЛЕТОЧНЫХ ОРГАНЕЛЛ дисциплина СТРУКТУРНАЯ ГЕНОМИКА Рекомендуемая литература Пиневич, А.Б. Микробиология. Биология прокариотов: учебник. Т. 3. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2009. 457 с Словарик Kb – kilobase 1000 п.н....»

«Тишин Денис Владимирович ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РАДИАЛЬНЫЙ ПРИРОСТ ОСНОВНЫХ ВИДОВ ДЕРЕВЬЕВ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ Специальность 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2006 Работа выполнена в лаборатории биомониторинга Института экологии приро...»

«ЩЕРБИНА Георгий Харлампиевич ИЗМЕНЕНИЕ ВИДОВОГО СОСТАВА И СТРУКТУРНО– ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МАКРОЗООБЕНТОСА ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ СЕВЕРО–ЗАПАДА РОССИИ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРИРОДНЫХ И АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссерта...»

«Клиентский регламент (Условия) осуществления депозитарной деятельности КИТ Финанс (ООО) Приложение №2б Договор о междепозитарных отношениях № КИТ Финанс (Общество с ограниченной ответственностью), именуемое в дальнейшем Депозитарий, имеющее лицензию профессионального участника рынка ценных...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Зоологический институт Программа фундаментальных исследований Президиума РАН “Живая природа: современное состояни...»

«Муниципальное учреждение культуры "Централизованная библиотечная система" города Кирово-Чепецка Кировской области" Девиз "Экология-Безопасность-Жизнь" Материалы на городской конкурс "За наибольший вклад в проведение Общероссийских дней защиты от экологической...»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.