WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«ЭЛЕКТРОГЕННЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА НА ДОНОРНОМ УЧАСТКЕ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ФОТОСИСТЕМЫ 2 ...»

На правах рукописи

Курашов Василий Николаевич

ЭЛЕКТРОГЕННЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА НА ДОНОРНОМ

УЧАСТКЕ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА

ФОТОСИСТЕМЫ 2

03.01.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учной степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского и на кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук Мамедов Махир Джафар оглы доктор биологических наук Нокс Пётр Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Красновский Александр Александрович кандидат физико-математических наук Трубицин Борис Вячеславович

Ведущая организация: Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Защита состоится 10 июня 2010 г. в __ часов __ минут на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая»



С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «____» ___________ 2010 г.

Учный секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фотосинтез – процесс, с помощью которого фототрофные организмы преобразуют энергию излучения Солнца в энергию химически стабильных органических соединений. В результате фотосинтеза ежегодно происходит выделение 150-200 млрд. тонн молекулярного кислорода в атмосферу Земли и образуется около 200 млрд. тонн первичной биомассы (Barber 2007).

Первичные процессы фотосинтеза в цианобактериях, водорослях и высших растениях осуществляются в тилакоидных мембранах, где локализованы трансмембранные белковые комплексы фотосистемы 2 (ФС 2), цитохрома b6f и фотосистемы 1. Светозависимое окисление воды и выделение молекулярного кислорода катализируется комплексом ФС 2, представляющим собой Н2Опластохинон-оксидоредуктазу, механизм функционирования которой до сих пор является предметом интенсивных исследований.

Сложность исследования функционирования этого фермента обусловлена его лабильностью, а также тем, что суммарный процесс включает ряд сопряженных реакций:

светоиндуцированное разделение зарядов между первичным донором электронов P680 и первичным хинонным акцептором Q A, последующее одноэлектронное восстановление Р680+ редокс-активным аминокислотным остатком YZ (тирозин 161 D1-полипептида реакционного центра), двухэлектронное восстановление вторичного хинонного акцептора Q B и четырехэлектронное окисление молекулы воды.

Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования ФС 2 является выяснение механизма переноса зарядов на донорном участке фермента, содержащем кластер Mn4Ca, его лигандное окружение и близлежащий тирозин YZ. Перспективным подходом в этих исследованиях является изучение механизма генерации трансмембранной разности электрических потенциалов () комплексами ФС 2 в условиях однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений по сравнению со стационарными процессами.





Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование механизмов переноса электрона на донорном участке пигмент-белкового комплекса ФС 2 с помощью флуориметрических и прямого электрометрического методов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности реакции переноса электронов в ядерных комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера [ФС 2 (Mn)] и сопоставить полученные данные с результатами для нативных комплексов ФС 2.

2. Исследовать механизм реакции переноса электрона между реконструированным марганцем и радикалом тирозина Y Z в комплексах ФС 2 (Mn).

3. Изучить реакцию переноса электрона от марганца к тирозину Y Z в препаратах ФС 2 (Mn) с блокированным железом высокоаффинным сайтом связывания марганца.

4. Исследовать влияние различных экзогенных доноров электронов и синтетических марганец-содержащих комплексов на кинетику генерации мембранного потенциала.

5. Описать механизм восстановления тирозина Y Z от искусственных доноров электронов.

Научная новизна работы.

В условиях реконструкции транспорта электрона в присутствии экзогенного Mn2+ в препаратах ФС 2 (Mn) было продемонстрировано наличие дополнительной электрогенной фазы, обусловленной восстановлением редоксактивного тирозина YZ от Mn. Было выявлено два участка окисления марганца и показано, что перенос электрона через низкоаффинный сайт не сопряжен с образованием мембранного потенциала. Обнаружено, что электрогенный характер восстановления тирозина YZ не является специфичным для марганца, а имеет место и в случае искусственных доноров электронов (дифенилкарбазид, синтетический трехъядерный марганцевый комплекс). При этом наблюдаемая значительная по амплитуде дополнительная электрогенная стадия свидетельствует о достаточно низкой диэлектрической проницаемости на участке белка между YZ и границей белок-вода. Предложена модель, согласно которой низкомолекулярный донор электронов гидроксиламин может диффундировать через каналы на донорной стороне белка к марганецсвязывающему сайту с последующим восстановлением YZ•.

Практическая значимость исследования. Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современный уровень знаний о механизмах функционирования пигмент-белкового комплекса ФС 2 и важны для понимания процессов переноса зарядов на донорной стороне ФС 2.

Результаты могут быть использованы в биотехнологии для создания эффективных искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергию; в устройствах, осуществляющих фотолиз воды с образованием водорода и кислорода.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру: структура и функции фотосистем» (г. Пущино, Московская область, 2006); 16-ой международной ежегодной конференции по фотосинтезу «Норд-Вест» (г.

Мюльхайм, Германия, 2007); V Съезде Российского фотобиологического общества и международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (г. Пущино, 2008); XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (г. Пущино, 2009).

Работа была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ и на кафедре биофизики биологического факультета МГУ.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 – в реферируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 29 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 164 источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ядерные комплексы ФС 2, содержащие весь набор функциональных кофакторов, включая вторичный хинонный акцептор QB, выделяли из шпината в присутствии глицинбетаина. Комплексы ФС 2, лишнные марганцевого кластера [ФС 2 (Mn)] получали путм обработки нативных комплексов 0,9 М Tris буфером (pH 9,0) в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы с блокированным высокоаффинным сайтом связывания марганца [ФС 2 (Mn+Fe)] были получены путм инкубации ФС 2 в присутствии 15 мкМ FeSO4 при слабой интенсивности света (15 мкЕ/м2·с) (Semin and Seibert, 2002).

Липосомы получали в результате озвучивания суспензии азолектина (L-лецитин, тип II-S, Sigma) в среде, содержащей 50 мМ HEPES-NaOH (pH 7,5) буфера и 1,4% холата натрия до просветления. Протеолипосомы готовили путем смешивания липосом с ФС 2 в соотношении липид:белок 50:1 по весу.

Удаление детергента осуществлялось на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной соответствующим буфером.

Кинетику индукции и переменную флуоресценцию образцов измеряли при помощи флуорометра FL3000 (Photon Systems Instruments, Чехия) в кювете толщиной 10 мм при 20°С. Интенсивности измерительного и действующего света при регистрации переменной флуоресценции составляли 6,6 мВт/м2 ( = 617 нм) и 60 Вт/м2 ( = 625 нм), соответственно. Кинетику индукции 130 Вт/м2 флуоресценции измеряли при интенсивности света равной ( = 625 нм). Концентрация хлорофилла в образцах ФС 2 составляла 10 мкг/мл.

Исследования кинетики генерации в ответ на вспышку света проводили с помощью прямого электрометрического метода. Суть метода сводится к регистрации разности электрических потенциалов по обе стороны коллодиевой плнки, пропитанной раствором фосфолипидов в декане, со встроенными в нее замкнутыми белково-липидными везикулами, сохраняющими внутреннюю водную полость. Разность потенциалов измеряли при помощи экранированных от света хлорсеребряных электродов, соединенных через операционный усилитель фирмы «Burr Brown» 3554 ВМ (США) с аналого-цифровым преобразователем «CompuScope 8012A» и персональным компьютером.

Для возбуждения образцов использовался неодимовый лазер «Quantel YGФранция) (длина волны 532 нм, полуширина импульса 12 нс).

Анализ полученных кривых проводили при помощи программных пакетов Pluk (Kalaidzidis et al., 1997) и Origin 7.5 (OriginLab Corporation, США).

Аппроксимация кинетик фотоэлектрического ответа проводилась методом последовательных приближений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Транспорт электрона на донорном участке ФС 2 и его реконструкция в препаратах, лишённых марганцевого кластера Ядерные комплексы ФС 2 представляют собой минимальную структурнофункциональную единицу, способную катализировать окисление воды. В нативных препаратах ядерных комплексов ФС 2 наличие Mn4Ca кластера предотвращает реакцию окисления экзогенных доноров электронов редоксактивным аминокислотным остатком – тирозином YZ. Поэтому для исследования реакции переноса зарядов на донорном участке фермента в присутствии экзогенных доноров электрона нами были использованы ядерные комплексы ФС 2 (Mn). Экстракция ионов Mn сопровождается также удалением иона Ca2+ и трх периферических белков, локализованных на донорном участке ФС 2.

На рис. 1 показаны светоиндуцированные изменения переменной флуоресценции (F) в нативных ядерных комплексах и в ФС 2 (Mn). Видно, что экстракция Mn приводит к значительному уменьшению F. Это, вероятно, обусловлено отсутствием донирования электрона на фотоокисленный первичный донор электронов P680. Добавление Mn2+ в соотношении 4 иона Mn на один РЦ приводит к увеличению максимального уровня флуоресценции (F m), что может свидетельствовать о существенном восстановлении электронного транспорта к P680+.

Рис. 1. Фотоиндуцированные изменения переменной флуоресценции в нативных ядерных комплексах ФС 2 и в комплексах ФС 2 (Mn). Среда инкубации: 25 мМ HEPES (pH 7,5), 300 мМ сахарозы и 15 мМ NaCl. Концентрация хлорофилла 10 мкг/мл. Короткая стрелка соответствует измерительному свету, длинные стрелки вверх и вниз – включению и выключению возбуждающего света, соответственно.

Кроме того, реконструкция электронного транспорта на донорном участке фермента также была продемонстрирована с помощью регистрации кинетики индукции флуоресценции (данные не представлены).

На рис. 2 (кривая 1) показан электрический ответ протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn) при возбуждении единичными лазерными вспышками. Быстрая генерация за время короче временного разрешения измерительной установки (100 нс) обусловлена переносом электрона от Р680 к первичному хинонному акцептору Q A, с последующим ревосстановлением P680+ тирозином YZ (Semenov et al., 2006).

Рис. 2. Кинетика фотоэлектрических ответов в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2(Mn) в отсутствие (1) и в присутствии 10 мкМ MnCl2 (2). На вставке показан результат вычитания кривой 1 из кривой 2. Среда инкубации как на рис. 1.

В отсутствие экзогенных доноров и акцепторов электронов, кинетика спада фотоэлектрического ответа хорошо аппроксимируется двухэкспоненциальной кривой с характеристическими временами 1 ~0,24 мс (амплитуда А1 ~14%) и 2 ~250 мс (амплитуда А2 ~86%). Основная компонента спада 2 обусловлена рекомбинацией электрона между Q A– и YZ. Минорная компонента 1, вероятно, обусловлена рекомбинацией электрона между Р680+ и QA– во фракции комплексов с поврежденным переносом электрона от YZ на P680+.

При добавлении Mn наблюдается существенное замедление кинетики спада, которая аппроксимируется двумя экспонентами с 1 ~486 мс (~30%) и 2 ~2 с (~70%) (кривая 2) и, вероятно, обусловлена пассивной утечкой через липосомальную мембрану.

Кроме того, замедление кинетики спада на коротких временах (100 мкс) в присутствии Mn, вероятнее всего, свидетельствует о появлении в этих условиях фазы нарастания, замаскированной быстрой компонентой спада, природа которой не вполне понятна. Эта фаза нарастания выявляется при вычитании кинетики фотоэлектрического ответа в отсутствие Mn из кинетики фотоответа в его присутствии и представлена на вставке на рис. 2.

Наличие дополнительной генерации ( ~20 мкс), обусловлено векторным переносом электрона от Mn2+ к YZ. Следует отметить, что относительная величина этой электрогенной стадии (~5% от быстрой фазы) совпадает с YZ величиной электрогенеза, обусловленного восстановлением от марганцевого кластера в препаратах фотосистемы 2 с активным комплексом окисления воды (Haumann et al., 1997; Мамедов и др., 1999). Это позволяет предположить, что диэлектрическая проницаемость на участке от сайта связывания Mn до YZ в препаратах ФС 2, лишенных марганца, остается такой же, как и в нативных ядерных комплексах.

2. Исследование низкоаффинного сайта окисления марганца

Исследование окисления экзогенных катионов марганца, дифенилкарбазида (ДФК) и аниона йода на мембранных фрагментах ФС 2, лишенных марганцевого кластера позволило авторам работы (Blubaugh and Cheniae, 1990) заключить, что донорная сторона фермента содержит два отдельных сайта связывания марганца, характеризующихся разными константами скоростей окисления. Следует отметить, что поскольку основной путь переноса электрона осуществляется с участием тирозина Y Z (высокоаффинный сайт), исследование низкоаффинного сайта долгое время оставалось невозможным.

Ранее также было установлено, что катионы Fe 2+ с высокой эффективностью блокируют высокоаффинный сайт на мембранных препаратах ФС 2 (Mn) (Semin and Seibert, 2004). Это позволяет использовать катионы железа для изучения реакции окисления доноров электронов в низкоаффинном сайте комплексов ФС 2 (Mn).

В блокированных ионами железа препаратах ФС 2 (Mn+Fe), добавление катионов марганца в концентрации, насыщающей высокоаффинный сайт (К м в области 10 мкМ), практически не приводит к изменению переменной флуоресценции (рис. 3). Этот результат подтверждает факт блокирования высокоаффинного сайта катионом железа. Добавление существенно большей концентрации марганца (100 мкМ), сопоставимой с Км для низкоаффинного сайта окисления марганца сопровождается увеличением переменной флуоресценции. Эти данные свидетельствуют о переносе электрона на донорном участке фермента, минуя высокоаффинный сайт окисления марганца.

Рис. 3. Фотоиндуцированные изменения флуоресценции хлорофилла в нативных ядерных комплексах ФС 2 и в комплексах ФС 2 (Mn+Fe) в отсутствие и в присутствии марганца. Среда инкубации: 25 мМ MES (pH 6,5) 300 мМ сахарозы и 15 мМ NaCl.

Остальные условия как на рис. 1.

Как и в случае измерения переменной флуоресценции, добавление низких концентраций марганца к препаратам ФС 2 (Mn) с блокированным высокоаффинным сайтом практически не влияет на кинетику индукции флуоресценции (данные не представлены). Однако добавление Mn2+ в концентрации 100 мкМ приводит к восстановлению кинетики флуоресценции.

Таким образом, результаты, полученные с помощью флуоресцентных методов, свидетельствуют о наличии двух сайтов окисления марганца в ФС 2.

В дальнейших экспериментах с помощью прямого электрометрического метода было исследовано влияние экзогенного Mn2+ на генерацию в препаратах ФС 2 (Mn+Fe). Поскольку эффективность донирования электрона от Mn2+ к окислителю через высоко- и низкоаффинный сайты окисления при нейтральном значении рН больше, чем при низких значениях рН, регистрация осуществлялась при рН 7,5.

Рис. 4. Кинетика фотоэлектрических ответов в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2(Mn+Fe) в отсутствие (1) и в присутствии (2) 100 мкМ MnCl2. Среда инкубации как на рис. 1.

На рис. 4 показаны фотоэлектрические ответы протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn+Fe) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии 100 мкМ MnCl2 (кривая 2). Добавление катионов железа в концентрации, необходимой для блокирования высокоаффинного сайта окисления Mn, не влияло на кинетику генерации мембранного потенциала. Спад фотоэлектрического ответа (кривая 1) характеризуется экспонентами с 1

0.13 мс (А1 23%), 2 29 мс (А2 27%) и 3 217 мс (А3 50%). Компоненты с 29 мс и 217 мс, вероятно, отражают реакцию рекомбинации электрона между QA– и YZ, в то время как быстрая (0,13 мс) компонента характеризует процесс рекомбинации между QA– и Р680+.

В отличие от препаратов ФС 2 (Mn) в ядерных комплексах ФС 2 (Mn+Fe), добавление марганца приводит только к замедлению кинетики спада фотоэлектрического ответа (кривая 2). Разложение кинетической кривой спада фотоэлектрического ответа выявляет две экспоненты с ~23 мс (~17%) и 760 мс (~83%). Минорная фаза с ~23 мс, вероятно, обусловлена наличием фракции реакционных центров с поврежднным донорным участком.

Медленная фаза (~760 мс), наблюдаемая лишь при высокой концентрации ионов марганца, по-видимому, связана с предотвращением рекомбинации электрона между Q A– и YZ в результате донирования электрона от Mn, связанного в низкоаффинном сайте. Отсутствие дополнительного электрогенеза в кинетике фотоэлектрического ответа указывает на электронейтральную природу реакции переноса электрона между марганцем, связанным в низкоаффинном сайте и тирозином YZ. Это может быть связано с различным расположением высоко- и низкоаффинного сайтов относительно тирозина Y Z.

3. Влияние экзогенных доноров электронов на кинетику генерации

При исследовании донорного участка ФС 2 наиболее часто используемыми искусственными донорами электронов являются 1,5-дифенилкарбазид (ДФК) и гидроксиламин (NH2OH). Однако до сих пор вопрос о возможном электрогенном характере восстановления фотоокисленного РЦ ФС 2 от этих доноров не был исследован. Кроме того, если для ДФК окислителем в образцах ФС 2 (Mn) является радикал тирозина YZ, то для NH2OH природа окислителя не ясна. Эти обстоятельства побудили нас исследовать перенос электрона от ДФК и NH2OH к реакционному центру на протеолипосомах с ядерными комплексами ФС 2 (Mn) прямым электрометрическим методом.

На рис. 5 продемонстрированы фотоэлектрические ответы протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии искусственного донора электрона для YZ – ДФК (кривая 2) в ответ на единичные вспышки света. Амплитуда быстрой фазы, время нарастания которой меньше времени нашей измерительной системы (100 нс) соответствует разделению зарядов в реакционном центре ФС 2 между Р680 и QA с последующим ревосстановлением Р680+ путем переноса электрона от тирозина YZ. Кинетика спада аппроксимируется двумя экспоненциальными 5 мс компонентами, характеризующимися постоянными времени 1 (относительная амплитуда А1 ~6%) и 2 230 мс (А2 ~94%), и обусловленными рекомбинацией зарядов между QA– и YZ.

Рис. 5. Фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn) из шпината в отсутствие (1) и в присутствии 50 мкМ ДФК. Среда инкубации как на рис. 1. Стрелкой указан момент лазерной вспышки.

Добавление в среду инкубации 50 мкМ ДФК, как видно из кривой 2, приводит к замедлению спада и появлению дополнительного электрогенеза в миллисекундной шкале времени. Кинетика спада характеризуется двумя экспоненциальными фазами с 1 10 мс (А1 9%) и 2 930 мс (А2 91%).

Можно предположить, что наблюдаемая в таких условиях быстрая компонента спада (1) обусловлена рекомбинацией зарядов между Q A– и YZ, в то время как медленная основная компонента (2) отражает пассивную проницаемость протеолипосомальной мембраны.

Характерное время дополнительной фазы нарастания равно ~3 мс, а ее амплитуда составляет ~17% от амплитуды фазы, соответствующей образованию при переносе электронов между YZ и QA. Мы предполагаем, что дополнительная фаза генерации фотопотенциала, наблюдаемая в присутствии ДФК, отражает электрогенную реакцию переноса электрона между ДФК и тирозином YZ.

Следует отметить, что величина амплитуды дополнительной фазы нарастания в присутствии ДФК (~17%) меньше, чем в присутствии ТМФД (~30%) (Gopta et al. 2008). Однако, наличие быстрой компоненты спада, наблюдавшейся в отсутствие ДФК (1 5 мс, А1 ~6%) и сопоставимой по времени фазы нарастания при его добавлении, может приводить к занижению реальной амплитуды нарастания.

В отличие от ДФК, как было показано нами в работе (Gopta et al. 2008), дополнительная электрогенная фаза в присутствии редокс-медиаторов ТМФД и ДХФИФ становится хорошо заметной лишь при весьма высоких их концентрациях (1-8 мМ). При меньших концентрациях восстановление тирозина YZ не дает видимого вклада в кинетику генерации фотопотенциала, что объясняется низкой скоростью медленного нарастания, маскирующегося процессами разряда (данные не приведены).

Нами было также изучено влияние низкомолекулярного NH2OH на кинетику генерации в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn).

Рис. 6. Фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn) в отсутствие (1) и в присутствии 100 мкМ NH2OH. Условия как на рис. 1.

На рис. 6 в двух временных масштабах показано образование на протеолипосомах с ФС 2 (Mn) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая 2) 100 мкМ NH2OH в ответ на единичные вспышки света. Замедление кинетики спада в присутствии NH2OH [(1 25 мс (А1 5%), 2 720 мс (А2 95%)] по сравнению с контролем [(1 3.5 мс (А1 5%), 2 ~230 мс (А2 95%)] свидетельствует о предотвращении рекомбинации зарядов в РЦ ФС 2 за счет эффективного переноса электрона между NH2OH и РЦ ФС 2.

Для объяснения различного влияния ДФК и NH2OH на электрогенез в ФС 2 нами была рассмотрена структура белка на донорном участке. На основании данных рентгеноструктурного анализа кристаллов ФС 2 недавно было выявлено несколько каналов, ведущих от границы донорного участка белка к Mn4Ca кластеру (Guskov et al., 2009). Из них три канала имели минимальный ван-дер-ваальсовый диаметр ~2,7. Было предположено, что эти каналы служат для транспорта кислорода и молекул воды между каталитическим сайтом комплекса окисления воды и люменом.

При удалении Mn4Ca кластера также происходит удаление трх периферических субъединиц ФС 2. С целью выявления возможных гидрофильных каналов нами было проведено моделирование структуры ФС 2 в отсутствие периферических белков. Моделирование каналов проводилось с помощью программы Caver 2.0 v0.003 (Medek et al. 2007). Было показано, что минимальный диаметр канала 1 составляет ~3, а каналов 2 и 3 – ~2.

Очевидно, что размеры ДФК существенно превышают диаметр этих каналов, в то время как размеры молекулы NH2OH позволяют ему свободно диффундировать через обнаруженные каналы.

Рис. 7. Схема транспорта электрона на донорном участке ФС 2 (Mn) в присутствии ДФК и NH2OH. Сплошными стрелками показаны электрогенные стадии переноса электрона, пунктирная стрелка демонстрирует диффузию NH2OH через один из гидрофильных каналов от поверхности белка к сайту связывания Mn4Ca-кластера.

На Рис. 7 схематически представлена предполагаемая схема восстановления фотоокисленного под действием лазерной вспышки Y Z от ДФК и NH2OH.

Согласно схеме донирование электрона от ДФК к Y Z сопровождается образованием за счет векторного внутрибелкового переноса электрона от сайта связывания ДФК на границе белок-вода к погруженному вовнутрь пигмент-белкового комплекса YZ. В то же время NH2OH диффундирует через один из трех каналов диаметром ~2,0–3,0, обнаруженных в структуре кристалла ФС 2 и ведущих от границы белка к сайту связывания Mn4Ca кластера, а затем восстанавливает YZ.

Как видно из рис. 6, добавление NH2OH не приводит к появлению дополнительной фазы нарастания, однако небольшая компонента с характерным временем ~3,5 мс замедляется до 25 мс. Этот результат может объясняться как предотвращением рекомбинации зарядов между QA– и YZ в результате электронейтрального донирования электрона от NH2OH, так и появлением небольшой фазы нарастания, обусловленной электрогенным YZ донированием электрона от сайта связывания на и NH2OH компенсирующейся спадом в том же временном диапазоне. Последнее предположение может быть подкреплено тем, что, как отмечалось выше, добавление экзогенного Mn к аналогичным препаратам приводило к появлению близкой по амплитуде, но более быстрой электрогенной стадии. Сайт связывания NH2OH может быть близок к сайту связывания Mn, поскольку каналы сходятся вблизи Mn4Ca кластера.

Полученные результаты дают новую важную информацию о механизмах образования на донорном участке комплексов ФС 2. Они показывают, что эффективное восстановление окисленного YZ от искусственных доноров электронов в препаратах РЦ ФС 2, лишенных Mn4Ca кластера, может быть как электрогенным, так и неэлектрогенным. В первом случае более гидрофобные доноры (ДФК и ТМФД) восстанавливают YZ электрогенным образом за счет векторного переноса электрона от сайта связывания на границе белок-вода, а во втором случае более гидрофильные и низкомолекулярные доноры (NH2OH) могут диффундировать через каналы с минимальным диаметром 2,0–3,0, ведущие от люменальной поверхности белка к сайту связывания Mn4Ca кластера, а затем восстанавливать YZ. При этом перенос электрона от NH2OH к YZ либо может быть электронейтральным, либо вносить незначительный по сравнению с гидрофобными донорами вклад в наблюдаемый электрогенез.

–  –  –

В последние годы для реконструкции функции КВК очень широко применяются различные синтетические одно-, двухъ- и трехъядерные марганцевые комплексы. Однако вопрос о молекулярном механизме фотоактивации до сих пор остается открытым. Также остается не ясной природа взаимодействия между ФС 2 и различными синтетическими марганцевыми комплексами.

Рис. 8. Структуры синтетических трхъядерных марганцевых комплексов.

В этом разделе диссертационной работы исследовалось влияние двух синтетических трхъядерных Mn-содержащих комплексов на кинетику фотоэлектрических ответов протеолипосом, содержащих препараты ФС 2 (Mn). Эти комплексы представляют собой триподные органические молекулы, хелатирующие три атома марганца. Комплексы были синтезированы в лаборатории профессора Нагато (Оказаки, Япония) и получили обозначения 173-1 (комплекс-1) и 173-2 (комплекс-2).

На рис. 8 показаны структурные формулы этих веществ. С помощью ЯМР спектроскопии с использованием изотопа фосфора F было продемонстрировано, что при взаимодействии этих синтетических Mnкомплексов с мембранными фрагментами ФС 2 происходит распад триподных лигандов (Nagata et al., 2008).

На рис. 9 показан фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих препараты ФС 2 (Mn) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая 2) синтетического комплекса-1.

Рис. 9. Образование мембранного потенциала в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn) в отсутствие (1) и в присутствии 1 мкМ комплекса (2); на вставке показан результат вычитания кривой 1 из кривой 2. Среда инкубации как на рис. 1.

Видно, что в присутствии 1 мкМ марганцевого комплекса-1 в кинетике фотоэлектрического ответа помимо быстрой неразрешимой фазы, связанной с переносом электрона между YZ и QA, наблюдается появление дополнительной генерации мембранного потенциала и существенное замедление кинетики спада. Экспоненциальный анализ показывает, что кинетика дополнительной медленной электрогенной фазы описывается экспонентой с ~160 мс (~25% от амплитуды фазы, связанной с процессом рекомбинации зарядов между Y Z и QA–). Однако, при вычитании кривой 1 из кривой 2 на субмиллисекундных временах выявляется также фаза с ~50 мкс (~4% от амплитуды YZ•QA).

Сходство кинетик и амплитуд быстрых электрогенных фаз в присутствии MnCl2 (рис. 2, вставка) и синтетического комплекса-1 (рис. 9, вставка) позволяют предположить, что эти фазы обусловлены восстановлением YZ тирозина путем переноса электрона от Mn, находящегося в высокоаффинном сайте. В случае комплекса-1 связывание марганца с этим сайтом в ФС 2 происходит после высвобождения триподных лигандов. Более медленная электрогенная фаза ( ~160 мс), вероятно, отражает перенос электрона от синтетического комплекса-1, ассоциированного с границей белоквода, к окисленному марганцу в Mn-связывающем сайте. Замедление спада фотоэлектрического ответа объясняется тем, что в образцах комплексов ФС 2 (Mn) происходит предотвращение окисления QA тирозином вследствие быстрого восстановления YZ путем переноса электрона от марганца. В кинетике спада были выявлены две компоненты: 1 ~1,4 с (90%) и долгоживущая компонента (10%), отражающие пассивный разряд через протеолипосомальную мембрану.

Следует отметить, что суммарная амплитуда дополнительных электрогенных фаз, наблюдаемых в присутствии синтетического комплекса-1 составляет ~30% от общего фотоэлектрического ответа, что близко к амплитуде электрогенной фазы, обусловленной переносом электрона от восстановленного ТМФД на YZ.

Более медленная кинетика электрогенной фазы ( ~160 мс), наблюдаемая в случае синтетического комплекса-1, вероятно, обусловлена структурными особенностями этого соединения и наличием в нм общего положительного заряда, что может препятствовать образованию оптимального для переноса электрона комплекса с белком.

Рис. 10. Взаимодействие трхъядерного синтетического марганцевого комплекса-1 с ФС 2 (Mn).

На рис. 10 показано взаимодействие триподного комплекса-1 с ядерным комплексом ФС 2, лишнным марганца. Стрелками показан перенос электрона между функциональными кофакторами ФС 2, а также перенос электрона от связанного с поверхностью комплекса-1 к окисленному марганцу в высокоаффинном сайте.

Нами также было изучено влияние синтетического комплекса-2 на кинетику генерации. Добавление этого комплекса приводило к замедлению кинетики спада фотоответа, свидетельствующему о переносе электрона к Y Z, но дополнительного нарастания при этом не наблюдалось. Отсутствие дополнительной электрогенной фазы в кинетике фотоэлектрического ответа может быть связано с тем, что после распада триподных лигадов, марганец встраивается в низкоаффинный сайт и электронейтрально восстанавливает Y Z.

Эти данные важны для понимания молекулярного механизма электрогенеза на донорном участке комплекса ФС 2, а также дают новый взгляд на структуру и функции Mn (и/или YZ) в препаратах ФС 2, лишнных марганца.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью диссертационной работы явилось изучение механизмов переноса электрона на донорном участке ФС 2 с помощью методов регистрации переменной флуоресценции, кинетики индукции флуоресценции и трансмембранной разности электрических потенциалов (). Использованный прямой электрометрический метод позволяет проводить измерения кинетики генерации фотопотенциала с разрешением 100 нс в режиме однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений.

Работа была проведена на изолированных ядерных комплексах ФС 2 из шпината, выделенных в присутствии глицинбетаина и содержащих весь набор функциональных кофакторов, включая вторичный хинонный акцептор Q B. Эти образцы представляют собой минимальную функциональную единицу, способную катализировать окисление воды. Локализация комплекса окисления воды вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны позволяет изучать взаимодействие между экзогенными донорами электронов и РЦ ФС 2.

В первом разделе экспериментальной части работы представлены результаты исследования переноса электрона на донорном участке ФС 2 с активным комплексом окисления воды и ФС 2, лишенной марганцевого кластера. Была показана возможность реконструкции электрогенной реакции транспорта электрона между марганцем и редокс-активным тирозином YZ в образцах ФС 2 (Mn).

Во втором разделе экспериментальной части были исследованы препараты ФС 2 с блокированным высокоаффинным Mn-связывающим сайтом (Mn+Fe).

Были выявлены два сайта окисления Mn. Отсутствие дополнительного электрогенеза в кинетике генерации в препаратах ФС 2 (Mn+Fe) указывает на электронейтральную природу реакции переноса электрона от Mn, связанного в низкоаффинном сайте, к YZ в D1-субъединице.

Дальнейшие два раздела работы были посвящены исследованию влияния различных экзогенных доноров электронов, таких как дифенилкарбазид и гидроксиламин, а также двух синтетических трехъядерных марганцевых комплексов (173-1 и 173-2) на кинетику генерации фотопотенциала в препаратах ФС 2 (Mn). Было продемонстрировано наличие дополнительной генерации мембранного потенциала в присутствии ДФК и комплекса 173-1, обусловленной векторным переносом электрона внутри комплекса РЦ.

Электронейтральная или небольшая по амплитуде (~5% от быстрой фазы) электрогенная реакция переноса электрона между NH2OH и РЦ ФС 2, вероятно, обусловлена восстановлением YZ• от NH2OH, диффундировавшего через каналы большого диаметра на донорном участке ФС 2 к сайту связывания Mn4Ca кластера.

Полученные данные важны для понимания молекулярных механизмов электрогенеза, связанного с переносом зарядов на донорном участке ФС 2.

ВЫВОДЫ

1) Методами регистрации флуоресценции продемонстрирована возможность реконструкции переноса электрона на донорном участке ядерных комплексов ФС 2 из шпината, лишнных Mn4Ca кластера [ФС 2 (Mn)]. На протеолипосомах, содержащих ФС 2 (Mn), с помощью прямого электрометрического метода показана дополнительная генерация мембранного потенциала (), обусловленная переносом электрона от марганца к редоксактивному аминокислотному остатку тирозину YZ в ответ на вспышки лазера.

Сходство относительной амплитуды этой электрогенной фазы (5% от YZQA–, 50 мкс) с величиной электрогенеза, обусловленного восстановлением Y Z марганцевым кластером в препаратах ФС 2 с активным комплексом окисления воды, позволило заключить, что диэлектрическая проницаемость на участке между сайтом связывания Mn и YZ в препаратах ФС 2 (Mn) остается такой же, как и в нативных ядерных комплексах.

2) С помощью регистрации переменной флуоресценции на ядерных комплексах ФС 2 продемонстрировано наличие двух сайтов окисления экзогенного марганца. С помощью прямого электрометрического метода показано, что в отличие от электрогенной реакции переноса электрона от марганца к тирозину YZ• через высокоаффинный сайт, реакция переноса электрона от марганца к YZ• через низкоаффинный сайт не сопряжена с генерацией. Одной из возможных причин может быть различное расположение сайтов окисления марганца относительно YZ.

–  –  –

4) Замедление спада фотоэлектрического ответа в присутствии гидроксиламина (NH2OH) по сравнению с контролем свидетельствует об эффективном переносе электрона между NH2OH и реакционным центром ФС 2.

При этом перенос электрона от NH2OH к тирозину YZ• либо может быть электронейтральным, либо вносить незначительный по сравнению с гидрофобными донорами (ДФК, ТМФД) вклад в наблюдаемый электрогенез.

Предложена гипотеза, в соответствии с которой NH2OH способен диффундировать через один из каналов диаметром 2,0–3,0, видимых в структуре ФС 2 и ведущих от границы белка к сайту связывания Mn4Ca, c последующим донированием электрона на YZ•.

5) В присутствии синтетического трехъядерного марганцевого комплекса-1 выявлена дополнительная генерация, обусловленная переносом электрона на донорном участке ФС 2 (Mn). Наблюдаемая двухфазная кинетика нарастания обусловлена: 1) восстановлением тирозина Y Z• от Mn (А1 ~5% от YZ•QA, 1 50 мкс), встраивающегося в высокоаффинный Mn-связывающий сайт после освобождения от триподных лигандов, и 2) векторным переносом электрона от марганцевого комплекса на поверхности белка к окисленному атому марганца в Mn-связывающем сайте (А2 25%, 2 160 мс).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gopta O.A., Tyunyatkina A.A., Kurashov V.N., Semenov A.Y., Mamedov M.D.

Effect of redox mediators on the flash-induced membrane potential generation in Mn-depleted photosystem II core particles. // European Biophysics Journal, 2008, v. 37, p. 1045-1050.

2. Kurashov V.N., Allakhverdiev S.I., Zharmukhamedov S.K., Nagata T., Klimov V.V., Semenov A.Y., Mamedov M.D. Electrogenic reactions on the donor side of Mn-depleted photosystem II core particles in the presence of MnCl2 and synthetic trinuclear Mn-complexes. // Photochemical and Photobiological Sciences, 2009, v. 8, p. 162-166.

3. Kurashov V.N., Lovyagina E.R., Shkolnikov D.Y., Solntsev M.K., Mamedov M.D., Semin B.K Investigation of the low-affinity oxidation site for exogenous electron donors in the Mn-depleted photosystem II complexes. // Biochimica et Biophysica Acta, 2009, v. 1787, p. 1492-1498.

4. Мамедов М.Д., Курашов В.Н., Петрова И.О., Заспа А.А., Семенов А.Ю.

Перенос электрона между экзогенными донорами электронов и реакционным центром фотосистемы 2 // Биохимия, 2010, т. 75, вып. 5, с. 675Tyunyatkina A.A., Kurashov V.N., Gopta O.A., Semenov A.Yu., Mamedov M.D.

Electrogenic reduction of tyrosine YZox by exogenous reductants in photosystem II // Abstracts of the International meeting: Photosynthesis in the post-genomic era:

Structure and Function of Photosystems, Puschino (Russia) 2006, p. 185.

6. Gopta O.A., Kurashov V.N., Tyunyatkina A.A., Semenov A.Yu., Mamedov M.D.

Effect of redox mediators on the flash-induced membrane potential generation in Mn-depleted photosystem II core particles. // Abstracts of the 16th annual photosynthesis workshop Nord-West, Mlheim an der Ruhr (Germany) 2007, p.

39.

7. Kurashov V.N., Zharmukhamedov S.K., Semenov A.Yu., Mamedov M.D.

Photovoltage measurements of manganese-depleted/reconstituted photosystem II core complexes incorporated into lipid vesicles // Abstracts of the International conference “Light energy conversion in photosynthesis”, Puschino (Russia) 2008, p. 58.

8. Курашов В.Н., Петрова И.О., Заспа А.А., Семнов А.Ю. Мамедов М.Д.

Перенос электронов на донорном участке в ядерных комплексах фотосистемы 2, лишнных марганца // Сборник тезисов XIX Пущинских чтений по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах», посвященные 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева, Пущино 2009, с. 36.



Похожие работы:

«Эколого-генетические модели Лекция 3. Раздел посвящен изучению генетического контроля синэкологических отношений. Метаболическая интеграция партнеров модель дрожжи – дрозофила. Насекомые, как и все членистоногие, не способны синтезировать стери...»

«Японские исследования. 2016. №1 www.ifes-ras.ru/js Экологические проблемы в Японии: между прошлым и будущим И.С. Тихоцкая После краткого исторического экскурса в статье анализируются особенности подхода Японии к решению экологических проблем и распространению экологических знаний,...»

«В. А. МУХИН БИОТА КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ ЗАПАДНО-СИБИРСКОЙ РАВНИНЫ РОССИйСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ РАСТЕНИй И ЖИВОТНЫХ В. А. МУХИН БИОТ А КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦ...»

«3. Боязитова, А.Н. Медикализация как социальный процесс // Автореферат диссертации на соискание уч. степени кандидата медицинских наук (по специальности 14.00.52 – социология медицины). – Волгоград, 2007. – [Электронный ресурс]. – Режим...»

«Печникова Евгения Викторовна СТРУКТУРА ВИРУСА ШТРИХОВАТОЙ МОЗАИКИ ЯЧМЕНЯ И ГИГАНТСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ EL и Lin68 ПО ДАННЫМ КРИОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ 03.01.03-молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата...»

«Педагогико-психологические и медико-биологические проблемы физической культуры и спорта, №4(29) 2013 ISSN 2070 47 УДК 796:61 ОСОБЕННОСТИ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ СЕРДЕЧНОГО РИТМА У КВАЛИФИЦИРОВАННЫХ БАДМИНТОНИСТОВ В ПОКОЕ Чан Дык Ньан – аспирант Г.Д. Алексанянц – профессор, доктор медицинских наук, зав. кафедрой...»

«Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского Серия: География. Том 22 (61). 2009 г. № 2. С.154-159. УДК 504.4.054 ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОБСТАНОВКИ РАЙОНА ДУНАЙСКОГО ВЗМОРЬЯ Турега О.Н. Керченский экономико-гуманитарный институт Таври...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.