WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«Флуоресцирующая модель HER2-гиперэкспрессирующей опухоли яичника человека и ее использование для оценки эффективности таргетного иммунотоксина на основе ...»

На правах рукописи

Соколова Евгения Александровна

Флуоресцирующая модель HER2-гиперэкспрессирующей опухоли

яичника человека и ее использование для оценки эффективности

таргетного иммунотоксина на основе экзотоксина А

03.01.02 — биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2016

Работа выполнена на кафедре биофизики Института биологии и биомедицины

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный

университет им. Н.И. Лобачевского» и на базе лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители:

Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (основное место работы), профессор кафедры биофизики ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И.

Лобачевского»

Балалаева Ирина Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биофизики Института биологии и биомедицины ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»

Официальные оппоненты:



Кочетков Сергей Николаевич, доктор химических наук, член-корр. РАН, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ действия физиологически активных соединений ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН;

Дзантиев Борис Борисович, доктор химических наук, профессор, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха ФГУ «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН».

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится ……..…………. года в ………. часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 биологического факультета ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.

Ломоносова» по адресу:

119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 24, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте http://istina.msu.ru/media/dissertations/dissertation/76c/a14/30280012/Sokolova_disser.pdf Автореферат разослан « » 2016 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Таргетная терапия – современный быстро развивающийся тип персонализированного лечения злокачественных новообразований, предполагающий селективное воздействие на опухоль благодаря нацеленной доставке терапевтических агентов к опухолевым клеткам. Это становится возможным при использовании агентов, сочетающих свойства специфического узнавания опухолевой клетки и токсического действия на нее.

Развитие таргетной терапии тесно связано с прогрессом в изучении молекулярных основ канцерогенеза и идентификацией так называемых мишеней (AlLazikani B.





, 2012). Наиболее часто мишенями таргетных агентов служат молекулы на поверхности клетки, уровень экспрессии которых в опухолевых клетках значительно выше, чем в нормальных тканях. В настоящее время широко используемой мишенью для таргетной терапии некоторых типов слидных опухолей является онкомаркер HER2 – трансмембранная рецепторная тирозинкиназа, гиперэкспрессия которой связана с быстрым прогрессированием и повышенным метастатическим потенциалом опухоли (Harari D., 2000; Yarden Y., 2001; Polanovski O.L., 2012).

Перспективными агентами для таргетной противоопухолевой терапии являются иммунотоксины, объединяющие в своем составе структурно и функционально независимые направляющий и токсический модули (Kreitman R.J., 2006; Choudhary S., 2011). Активная разработка и тестирование HER2-специфичных иммунотоксинов требует создания адекватных экспериментальных моделей опухолей, гиперэкспрессирующих рецептор HER2.

Важным критерием при оценке противоопухолевой эффективности потенциальных препаратов является выбор метода мониторинга экспериментальных опухолей в организме животного. Технология использования флуоресцентных белков как генетически кодируемых маркеров опухолевых клеток обусловила развитие и широкое распространение оптического флуоресцентного имиджинга в экспериментальной онкологии (Yang M., 2007; Hoffman R., 2016). Признанными достоинствами этого метода являются высокая чувствительность и относительно низкая стоимость оборудования в сочетании с достаточным для терапевтического мониторинга разрешением. Для прижизненного флуоресцентного имиджинга экспериментальных опухолей наибольший интерес представляют красные и дальнекрасные флуоресцентные белки, спектры излучения которых попадают в «терапевтическое окно прозрачности» биоткани (Massoud T.F., 2003; Hoffman R., 2008; Shcherbo D., 2007).

В связи с этим, получение флуоресцирующих моделей опухолей с гиперэкспрессией рецептора HER2 и их использование для изучения противоопухолевого эффекта разрабатываемых таргетных агентов является актуальной задачей в области биомедицины.

Цели и задачи работы. Цель работы заключалась в получении флуоресцирующей модели HER2-гиперэкспрессирующей опухоли яичника человека и ее использовании для изучения эффективности созданного HER2-специфичного иммунотоксина.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить модель HER2-гиперэкспрессирующей опухоли яичника человека с флуоресценцией в красной области спектра;

2. Апробировать полученную флуоресцирующую модель для оценки противоопухолевой эффективности препаратов;

3. Создать иммунотоксин на основе псевдомонадного экзотоксина A и HER2специфичного антитела формата scFv;

4. Изучить механизмы цитотоксического действия иммунотоксина.

Научная новизна. Впервые создана ксенографтная модель аденокарциномы яичника человека, характеризующаяся гиперэкспрессией рецептора HER2 и стабильной экспрессией дальнекрасного флуоресцентного белка Katushka, спектр эмиссии которого лежит в области терапевтического окна прозрачности биологических тканей. Показана высокая информативность созданной модели для прижизненной визуализации опухоли в организме животного неинвазивным методом флуоресцентного имиджинга и продемонстрированы возможности ее использования для высокоэффективной оценки действия противоопухолевых агентов.

Впервые получен рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40, содержащий в составе анти-HER2 антитело 4D5scFv и фрагмент псевдомонадного экзотоксина А. С использованием созданной флуоресцирующей опухолевой модели показан выраженный противоопухолевый эффект иммунотоксина 4D5scFv-PE40 in vivo.

Установлен механизм избирательного цитотоксического действия 4D5scFv-PE40:

показано аффинное и высокоизбирательное связывание иммунотоксина с рецептором HER2 на поверхности опухолевых клеток, клатрин-опосредованная интернализация и распределение в компартментах клетки, характерное для молекулы псевдомонадного экзотоксина А дикого типа, ингибирование биосинтеза белка и последующая гибель клеток по пути апоптоза.

Научно-практическая значимость. Созданная и апробированная ксенографтная флуоресцирующая модель HER2-гиперэкспрессирующей опухоли яичника человека может быть широко использована для оценки противоопухолевого потенциала соединений различного механизма действия, в том числе таргетных HER2-специфичных агентов, а также для исследований процессов развития опухоли в организме с помощью неинвазивного высокоинформативного флуоресцентного имиджинга. Полученный и исследованный рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFvPE40 представляет интерес в качестве потенциального агента для таргетной терапии HER2-гиперэкспрессирующих опухолей и в перспективе может быть включен в схемы терапии этой группы новообразований. Основные выводы и результаты работы будут использованы в учебном процессе при разработке соответствующих спецкурсов для студентов биологических и медицинских факультетов вузов.

Личный вклад автора. Автор лично участвовал в проведении всех экспериментальных исследований, обработке полученных и изложенных в диссертации результатов, их анализе и обсуждении, а также совместно с соавторами участвовал в написании научных статей и апробации результатов исследования на семинарах, конференциях и симпозиумах.

На начальных этапах получения линии клеток SKOV-kat большой вклад внесли сотрудники лаборатории молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ИБХ) РАН.

Плазмида pSD-4D5scFv-PE40, содержащая ген иммунотоксина 4D5scFv-PE40, предоставлена лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ РАН. Анализ аффинности полученного рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 проведен сотрудниками данной лаборатории.

Морфологический анализ образцов опухолевой ткани проведен в Отделе морфологии Центральной научно-исследовательской лаборатории Нижегородской государственной медицинской академии. Иммуногистохимический анализ экспрессии рецептора HER2 в опухолевой ткани проведен в Нижегородской областной клинической больнице им. Н.А. Семашко.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих международных и всероссийских конференциях: международной школеконференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2011, 2015);

XII международной школе для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting — SFM» (Саратов, 2011); 14 конгрессе Европейского общества фотобиологов «14th Congress of European society for photobiology» (Женева, 2011); международном симпозиуме «Topical problems of biophotonics» (С. Петербург — Н. Новгород, 2011); VI Съезде Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011); школе по фотобиологии Европейского общества фотобиологов ESP Photobiology School (Бриксен, Италия, 2012); IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); V Всероссийском с международным участием медико-биологическом Конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012»

(Тверь, 2012); международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию ИБХ РАН и 80-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2014); VII Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Новосибирск, 2015); 69-й Всероссийской школеконференции молодых ученых «Биосистемы: организация, поведение, управление»

(Нижний Новгород, 2016).

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 7 статей в реферируемых журналах, входящих в перечень ВАК, 1 патент на изобретение и 13 тезисов в сборниках всероссийских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 33 рисунка и 6 таблиц. Список литературы содержит 219 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 представлен обзор литературы, посвященный следующим основным темам: свойствам флуоресцентных белков и анализу их использования в экспериментальной онкологии для создания флуоресцирующих опухолевых моделей;

рецептору HER2 как молекулярной мишени для таргетной противоопухолевой терапии; иммунотоксинам как агентам для таргетной противоопухолевой терапии.

В главе 2 перечислены использованные в работе реактивы и оборудование, приведены составы сред и растворов, описаны методики исследований.

Получение линии опухолевых клеток SKOV-kat с экспрессией дальнекрасного флуоресцентного белка и ксенографтной опухоли на ее основе Для получения линии SKOV-kat клетки аденокарциномы яичника человека SKOV-3 трансфицировали плазмидой pTurboFP635-N (Евроген, Россия), содержащей ген дальнекрасного флуоресцентного белка TurboFP635 (Katushka), методом липофекции. Селекцию трансфектантов проводили на ростовой среде, содержащей генетицин. Для сортировки стабильно трансфицированных клеток использовали оптический проточный цитофлуориметр-сортер FACSAria III (BD, США). Оценку уровня экспрессии рецептора HER2 клетками проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием цитофлуориметра FACSCalibur (BD, США) после окрашивания суспензии клеток HER2-специфичными моноклональными антителами, конъюгированными с флуоресцеина изотиоцианатом (FITC).

Для получения флуоресцирующей ксенографтной опухолевой модели клетки SKOV-kat прививали подкожно иммунодефицитным мышам-самкам линии BALB/cNude в количестве 2 млн на животное с использованием ростового субстрата Matrigel (BD, США). Для верификации опухоли проводили морфологический анализ образцов опухолевой ткани. Экспрессию белка Katushka клетками SKOV-kat как в культуре, так и в опухолевой ткани ex vivo визуализировали методом конфокальной микроскопии с использованием лазерного сканирующего микроскопа Axiovert 200М LSM 510 META (Carl Zeiss, Германия). Гиперэкспрессию HER2 в опухолевой ткани SKOV-kat подтверждали ex vivo методом иммуногистохимического анализа с использованием набора HercepTest (Dako, США).

Мониторинг роста опухолей. Флуоресцентный имиджинг Мониторинг роста опухолей проводили двумя методами: методом поверхностного флуоресцентного имиджинга и стандартной методикой оценки размеров опухоли с помощью штангенциркуля. Для флуоресцентного имиджинга использовали установку, в которой в качестве источника излучения используется светодиод с максимумом испускания при 585 нм, а сигнал регистрируется с помощью охлаждаемой цифровой ПЗС-камеры (ПЗС – прибор с обратной зарядовой связью) (Институт прикладной физики РАН). Для разделения возбуждающего света и эмиссии использовали полосовой фильтр 628–672 нм. Полученные изображения анализировали в программе ImageJ (National Institute of Health, США). Для построения кривых опухолевого роста использовали рассчитанные значения объема опухоли и интегральной интенсивности флуоресценции по площади опухоли за вычетом фона.

Получение рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 Продуцентов рекомбинантного белка 4D5scFv-PE40 получали в результате трансформации клеток E. coli штамма BL21(DE3) плазмидой, содержащей ген 4D5scFv-PE40 под контролем lac промотора. В качестве индуктора экспрессии гена 4D5scFv-PE40 использовали изопропил--D-1-тиогалактопиранозид. Предварительно были подобраны условия наработки 4D5scFv-PE40 продуцентами, обеспечивающие получение достаточного количества целевого белка в растворимой форме. Очистку целевого белка из лизата продуцентов проводили последовательно в две стадии методами металл-хелатной аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Анализ белков во фракциях проводили методами электрофореза в полиакриламидном геле и вестерн-блота.

Оценка противоопухолевой эффективности терапевтических агентов Животных разделяли на четыре группы (n=5), в соответствии с вариантом терапевтического воздействия. Животным первой группы (контрольной) внутрибрюшинно (в/б) вводили 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) через 24 ч после инъекции опухолевых клеток. Животным второй группы в/б вводили иммунотоксин 4D5scFv-PE40 в дозе 50 пмоль в 100 мкл PBS через 24 ч после инъекции опухолевых клеток. Третьей группе животных в/б вводили цисплатин в разовой дозе 200 мкмоль в 100 мкл PBS троекратно на 3, 5 и 7 дни после инъекции опухолевых клеток. Животным четвертой группы вводили 4D5scFv-PE40 и цисплатин по указанным выше схемам. По данным флуоресцентного имиджинга рассчитывали коэффициенты скорости опухолевого роста. Для количественной оценки противоопухолевого эффекта рассчитывали также коэффициенты торможения роста опухоли (ТРО) (Хабриев, 2005) по формуле: ТРО (%) = (Iк - Io) / Iк 100%, где Iк и Iо – усредненные значения интегральной флуоресценции по площади опухоли в контрольной и опытной группах, соответственно, в выбранной временной точке.

Исследование механизмов действия иммунотоксина 4D5scFv-PE40 Цитотоксичность 4D5scFv-PE40 была определена методом МТТ-теста для нескольких линий клеток с различным уровнем экспрессии рецептора HER2: HER2отрицательных клеток яичника китайского хомячка CHO, клеток аденокарциномы шейки матки человека HeLa с низким уровнем экспрессии, клеток аденокарциномы яичника человека SKOV-3 и их флуоресцирующих производных SKOV-kat с высоким уровнем экспрессии (гиперэкспрессией). Уровень экспрессии HER2 был предварительно подтвержден методом проточной цитофлуориметрии.

Для оценки аффинности взаимодействия иммунотоксина 4D5scFv-PE40 с рецептором HER2 определяли равновесную константу диссоциации их комплекса методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием оптического биосенсора BIAcore 3000 (GE Healthcare, США). Специфичность связывания 4D5scFv-PE40 с рецептором HER2 на поверхности клеток исследовали методами конфокальной микроскопии и проточной цитофлуориметрии.

Для установления механизма интернализации 4D5scFv-PE40 использовали ингибиторный анализ путей эндоцитоза с применением хлорпромазина и филипина (5 мкг/мл) в качестве блокаторов клатринового и кавеолинового эндоцитоза, соответственно. Для исследования внутриклеточной локализации клетки инкубировали с иммунотоксином, меченным DyLight650, с последующей окраской органелл специфичными флуоресцентными красителями. Оценку интенсивности биосинтеза белка проводили после инкубации клеток в присутствии иммунотоксина с помощью коммерческого набора для флуоресцентного мечения синтезируемых в клетке белков Click-iT AHA (Thermo Fisher Scientific, США).

Для установления механизма гибели клеток SKOV-3 под действием иммунотоксина исследовали экстернализацию фосфатидилсерина методом проточной цитофлуориметрии с использованием коммерческого набора FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD, США).

Глава 3 содержит изложение и обсуждение результатов исследования.

Получение линии опухолевых клеток, экспрессирующих дальнекрасный флуоресцентный белок, и ксенографтной опухолевой модели на ее основе Нами была получена клеточная линия SKOV-kat, представляющая собой производную линии HER2-гиперэкспрессирующей аденокарциномы яичника человека SKOV-3, клетки которой были стабильно трансфицированы геном флуоресцентного белка Katushka с цитоплазматической локализацией (рис. 1А, Б).

Белок Katushka (TurboFP635) был выбран нами как оптимальный по сочетанию флуоресценции в области «терапевтического окна прозрачности» биоткани (em 635 нм) и высоких значений молярного коэффициента экстинкции (65000 М-1см-1) и квантового выхода флуоресценции (0,34), что в совокупности обеспечивает его эффективную визуализацию в организме модельного животного (Shcherbo, 2007). Для клеток полученной линии SKOV-kat было показано сохранение высокого уровня экспрессии рецептора HER2, свойственного клеткам родительской линии SKOV-3 (рис. 1В). Стабильность трансфекции была подтверждена культивированием SKOVkat в течение 5 лет с многократной заморозкой и разморозкой клеток.

Подкожная инъекция полученных клеток иммунодефицитным животным приводила к формированию опухолевого узла в месте введения. Анализ ex vivo образцов опухоли показал сохранение гиперэкспрессии рецептора HER2 (рис. 2А) и экспрессии белка Katushka (рис. 2Б) в опухолевой ткани. Изображение мышечной ткани, полученное при аналогичных настройках (рис. 2Б), свидетельствует о практическом отсутствии автофлуоресценции в данном диапазоне длин волн, что обеспечивает большой контраст при визуализации целевого флуорофора.

–  –  –

Рис. 2. Ксенографтная опухолевая модель SKOV-kat. А – иммуногистохимический препарат опухоли: интенсивная коричневая окраска свидетельствует о высокой экспрессии рецептора HER2; Б – опухолевая и мышечная ткани: комбинированные изображения в проходящем свете и в красном канале (ex 543 нм, em 560–700 нм).

Мониторинг развития флуоресцирующих опухолей и их ответа на терапевтическое воздействие Стабильная экспрессия флуоресцентного белка клетками SKOV-kat обеспечила возможность визуализации экспериментальных опухолей методом оптического имиджинга с момента инъекции клеток и в дальнейшем в течение всего времени развития опухоли. В ходе мониторинга роста опухолей получали двумерные изображения животных-опухоленосителей методом поверхностного флуоресцентного имиджинга на уровне целого организма (рис. 3). Нами показано высокое соответствие показателя интегральной интенсивности флуоресценции опухоли ее объему, рассчитанному на основе внешних размеров узла (коэффициент корреляции Пирсона составил 0,95 при p0,0001) (рис. 4).

Рис. 3. Прижизненное изображение Рис. 4. Корреляция интегральной животного. Область флуоресцирующей интенсивности флуоресцентного сигнала по опухоли наложена в радужной палитре площади опухоли и объема опухоли, интенсивности флуоресцентного сигнала рассчитанного на основе внешних размеров на изображение в отраженном свете опухолевого узла (rp – коэффициент (ex 585 нм, em 628–672 нм). корреляции Пирсона).

Таким образом, флуоресцентный имиджинг представляет адекватную альтернативу стандартной методике оценки внешних размеров опухоли. При этом флуоресцентный имиджинг характеризуется большей информативностью, по сравнению со стандартной методикой. Поскольку клетки SKOV-kat стабильно экспрессируют флуоресцентный белок, а автофлуоресценция в используемом оптическом диапазоне очень низка, интенсивность флуоресценции опухоли отражает количество опухолевых клеток в узле. Нами подтверждена бльшая специфичность флуоресцентного имиджинга в отношении визуализации опухолевых клеток (рис.

5А): использование ростового субстрата приводит к формированию «узла» в месте инъекции, сохраняющегося в течение нескольких дней, что приводит к завышенной оценке размера опухоли, однако, флуоресцентный сигнал от опухолевых клеток усиливается только на значительно более позднем изображении. Аналогично, на более поздних этапах роста опухоли в ее состав может входить, помимо самих опухолевых клеток, соединительнотканная строма, что также сказывается на внешнем размере узла, но не может быть учтено с помощью стандартной методики.

Флуоресцентный имиждинг является и более чувствительным, позволяя визуализировать непальпируемую опухоль (рис. 5Б). Подобным образом с помощью данного метода возможна визуализация поверхностных метастазов, представляющих собой частный случай непальпируемой опухоли. Показанные преимущества флуоресцентного подхода позволяют более корректно оценивать динамику роста опухоли, что особенно важно при исследовании противоопухолевого эффекта потенциальных терапевтических агентов. Стоит также подчеркнуть, что использование данного подхода исключает необходимость регулярного забоя животных для морфологической верификации опухоли, что значительно оптимизирует эксперимент как с финансовой, так и с этической точки зрения.

–  –  –

Нами была проведена апробация полученной флуоресцирующей опухолевой модели для мониторинга роста опухоли на фоне терапевтического воздействия. На последовательных изображениях животного контрольной группы и животного после введения химиопрепарата цисплатина (рис. 6А) хорошо видно увеличение флуоресцентного сигнала опухолей с течением времени: цисплатин вызывал значительное замедление роста опухоли по сравнению с контролем. При этом флуоресцентный имиджинг позволил выявить достоверный эффект цисплатина уже на 17-й день после инъекции опухолевых клеток (рис. 6А), в то время как статистически значимая разница в объеме опухолей опытной и контрольной групп была обнаружена только на 74-й день (рис. 6Б). Таким образом, флуоресцентный имиджинг полученной опухолевой модели обеспечивает количественную оценку роста опухоли и эффективную визуализацию терапевтического эффекта тестируемого агента на ранних стадиях развития опухоли.

Рис. 6. Динамика роста ксенографтных опухолей SKOV-kat на основе интегральной флуоресценции по площади опухоли (А) и внешнего объема опухоли (Б). Планки погрешностей представлены стандартной ошибкой среднего; * – p0,05, сравнение с контролем по критерию Даннета, n=4–5.

Рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40 и оценка его эффективности на полученной флуоресцирующей опухолевой модели Иммунотоксин 4D5scFv-PE40, созданный нами в ходе работы, представляет собой рекомбинантный (слитый) белок, состоящий из двух функциональных модулей

– направляющего и токсического (рис. 7).

Направляющим модулем иммунотоксина является антитело 4D5scFv (Eigenbrot, 1993), состоящее из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей HER2специфичного полноразмерного предшественника huMab4D5-8 (Carter, 1992), применяющегося в клинике для таргетной терапии некоторых типов HER2гиперэкспрессирующих карцином под коммерческим названием Herceptin. В качестве токсического модуля 4D5scFv-PE40 нами использован 40 кДа фрагмент экзотоксина А бактерии Pseudomоnas aeruginosa (PE), лишенный собственного рецепторузнающего домена (PE40). Токсический эффект PE40 обусловлен ингибированием биосинтеза белка в клетке за счет АДФ-рибозилирования эукариотического фактора элонгации трансляции 2 (eEF2). В фрагменте PE40 C-концевая последовательность REDLK была заменена на последовательность KDEL для повышения эффективности внутриклеточного транспорта PE40 (Chaudhary, 1990; Seetharam, 1991). Модули в составе иммунотоксина соединены гибким гидрофильным hinge-подобным линкером (Deyev, 2003).

Рис. 7. Cхема генетической конструкции, кодирующей 4D5scFv-PE40.

Показаны участки, кодирующие: OmpA – сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию целевого рекомбинантного белка в периплазматическое пространство; His6 – олигогистидиновый пептид, обеспечивающий очистку белка методом металл-хелатной аффинной хроматографии; 4D5 VL, 4D5 VH и L – вариабельные домены легкой и тяжелой цепей анти-HER2 антитела huMab4D5-8 и соединяющий их линкер (21 а.о.), соответственно;

H – гидрофильный hinge-подобный линкер (16 a.o.); II, Ib и III – домены фрагмента PE40 экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa; K – олигопептид KDEL.

В ходе флуоресцентного имиджинга с использованием полученной флуоресцирующей модели HER2-гиперэкспрессирующей опухоли нами был выявлен выраженный противоопухолевый эффект созданного иммунотоксина, сравнимый с эффектом цисплатина (рис. 8А). Для количественной оценки эффекта начальную стадию кривой опухолевого роста описывали уравнением F = F0 ekt, где F0 – значение интегральной флуоресценции опухоли в начальный момент времени, k – коэффициент скорости роста опухоли. Значения k определяли путем линеаризации экспоненциальной фазы роста опухоли (логарифмирования значений интегральной флуоресценции опухоли) с последующей линейной аппроксимацией. Показано статистически достоверное снижение коэффициента скорости роста опухоли в опытных группах, по сравнению с контрольной (рис. 8Б, В). Также были рассчитаны коэффициенты ТРО. Показано, что однократная инъекция иммунотоксина вызвала торможение опухолевого роста на 85% по сравнению с контролем на 17 день после инъекции опухолевых клеток. При совместном введении иммунотоксина и цисплатина в исследуемых дозах статистически значимого усиления эффекта выявлено не было.

Исследование механизма действия иммунотоксина 4D5scFv-PE40 Исследование цитоитоксичности Анализ цитотоксического действия иммунотоксина на культурах клеток показал ярко выраженную корреляцию токсического эффекта с уровнем экспрессии рецептора HER2 со значениями IC50 (значение концентрации исследуемого вещества, при которой жизнеспособность клеток снижается в два раза относительно контроля) в отношении HER2-положительных клеток в пикомолярных, а в отношении HER2отрицательных клеток (CHO) – в наномолярных концентрациях (рис. 9А, табл. 1).

Также исследовали цитотоксичность непосредственно токсического модуля иммунотоксина, PE40: значения IC50 PE40 превышали на один или несколько порядков (для разных клеточных линий) значения IC50 иммунотоксина (рис. 9Б, табл.

1). Для количественной оценки специфичности цитотоксического действия иммунотоксина, обусловленной наличием в его составе направляющего модуля, был рассчитан так называемый «индекс нацеливания» (табл. 1).

Рис. 8. Анализ роста опухолей в различных группах животных.

А – кривые роста опухоли; *, #, & – статистически значимое различие между контрольной и опытной группами: цисплатин, иммунотоксин или их сочетание, соответственно (p0,05, критерий Даннета, n=4–5);

Б – линеаризация экспоненциальной фазы роста опухоли (F% – значение интегральной флуоресценции в процентах от значения в начальный момент времени);

В – усредненные значения коэффициента скорости роста опухоли k (* – p0,01, сравнение с контролем по критерию Даннета, n=4-5).

Планки погрешностей представлены стандартной ошибкой среднего.

Существенная разница в значении данного показателя для клеток с низким (HeLa) и с высоким (SKOV-3, SKOV-kat) уровнем экспрессии HER2 свидетельствует о выраженном усилении токсичности PE40 для HER2-гиперэкспрессирующих клеток после его объединения с HER2-специфичным антителом 4D5scFv. Полученные результаты доказывают высокую избирательность действия созданного иммунотоксина in vitro и предопределяют высокое значение терапевтического индекса при его использовании в качестве HER2-специфичного таргетного препарата in vivo.

Рис. 9. Кривые относительной жизнеспособности HER23+ клеток SKOV-3 и SKOV-kat, HER2+ клеток HeLa и HER2– клеток CHO после их инкубации в течение 72 ч с различными концентрациями 4D5scFv-PE40 (А) или PE40 (Б). Аппроксимация данных проведена методом нелинейной регрессии с использованием четырехпараметрической модели «дозаэффект». Планки погрешностей представлены стандартной ошибкой среднего.

–  –  –

Таким образом, антитело 4D5scFv в составе рекомбинантного иммунотоксина полностью сохраняет свою функциональную активность, обеспечивая адресную доставку фрагмента PE к HER2-гиперэкспрессирующим клеткам за счет эффективного и избирательного связывания с рецептором HER2.

Анализ интернализации и внутриклеточной локализации Поскольку цитотоксический эффект иммунотоксинов на основе PE реализуется в цитоплазме клетки, помимо аффинного и избирательного связывания с поверхностным рецептором-мишенью необходимым критерием их эффективности является последующий эндоцитоз (Weldon, 2011; Pastan, 2007). Показано, что иммунотоксин 4D5scFv-PE40, меченный FITC, проникает в клетки SKOV-3 с высоким уровнем экспрессии HER2 как в отсутствие ингибиторов эндоцитоза (рис.

11А), так и в присутствии блокатора эндоцитоза, опосредованного кавеолами, – филипина (рис. 11Б), о чем свидетельствует распределение флуоресцентного сигнала внутри клетки. В то же время, в присутствии блокатора клатрин-опосредованного эндоцитоза (хлорпромазина) клетки приобретают выраженную окраску по мембране, что указывает на замедление процесса интернализации (рис. 11В). Таким образом, очевидно, что 4D5scFv-PE40 проникает в клетку путем клатрин-опосредованной интернализации.

Рис. 11. Интернализация 4D5scFv-PE40. HER23+ клетки SKOV-3 после инкубации 2 ч при 37оС с иммунотоксином 4D5scFv-PE40, меченным FITC (зеленый), в отсутствие ингибиторов эндоцитоза (А) и в присутствии филипина (Б) или хлорпромазина (В); ex 488 нм, em 505– 600 нм.

Известно, что после рецептор-опосредованной интернализации молекула PE дикого типа проходит в клетке многостадийный ретроградный транспортный путь от эндосом, через аппарат Гольджи (АГ) в эндоплазматический ретикулум (ЭПР), с последующим выходом в цитоплазму, где каталитический домен токсина инактивирует eEF2. Также известно, что нарушения на разных этапах этого транспортного пути могут значительно снизить цитотоксический эффект PE (Weldon, 2011). Анализ внутриклеточного распределения флуоресцентно-меченного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 свидетельствует о его локализации в лизосомах через 2 часа инкубации (рис. 12А), в то время как через более длительный период инкубации (3 часа) иммунотоксин был обнаружен в АГ (рис. 12Б) и в ЭПР (рис. 12В). О локализации меченого иммунотоксина в органеллах судили по совпадению пиков в профилях интенсивности флуоресценции в двух анализируемых каналах: зеленом (красители органелл) и красном (4D5scFv-PE40, меченный DyLight650). Мы предполагаем, что интернализовавшийся иммунотоксин частично деградирует в лизосомах, однако часть молекул проходит продуктивный путь транспорта и попадает ЭПР. Очевидно, это обусловлено наличием последовательности KDEL на Cконце молекулы иммунотоксина, играющей ключевую роль в ретроградном транспорте белков из АГ в ЭПР за счет связывания с KDEL-рецептором мембраны АГ (Chaudhary, 1990; Seetharam, 1991). Далее, с высокой долей вероятности, иммунотоксин (или его C-концевой фрагмент) достигает цитоплазмы, используя систему ЭПР-ассоциированной деградации белков, что было ранее показано для Сконцевого фрагмента PE дикого типа (Koopmann, 2000).

Полученные нами данные позволяют сделать вывод об отсутствии влияния направляющего модуля 4D5scFv на транспортный путь фрагмента PE в клетке.

Рис. 12. Анализ внутриклеточной локализации 4D5scFv-PE40. HER23+ клетки SKOV-3 после инкубации в течение различного времени при 37оС с иммунотоксином 4D5scFv-PE40, меченным DyLight650 (красный), и последующей окраски флуоресцентными маркерами органелл (зеленый): лизосом (А), АГ (Б) и ЭПР (В). Красный канал: ex 635 нм, em 643–735 нм, зеленый канал: ex 488 нм, em 509–566 нм.

Исследование механизмов цитотоксичности и гибели клеток Для выяснения механизма показанного цитотоксического действия иммунотоксина был проведен анализ интенсивности биосинтеза белка в клетках SKOV-3 после суточной инкубации с различными концентрациями 4D5scFv-PE40.

Показано, что 4D5scFv-PE40 в значительной мере ингибирует биосинтез белка, при этом эффект имеет дозозависимый характер со значением IC50 0,05 пМ (рис. 13).

Таким образом, цитотоксический эффект иммунотоксина объясняется блокадой биосинтеза белка, что соответствует механизму цитотоксичности PE дикого типа и, следовательно, обусловлено действием токсического модуля иммунотоксина (PE40).

Полученные результаты также свидетельствуют о продуктивном транспорте иммунотоксина в клетках SKOV-3, заканчивающемся выходом в цитоплазму функционально активного фрагмента PE.

Для определения типа гибели клеток SKOV-3 под действием иммунотоксина 4D5scFv-PE40 был проведен анализ экстернализации фосфатидилсерина (ФС) – одного из ранних признаков апоптоза, появляющегося в результате потери асимметричности распределения липидов плазмалеммы. Для этого клетки были окрашены смесью аннексина V-FITC (AnxV – белок, специфично связывающийся с ФС) и йодида пропидия (PI – краситель ДНК, проникающий только в клетки с нарушенной мембраной). Была обнаружена выраженная экстернализация фосфатидилсерина (рис. 14А, Б): через 72 ч инкубации с иммунотоксином доля апоптотических клеток, т.е. сумма клеток, находящихся в раннем (PI –AnxV+) и позднем (PI+AnxV+) апоптозе, составила около 50%.

–  –  –

Рис. 14. Анализ гибели клеток SKOV-3 после инкубации с 50 нМ 4D5scFv-PE40 в течение различного времени. А – анализ экстернализации ФС после окраски клеток AnxV-FITC/PI (доля клеток в каждом квадранте указана в процентах).

FITC: ex 488 нм, em 515–545 нм, PI:

ex 488 нм, em 564–606 нм; Б – распределение клеток по типу гибели.

Промежуточные стадии, связывающие ингибирование фактора элонгации трансляции 2 под действием PE и индукцию апоптоза, неизвестны. Однако предполагается участие белков семейства Bcl-2: в частности, показано, что PE дикого типа вызывает деградацию анти-апоптотического белка Mcl-1 и активацию проапоптотического белка Bak, что приводит к запуску митохондриального пути апоптоза (Du, 2010).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученная ксенографтная модель HER2-гиперэкспрессирующей опухоли, флуоресцирующая в области «окна прозрачности» биологических тканей, представляется высокоэффективным инструментом для решения задач экспериментальной онкологии. Использование данной модели позволяет прижизненно проводить мониторинг роста опухоли в организме одного и того же животного с помощью неинвазивного метода поверхностного флуоресцентного имиджинга. Показанная высокая информативность такого подхода в отношении визуализации опухолевых клеток in vivo обеспечивает корректную оценку динамики роста опухоли, что особенно важно при исследовании противоопухолевого эффекта потенциальных терапевтических агентов. Гиперэкспрессия рецептора-мишени HER2 клетками полученной опухолевой модели открывает возможности ее использования для оценки эффективности агентов для таргетной HER2-специфичной терапии. В частности, в работе выявлен выраженный противоопухолевый эффект созданного нами HER2-специфичного иммунотоксина 4D5scFv-PE40 на основе HER2специфичного антитела 4D5scFv и фрагмента псевдомонадного экзотоксина А (PE40).

Объединение двух функциональных модулей, направляющего (4D5scFv) и токсического (PE40), в единую белковую молекулу обеспечило, с одной стороны, прицельную доставку иммунотоксина в HER2-экспрессирующие опухолевые клетки за счет специфичного и аффинного взаимодействия c рецептором HER2 и последующей клатрин-опосредованной интернализации, а с другой – мощный цитотоксический эффект на клетки-мишени, выражающийся в ингибировании биосинтеза белка и запуске апоптоза. Таким образом, сохранение функциональных свойств 4D5scFv и PE40 в составе рекомбинантного иммунотоксина обусловило его высокую и селективную токсичность в отношении клеток, гиперэкспрессирующих HER2, что на уровне организма животного in vivo выразилось в торможении роста модельной опухоли (рис. 15).

Рис. 15. Предполагаемый механизм действия HER2-специфичного иммунотоксина 4D5scFvPE40.

ВЫВОДЫ

1. Создана ксенографтная модель аденокарциномы яичника человека на иммунодефицитном животном, характеризующаяся гиперэкспрессией рецептора HER2 и стабильной экспрессией дальнекрасного флуоресцентного белка Katushka, спектр эмиссии которого лежит в области терапевтического окна прозрачности биологических тканей.

2. Показана высокая информативность созданной модели для прижизненной визуализации опухоли в организме животного неинвазивным методом флуоресцентного имиджинга, продемонстрированы возможности ее использования для высокоэффективной оценки действия противоопухолевых агентов.

3. С использованием полученной флуоресцирующей модели установлен выраженный противоопухолевый эффект созданного рекомбинантного иммунотоксина 4D5scFvPE40 на основе псевдомонадного экзотоксина A и HER2-специфичного антитела формата scFv.

4. Установлен механизм избирательного цитотоксического действия иммунотоксина 4D5scFv-PE40, заключающийся в аффинном и специфичном связывании иммунотоксина с рецептором HER2 на поверхности опухолевых клеток, клатринопосредованной интернализации и распределении в компартментах клетки, характерном для молекулы псевдомонадного экзотоксина А дикого типа, ингибировании биосинтеза белка и последующей гибели клеток по пути апоптоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК:

1. E. Sokolova, G. Proshkina, O. Kutova, O. Shilova, A. Ryabova, A. Schulga, O.

Stremovskiy, T. Zdobnova, I. Balalaeva, S. Deyev. Recombinant targeted toxin based on HER2-specific DARPin possesses a strong selective cytotoxic effect in vitro and a potent antitumor activity in vivo // Journal of Controlled Release, 2016, 233: 48-56.

2. T. Zdobnova, E. Sokolova, O. Stremovskiy, D. Karpenko., W. Telford, I. Turchin, I.

Balalaeva, S. Deyev. A novel far-red fluorescent xenograft model of ovarian carcinoma

for preclinical evaluation of HER2-targeted immunotoxins // Oncotarget, 2015, 6 (31):

30919-28.

3. Е.А. Соколова, О.А. Стремовский, Т.А. Здобнова, И.В. Балалаева, С.М. Деев.

Рекомбинантный иммунотоксин 4D5scFv-PE40 для таргетной терапии HER2положительных опухолей // Acta Naturae, 2015, 7 (4): 68-72.

4. И.В. Балалаева, Е.А. Соколова, А.А. Брилкина, С.М. Деев, Р.В. Петров.

Дальнекрасная флуоресцирующая линия клеток для доклинического тестирования HER2-специфичных таргетных препаратов // Доклады Академии Наук (биохимия, биофизика, молекулярная биология), 2015, 465 (5): 617-619.

5. И.В. Балалаева, Т.А. Здобнова, Е.А. Соколова, С.М. Деев. Направленная доставка квантовых точек к HER2-экспрессирующей опухоли с помощью рекомбинантных антител // Биоорганическая химия, 2015, 41 (5): 599-605.

6. Е.А. Соколова, Т.А. Здобнова, О.А. Стремовский, И.В. Балалаева, С.М. Деев.

Новый рекомбинантный анти-HER2/neu иммунотоксин: получение и оценка противоопухолевой эффективности // Биохимия, 2014, 79 (12): 1680-1686.

7. Е.А. Малеханова (Соколова), Т.А. Здобнова, А.А. Брилкина, Н.Ю. Шилягина, И.В.

Балалаева, С.М. Деев. Получение и исследование цитотоксических свойств рекомбинантного иммунотоксина, специфичного к рецептору ErbB2, на основе псевдомонадного экзотоксина A // Вестник Нижегородского университета им. Н.И.

Лобачевского, 2014, 2(1): 122-126.

Патент на изобретение:

8. С.М. Деев, О.А. Стремовский, Т.А. Здобнова, И.В. Балалаева, Е.А. Соколова, Г.М.

Прошкина. Рекомбинантный иммунотоксин, специфичный к клеткам, экспрессирующим рецептор HER2. Патент на изобретение №2576232, дата публикации 27.02.2016.

Тезисы конференций:

9. Е.А. Соколова, Е.Л. Гурьев, О.А. Стремовский, С.М. Деев, И.В. Балалаева.

Противоопухолевый рекомбинантный иммунотоксин на основе HER2специфичного антитела 4D5scFv и псевдомонадного экзотоксина А // Тезисы докладов 69-й Всероссийской школы-конференции молодых ученых «Биосистемы:

организация, поведение, управление». С. 185. Нижний Новгород, Россия, 27–29 апреля 2016 г.

10. Е.А. Соколова, Т.А. Здобнова, О.А. Стремовский, И.В. Балалаева, С.М. Деев.

Получение и оценка эффективности нового HER2-специфичного рекомбинантного иммунотоксина на основе псевдомонадного экзотоксина А // Материалы VII Российского симпозиума «Белки и пептиды». С. 376. Новосибирск, Россия, 12-17 июля 2015.

11. Е.А. Соколова, Т.А. Здобнова, О.А. Стремовский, И.В. Балалаева, С.М. Деев.

Новый противоопухолевый иммунотоксин на основе псевдомонадного экзотоксина А: получение и оценка эффективности // Сборник тезисов 19-ой международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века». С.

369-370. Пущино, Россия, 20-24 апреля 2015.

12. Е.А. Соколова, Т.А. Здобнова, О.А. Стремовский, И.В. Балалаева, С.М. Деев.

Новый иммунотоксин на основе HER2-специфичного дарпина и псевдомонадного экзотоксина А // Acta Naturae. Спецвыпуск (материалы международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 55-летию ИБХ РАН и 80-летию со дня рождения академика Ю.А.

Овчинникова). 2014. №1. С. 62-63.

13. E.A. Malekhanova (Sokolova), I.V. Balalaeva, T.A. Zdobnova, N. Yu. Lekanova, O.A. Stremovskiy, S.M. Deyev. Experimental tumor model expressing far-red emitting fluorescent protein for treatment efficacy estimation // Book of abstracts of ESP Photobiology School 2012. P. 39.

14. Е.А. Малеханова (Соколова), И.В. Балалаева, Т.А. Здобнова, Н.Ю. Леканова, О.А. Стремовский, С.М. Деев. Оценка противоопухолевой эффективности нового рекомбинантного иммунотоксина на основе псевдомонадного экзотоксина А методом флуоресцентного биоимиджинга // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического Конгресса молодых ученых "Симбиоз-Россия 2012", с.253-255. г. Тверь: Изд-во "Заповедник Времени", 2012.

Тверь, Россия, 3-8 декабря 2012.

15. Е.А. Малеханова (Соколова), И.В. Балалаева, Т.А. Здобнова, Н.Ю. Леканова, О.А. Стремовский, С.М. Деев. Оценка противоопухолевой эффективности иммунотоксина методом флуоресцентного биоимиджинга // Материалы IV Съезда биофизиков России, Симпозиум III «Физика - медицине и экологии», с. 147, Нижний Новгород, 2012.

16. И.В. Балалаева, Н.Ю. Леканова, Е.А. Малеханова (Соколова), М.В. Ширманова, Т.А. Здобнова, А.А. Брилкина, Л.Г. Клапшина, М.С. Клешнин., И.И. Фикс, Е.В.

Загайнова, И.В. Турчин, С.М. Деев. Методы флуоресцентного имиджинга на уровне целого организма для решения задач экспериментальной онкологии // Материалы IV Съезда биофизиков России, Симпозиум III «Физика - медицине и экологии», с. 21, Нижний Новгород, 2012.

17. E.A. Malekhanova (Sokolova), N.Y. Lekanova, I.V. Krutova, I.V. Balalaeva, S.M.

Deyev. Experimental model for fluorescent imaging of tumor growth and regression under therapeutic treatment // Materials of Saratov Fall Meeting, http://sfm.eventry.org/report/116 (электронные тезисы). Saratov, Russia, September 27I.V. Balalaeva, E.A. Malekhanova (Sokolova), N.Y. Lekanova, I.V. Krutova, A.A.

Brilkina, O.A. Stremovskiy, S.M. Deyev. Studies of anti-HER2/neu immunotoxin antineoplastic activity on fluorescent tumor model // Proceedings of International Symposium “Topical problems of biophotonics-2011”, p.37. St.-Petersburg – Nizhny Novgorod, Russia, 16-22 July, 2011.

19. I.V. Balalaeva, E.A. Malekhanova (Sokolova), N.Y. Lekanova, I.V. Krutova, A.A.

Brilkina, O.A. Stremovskiy, S.M. Deyev. Fluorescence imaging studies of antiHER2/neu immunotoxin antineoplastic activity // Book of abstracts of the 14th Congress “European society for photobiology”, p.50. Geneva, Switzerland, September 1-6, 2011.

20. И.В. Балалаева, Е.А. Малеханова (Соколова), Н.Ю. Леканова, И.В. Крутова, А.А Брилкина, С.М. Деев. Оценка противоопухолевой активности иммунотоксина, специфичного к рецептору HER2/neu, на модели флуоресцирующей опухоли // Материалы VI Съезда Российского фотобиологического общества, с.153. Шепси, Россия, 15-22 сентября 2011.

21. Е.А. Малеханова (Соколова), Н.Ю. Леканова, И.В. Крутова, И.В. Балалаева, С.М. Деев. Оценка эффективности противоопухолевых препаратов на модели флуоресцирующей опухоли // Сборник тезисов 15-ой Пущинской международной школы-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века», с.193.

Пущино, Россия, 18-22 апреля 2011.



Похожие работы:

«ПРОГРАММЫ РАЗВИТИЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И МОНИТОРИНГА НПРА Общая программная цель – развитие научных исследований и мониторинга, направленных на оценку текущего состояния, динамики и прогнозируемых изменений охраняе...»

«Рабочая программа элективного курса "Многообразие и эволюция живых организмов" для 10 класса средней общеобразовательной школы на 2016-2017 учебный год Нормативный срок освоения 1год Разработана на основании Программы для общеоб...»

«Труды Никитского ботанического сада. 2005. Том 125 РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ С.В. ШЕВЧЕНКО, доктор биологических наук Репродуктивная биология растений является особой научной проблемой, включающей всестороннее исследование...»

«Кожин Михаил Николаевич ФЛОРИСТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ПУТИ ФОРМИРОВАНИЯ ОСТРОВНЫХ ФЛОР КАНДАЛАКШСКОГО ЗАЛИВА (на примере Порьей губы) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандид...»

«Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики УТВЕРЖДАЮ Заведующий кафедрой _ подпись инициалы, фамилия " _" 20 _ г. БАКАЛАВРСКАЯ...»

«Чекунова Елена Михайловна ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ РАННИХ ЭТАПОВ БИОСИНТЕЗА ХЛОРОФИЛЛА У ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ CHLAMYDOMONAS REINHARDTII Специальность: 03.02.07 – генетика Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научный консультант академик РАН, д.б.н., профессор, С.Г. Инг...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА В рамках направления 06.03.01 Биология (профиль подготовки Биоэкология) учебный процесс направлен на практико-ориентированное обучение студентов, что формирует компетентность будущего...»

«Ерохин Павел Сергеевич АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК ИНСТРУМЕНТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К ФАКТОРАМ БИОТИЧЕСКОЙ И АБИОТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ 03.01.02 – биофизика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель: Професс...»

«Научно-исследовательская работа Биологические ритмы человека Выполнил: Подгайный Вадим Евгеньевич учащийся 8Г класса МБОУ СОШ №30 Руководитель: Белова Людмила Васильевна учитель химии МБОУ СОШ № 30...»

«7 А. Ю. Заякин Природа и экология Красноярского края Ландшафты и животный мир Заякин А. Ю.ПРИРОДА И ЭКОЛОГИЯ КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ ЛАНДШАФТЫ И ЖИВОТНЫЙ МИР 7 класс Учебное пособие Учебное пособие "Природа и экология Красноярского края, 7 класс. Ландшафты и животный мир" предназначено для учащихся общеобразов...»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.