WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

Pages:   || 2 |

«Анохина Елена Николаевна ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФГБОУ ВПО «Адыгейский государственный университет»

На правах рукописи

Анохина Елена Николаевна

ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ПРО- И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ

ЦИТОКИНОВ, МУТАЦИИ ГЕНОВ BRCA1/2 ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ

НОВООБРАЗОВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ

СИСТЕМЫ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Тугуз А.Р.

Майкоп 2015 Оглавление Список сокращений…………………………………………………………… 3 Введение ………………………………………………………………………. 5 Глава I. Обзор литературы ………………………………………………… Гены-маркеры, ассоциированные со злокачественными 1.1. 11 новообразованиями женских репродуктивных органов……………….

1.1.1. Распределение мутаций генов BRCA 1/2 при неоплазиях женских 13 репродуктивных органов в мировых популяциях.…………………… 1.1.2. SNP промоторных регионов генов цитокинов и их ассоциация с 22 неоплазиями женских репродуктивных органов…………………….

1.2. Сывороточные уровни, спонтанная и стимулированная продукция 34 цитокинов in vitro PBMC больных и доноров………………….............

Глава II. Материалы и методы исследования ……………………………… 38

2.1. Реактивы, тест-системы и материалы………………………………….. 38



2.2. Экспериментальные методы …………………………………………… 39

2.3. Контингент обследованных лиц………………………………………..... 45

2.4. Статистическая обработка данных ……………………………………… 47 Глава III. Результаты исследований ………………………………………… 48

3.1. Мутации генов BRCA1/2 при злокачественных новообразованиях женских репродуктивных органов у жителей РА ……………..……… 48

3.2. Полиморфизмы генов про- и противовоспалительных цитокинов …... 50

3.3. Сывороточные уровни, спонтанная и стимулированная in vitro продукция цитокинов PBMC ………………………………………….. 69

3.4. Влияние генотипов и гаплотипов промоторных регионов генов цитокинов на продукцию медиаторов………………………………… 78 Обсуждение результатов……………………………………………………… 87 Выводы…………………………………………………………………………. 99 Практические рекомендации ……………………………………………….. 100 Список литературы……………………………………………………………. 101 Приложения ………………………………………………………………….. 130 Списоксокращений АПК – антиген-презентирующие клетки ЗНО – злокачественные новообразования ИФА – иммуноферментный анализ ЛПС – липополисахариды мРНК – матричная (информационная) рибонуклеиновая кислота ПЦР – полимеразная цепная реакция РА – Республика Адыгея РФ – Российская Федерация РМЖ – рак молочной железы РТМ – рак тела матки РШМ – рак шейки матки РЯ – рак яичника ТАЕ буфер – трис-ацетатный буфер ФГА – фитогемагглютинин ЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрия BRCA1/2 – гены Breast cancer antigen1/2 CD – кластер дифференцировки (от англ. cluster of differentiation) ELISA – иммуноферментный анализ (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay) FS – фетальная сыворотка (от англ. fetal serum) G-CSF – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор GM-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (от англ. granulocyte colony stimulating factor) IFN – интерферон Ig – иммуноглобулин IL – интерлейкин (от англ. interleukin) IL-2R – рецептор интерлейкина 2 IL-4R – рецептор интерлейкина 4 MHC – главный комплекс гистосовместимости (от англ.





Major histocompatibility complex) NK – естественные киллеры (от англ. natural killer) PBMC – мононуклеарные клетки периферической крови (от англ. peripheral blood mononuclear cells) PCR- Real Time – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (от англ. polymerase chain reaction in real time) rs – цифровая эталонная последовательность полиморфизмов (от англ. reference sequence) SNP – единичные нуклеотидные полиморфизмы (от англ. single nucleotide polymorphisms) Th1 – Т-хелперы 1-го типа Th2 – Т-хелперы 2-го типа TNF – фактор некроза опухолей (от англ. tumor necrosis factor) UTR – нетранслируемый участок гена (от англ. UnTranslated Region)

Введение

Актуальность исследования. Злокачественные новообразования (ЗНО) женских репродуктивных органов занимают одно из ведущих мест в структуре общей заболеваемости и смертности населения стран мира и России (Давыдов и др., 2009; Чиссов и др., 2012; Каприн и др., 2013).

Ежегодно в мире регистрируется около 1 млн. больных с впервые выявленным диагнозом рака молочной железы (РМЖ) и более 400 000 летальных исходов (Kamangar et al, 2006). В Европе показатели заболеваемости РМЖ по данным International Agency for Research on Cancer (IARC, 2012г.) составили в среднем 80,4 на 100 тыс. женского населения (в России – 76,7; в Нидерландах Дании - 86,2; Франции - 83,2; Бельгии - 82,2; Швеции - 81,0).

В большинстве индустриальных стран мира неоплазии женских репродуктивных органов имеют самые высокие показатели смертности. За последние 10 лет (2003-2013 гг.) в России и Республике Адыгея наблюдается устойчивая тенденция к росту смертности от рака молочной железы (прирост в 2013 г. составил 2,63 и 4,7% соответственно), яичников (3,39 и 1,9% соответственно), тела и шейки матки (8,82/3,56% и 6,04/5,9% соответственно), что в значительной степени обусловлено поздней диагностикой заболеваний (Каприн и др., 2015).

Одним из подходов, способствующих раннему выявлению рака молочной железы, яичников (РЯ), тела (РТМ) и шейки матки (РШМ), является молекулярногенетические исследования (Nathanson et al., 2001; Venkitaraman, 2001). ЗНО женских репродуктивных органов преимущественно ассоциируют с генами BRCA (Breast cancer antigen) - BRCA1 и BRCA2, локализованными соответственно в 17 и 13 соматических хромосомах (www.genecards.org). Функции генов BRCA1/2 связаны с поддержанием стабильности генетического аппарата клеток, репарации ДНК, обеспечивающей целостность генома (Wang Y. et al., 2000). Мутации и многочисленные полиморфные варианты генов BRCA1/2, снижающие супрессивный эффект продуктов генов BRCA1/2 на опухолевые клетки и обуславливающие развитие ЗНО молочной железы, желудка и других локализаций, неравномерно распределены в мировых популяциях, чаще выявляются у евреек-Ашкенази с РМЖ (до 22%), но для других этнических групп не имеют высокой прогностической значимости (Levy-Lahad et al., 1997;

Mehdipour et al., 2006; Krajc et al., 2008; Esteves et al., 2009; Brozek et al., 2011;

Kwong et al., 2012; Blay et al., 2013).

Актуальность исследования обусловлена поиском прогностически информативных генов-маркеров – ранних предикторов неопластических процессов для разных этнических групп. Гены медиаторов иммунной системы – иммунорегуляторных низкомолекулярных про- и противовоспалительных цитокинов, регулирующих системные воспалительные реакции организма, могут быть вовлечены в патофизиологические процессы, включая и неопластические (Кологривова и др., 2011). В ряде работ представлены весьма противоречивые сведения о роли цитокинов при некоторых злокачественных новообразованиях (Han et al., 2008; Konwar R. et al., 2009; Roszak et al., 2012).

Фактором, определяющим двойственную роль цитокинов в развитии системных заболеваний могут быть полиморфизмы их генов в виде точечных мутаций (SNP – single nucleotide polymorphisms) с заменой одного нуклеотида на другой, делеций нуклеотидов или небольших фрагментов гена, инсерций, многочисленных тандемных повторов частей генов и т.д.. SNP в экзонах, интронах и в промоторных участках регулируют интенсивность экспрессии и, соответственно, биологические эффекты цитокинов (Кутихин и др., 2012).

Цель работы: исследование ассоциации полиморфизмов генов основных про- и противовоспалительных цитокинов со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов.

Задачи:

1. Анализ распределения мутаций генов-супрессоров опухолевого роста BRCA1/2 (5382insC, 185delAG, 4153delA, Cys61Gly, 2080delA, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 6174delT) у доноров и онкологических больных.

2. Типирование полиморфизмов генов IL-17A (G197A), IL-17F (A7488G, His161Arg), IL-2 (T330G), IL-12B (А1188С), IL-10 (G1082A, C819T, C592A), ILC589Т), ассоциированных со злокачественными новообразованиями органов женской репродуктивной системы.

3. Выявление опухолевой прогрессии и прогностически SNP-маркеров неблагоприятных гистотипов низкодифференцированной аденокарциномы молочной железы.

4. Исследование влияния полиморфизмов генов IL-17A (G197A), IL-2 (T330G), ILG1082A, C819T, C592A), IL-4 (C589Т) на спонтанную и стимулированную in vitro продукцию цитокинов в культуре мононуклеарных клеток крови доноров и онкологических больных.

Научная новизна работы.

Впервые у жителей Республики Адыгея в норме и при онкопатологии:

- определены частоты 8 мутаций генов BRCA1/2 у доноров и больных со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов;

типированы аллельные варианты генов основных про- и противовоспалительных цитокинов: IL-17А (G197A), IL-17F (A7488G, His161Arg), IL-2 (T330G), IL-4 (C589Т), IL-10 (G1082A, C819T, C592A), IL-12В (А1188С) в этнических группах населения РА;

- установлены аллельные варианты генов IL-17А (G197) и IL-10 (819T), ассоциированные с опухолевой прогрессией и прогностически неблагоприятным гистотипом низкодифференцированной аденокарциномы молочной железы.

- выявлены этнические различия по ассоциации полиморфизмов генов основных про- и противовоспалительных цитокинов со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов (у русских женщин - G197 аллель IL-17A, 819T полиморфный вариант IL-10, у адыгеек - 161Arg полиморфизм IL-17F, 592A аллель IL-10).

Впервые в России и мире исследовано влияние полиморфизмов генов IL-2, IL-4, IL-10, IL-17A и гаплотипов гена IL-10 на сывороточные уровни и продукцию цитокинов in vitro онкологических больных с гистологически PBMC верифицированным диагнозом рака молочной железы.

Научно-практическая значимость:

На основании экспериментальных данных показано, что с неоплазиями женских репродуктивных органов ассоциированы полиморфизмы генов противовоспалительных IL-4, IL-10, влияющие на продукцию цитокинов.

Типированные молекулярно-генетические детерминанты опухолевой прогрессии и прогностически неблагоприятных гистотипов неоплазий расширят представления о механизмах клеточной трансформации и будут способствовать разработке медиаторной концепции канцерогенеза.

Полученные новые данные могут быть востребованы в предиктивной медицине и включены в перечень скрининговых панелей онкологических диспансеров для донозологической диагностики ЗНО женских репродуктивных органов; использованы в преподавании дисциплин федерального компонента генетики, иммунологии для биологических факультетов университетов, для разработки курса лекций по клинической генетике, клинической иммунологии в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту:

Мутации генов BRCA1/2 прогностически не значимы при ЗНО 1.

женских репродуктивных органов в этнических группах населения РА.

Факторами риска развития РМЖ, РТМ, РШМ являются 161Аrg 2.

аллель, His161Аrg генотип гена IL-17F, 592A аллельный вариант гена IL-10 (преимущественно у адыгов), G197 аллель гена IL-17А, 819T полиморфизм гена IL-10, А1188А генотип и А1188 аллель гена IL-12В (у русских женщин), 589T аллель гена IL-4 (для адыгов и русских).

Опухолевая прогрессия сопряжена с носительством G197 аллели гена 3.

IL-17A, Т330 аллельного варианта гена IL-2, 589T аллели гена IL-4, А1188 – ILВ, G1082 и 819T аллелей гена IL-10.

онкологических больных по сравнению с донорами

4. PBMC характеризуются гипопродукцией медиаторов, регулирующих основные этапы реализации базовой воспалительной реакции и противоопухолевого иммунитета:

триггерного IL-17, ростового IL-2, противовоспалительного IL-10.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены в материалах научно-практических конференций: VIII ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2012); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» 2012);

(Санкт-Петербург, Международной научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Перспектива-2013» (Нальчик, 2013); 18-ой международной Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2014); VI съезде вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированных генетических симпозиумах (Ростов-на-Дону, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 1 методическое пособие; 8 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ; 6 публикаций – в материалах российских конференций.

Внедрение результатов исследования.

Работа выполнена в рамках аналитической ведомственной целевой программы, проводимой по заданию Минобрнауки РФ в 2012-2014 гг. (ЕЗН, код ГРНТИ 34.2341, 34.23.53, 34.13.37, № проекта 4.1334.2011, № гос. контракта 01201276009).

Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс Адыгейского государственного университета и лечебного факультета Майкопского государственного технологического университета в рамках биологических и клинических дисциплин: нормальная физиология, медицинская генетика, иммунология для подготовки биологов и врачей общей практики.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста, содержит 46 таблиц, иллюстрирована 10 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя используемой литературы и приложения. Список литературы включает 48 отечественных и 232 иностранных источников.

Глава I. Обзор литературы

1.1 Гены-маркеры, ассоциированные со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов В структуре общей заболеваемости и смертности населения стран мира одно из ведущих мест занимают злокачественные новообразования. К нозологиям с многолетней тенденцией к росту относят неоплазии женских репродуктивных органов: молочной железы, матки, шейки матки и яичников. В РФ по данным Ассоциации онкологов России 30,8% случаев приходится на ЗНО женских репродуктивных органов. В Республике Адыгея за последние 10 лет уровень заболеваемости ЗНО этих локализаций возрос в 2,5 раза и составил 116,9 человек на 100 тыс. населения [Чиссов и др., 2012; Каприн и др., 2013-2015].

С развитием онкогенетики выявлены гены, вовлеченные в канцерогенез и ассоциированные с новообразованиями молочной железы, яичников и др.

нозологий [Miki et al., 1994; Wooster et al., 1995]. В современных геномных базах (Breast Cancer Information Core (BIC) database, International Cancer Research Partnership (ICRP) database, Cancer Genomics Hub (CGHub) database, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) собраны сведения о генах и их аллельных вариантов, вовлеченных в патогенез онкологических заболеваний. К генаммаркерам, ассоциированным со ЗНО женских репродуктивных органов относят гены BRCA1 и BRCA2 (www.research.nhgri.nih.gov). Наиболее распространенные мутации гена BRCA1 185delAG и 5382insC, повышающие риск развития злокачественных новообразований женских репродуктивных органов обнаружены в этнических группах населения Америки, Африки, Восточной, Центральной Европы, в том числе и России (Центральный и Сибирский регионы), но распределены в мировых популяциях неравномерно и редко выявляются даже при наследственных формах РМЖ и РЯ. Для жителей Австралии, Японии, Китая и Северной Европы характерны высокие частоты минорных мутаций BRCA1, не встречающиеся в других регионах мира [Vehmanen et al., 1997; Southey et al., 1999; Khoo et al., 2000; Bjorge et al., 2004; Suter et al., 2004; Sugano et al., 2008;

Kwong et al., 2012]. Этногеографический анализ не выявил универсальных мутаций генов BRCA1/2 – маркеров злокачественных новообразований женских репродуктивных органов, поэтому представляется целесообразным поиск иных, более информативных и прогностически значимых мутаций других геновкандидатов ЗНО.

Научный интерес представляют гены про- и противовоспалительных цитокинов, регулирующие системные воспалительные реакции организма, которые могут быть вовлечены в патофизиологические процессы, включая и неопластические. Интерлейкины оказывают плейотропные биологические эффекты на различные типы клеток, участвуя в формировании воспалительной реакции и запуская каскад цитокиновой сети. Действие медиаторов на злокачественно-трансформированные клетки приводит к апоптозу, стимуляции процессов клеточного деления, инициации дифференцировки и поликлональной экспансии клеток. В цитоплазме малигнизированных клеток выявляется практически весь спектр молекул, способных обрабатывать регуляторные сигналы цитокинов и запускать определенные механизмы [Свердлов, 2001;

Белецкий и др., 2002; Антонов и др., 2004; Кетлинский и др., 2008].

Фактором, определяющим роль цитокинов в развитии системных заболеваний, могут быть полиморфизмы их генов в виде точечных мутаций (SNP) с заменой одного нуклеотида на другой, делеций нуклеотидов или небольших фрагментов гена, инсерций, многочисленных тандемных повторов частей генов и т.д.. SNP в экзонах, интронах и в промоторных участках генов регулируют интенсивность экспрессии и, соответственно, биологические эффекты цитокинов [Кологривова и др., 2011].

1.1.1 Распределение мутаций генов BRCA 1/2 при неоплазиях женских репродуктивных органов в мировых популяциях BRCA1/2 – гены-супрессоры, нормальная функция которых связана с подавлением опухолевого роста, поддержанием стабильности генетического аппарата клеток. Продукты, кодируемые генами BRCA1, BRCA2 образуют большой комплекс белков, названных BASC (BRCA1-associated genome surveillance complex), участвующих в гомологичной рекомбинации и репарации ДНК, которые по данным Wang Y. et al. (2000) обеспечивают целостность генома и оказывают супрессивный эффект на опухолевые клетки.

BRCA1, ответственный за наследственную предрасположенность к РМЖ и РЯ у евреек-Ашкенази, картирован Miki et al. (1994) на длинном плече 17 хромосомы (17q21) и состоит из 22 кодирующих и 2 некодирующих экзонов, разделенных интронами, (рис. 1).

Рис.1 Цитогенетическая структура 17 хромосомы и расположение гена BRCA1;

стрелкой указано месторасположение гена (по данным GeneCards®) Wooster et al. (1995) клонировали второй ген BRCA2, локализованный в 13 хромосоме (13q12) и обуславливающий наследование повышенного риска развития РМЖ. Tavtigian et al. (1996) при секвенировании гена BRCA2 выявили 26 кодирующих и 1 некодирующий экзоны, разделенные интронами (рис.2).

Рис.2 Цитогенетическая структура 13 хромосомы и расположение гена BRCA2;

стрелкой указано месторасположение гена (по данным GeneCards®)

–  –  –

пуриновых оснований на пиримидиновые в структуре кодонов, транзиции – замена пуринового основание на другие пуриновые или пиримидинового на другое пиримидиновое основание и полиморфизмы – точечные мутации, связанные с замещением одного нуклеотида и др. (табл.1).

–  –  –

Из 1089 известных мутаций гена BRCA1 исследованы частоты 185delAG;

5382insC; 300TG (Cys61Gly); 4154delA; 4730insG; 2080delA; 2080insA;

IVS13+1GA; 2430TC; 1806CT; 3888delGA; 916delTT; 3415delC; Ser955Stop;

Glu5331Ala; exon13ins6kb; 2594delC; 3604delА; 3347delAG; 1135insA; 1675delA;

IVS5+3AG; 2478insG; IVS8-57delT; 4184del4; Tyr856His; 1081delG; 2372delTG.

Наиболее распространенные мутации гена BRCA1 185delAG; 5382insC; 300TG распределены в мировых популяциях (Cys61Gly); 4154delA; 2080delA неравномерно. По данным электронных баз HuGEN, Pubmed для гена BRCA2 наиболее изучены мутации: 6174delT, 6261insGT, IVS16-2AG, 3492insT, 8765delAG, 6503delTT, 4512insT, 5579insA, IVS6+1GA, 9132delC, Cys315Ser, Glu1037Stop, 2041delA, Ser1882Stop.

Мутации генов BRCA1 и BRCA2 в канцерогенезе. Делеции, инсерции и др. мутации в генах BRCA1/2 могут вызвать потерю функциональных возможностей белков и привести к ошибкам репликации, повышенной чувствительности к генотоксическим воздействиям, запускать системные патологические процессы, приводящие к злокачественной трансформации клеток и развитию неоплазий [Карпухин и др., 2002; Любченко и др., 2007; Kadouri et al., 2007]. Так как первоначально мутации генов BRCA1 и BRCA2 были обнаружены в ассоциации с новообразованиями молочной железы (breast cancer), то соответственно получили название Breast Cancer antigen (BRCA). Однако, по результатам исследований, представленных в международных базах данных, мутации и полиморфизмы в генах BRCA1/2 могут быть ассоциированы со злокачественными новообразованиями не только женских репродуктивных органов (молочной железы, тела и шейки матки, яичников), но и других локализаций: желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, мочевого пузыря, желчевыводящих путей и др. [Cybulski et al., 2008; Mai et al., 2009; Gallagher et al., 2010; Manguoglu et al., 2010; Slater et al., 2010; Hughes et al., 2012].

Мета-анализы многочисленных этногенетических исследований подтверждают вовлеченность в канцерогенез разных мутаций генов BRCA1/2 (30 и 15 соответственно), поэтому их часто относят к генам-маркерам спорадических и семейных форм ЗНО, несмотря на низкую (до 30%) выявляемость даже при герминальных неоплазиях [Diez et al., 1999; Osorio et al., 2002; Loureno et al., 2004; Mehdipour et al., 2006; Blay et al., 2013].

Высокопенетрантными герминальными мутациями являются 185delAG;

5382insC; 300TG (Cys61Gly); 4154delA в гене BRCA1 и 6174delT в BRCA2.

Внутри- и межэтнические распределения этих генов-маркеров опухолевой прогрессии при однотипных ЗНО различаются и т.к. у некоторых народов они встречаются чаще, получили название эффекта основателя (founder effect или родоначальник мутаций), передаются из поколения в поколение, специфичны для некоторых этнических групп и используются для определения генетического родства народов [Einbeigi et al., 2001; Baudi et al., 2001; Kadouri et al., 2007].

Для выявления общих универсальных маркеров, ассоциированных со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов нами проведен мета-анализ по спектру наиболее часто встречающихся мутаций гена

–  –  –

185delAG гена BRCA1 одна из наиболее распространенных в мире мутаций, ранее считавшаяся специфичной для евреек-Ашкенази при РМЖ, с высокой частотой выявлена в географически удаленных странах мира: 22,7% Израиль [Levy-Lahad et al., 1997); 22,0% - Египет [El-said El-Debaky et al., 2011];

20,7% и 16,4% – Индия [Vinodkumar et al., 2007; Vaidyanathan et al., 2009]; 18,0% – Канада [Phelan et al., 2002] и др. (Приложение А). Следует отметить, что высокие значения частот 185delAG мутации гена BRCA1 представлены в исследованиях на малых выборках больных [Levy-Lahad et al., 1997; Vinodkumar et al., 2002]. У женщин славянской языковой группы (России, Украины, Польши, Белоруссии – стран Восточной Европы) с РМЖ и РЯ частота 185delAG составляет 0 - 3,1%, поэтому спорным остается вопрос об использовании этой мутации как маркера, ассоциированного с риском развития ЗНО [Gorski et al., 2004; Смирнова, 2008;

Zakhartseva et al., 2009; Silin et al., 2009; Порханова, 2009; Любченко, 2009;

Часовникова и др., 2010; Brozek et al., 2011; Лобейко, 2012].

Распространенность 5382insC гена BRCA1 проанализирована в 45 работах (табл. 2); частота мутации в небольших выборках онкологических больных разных этнических групп (Египет, n=50; Польша, n=200; Россия, n=224, Чехия,

n=151, Румыния, n=26) составляет соответственно 56,0% : 34,0% : 28,6% : 12,0% :

11,5%. В больших выборках обследованных больных (Польша, n=4177) частота 5382insC не превышает 4,5%. По другим мутациям и полиморфизмам гена BRCA1 в международных базах имеются немногочисленные сведения (HuGEN, Pubmed).

Делеция 6174delT гена BRCA2 с частотой 1,2 - 16,4% выявлена при РМЖ и РЯ у афро-американок и евреек-Ашкенази, проживающих в США, Израиле, Канаде [Struewing et al., 1997; Neuhausen et al., 1998; Georgiou et al., 2003; Lavie et al., 2010]. У славянок с ЗНО женских репродуктивных органов частота этой мутации не превышает 1% [Diez et al., 1999; Zakhartseva et al., 2009; Silin et al., 2009; Ходорович, 2009; Порханова, 2009; Поспехова, 2011; Фарахтдинова, 2012].

В результате проведенного мета-анализа нами не определены общие мутации генов BRCA1/2, которые при скрининговых исследованиях могут быть использованы как унифицированные маркеры ЗНО молочной железы, яичников, тела и шейки матки, поэтому на следующем этапе работы представлялось целесообразным провести сравнительный анализ частот наиболее известных мутаций BRCA1/2 в некоторых этнических группах и регионах мира.

Евреи Ашкенази. Распространенность мутации BRCA1/2 в популяциях евреев по данным G. J.Mann et al. (2006) составляет около 0,2%, однако у евреекАшкенази 29 - 41% случаев рака молочной железы и яичников связано с наследованием одной из трех founder mutations в генах BRCA1/2 (185delAG, 5382insC - BRCA1 и 6174delT - BRCA2), однако и у других народов около 10% ЗНО женских репродуктивных органов обусловлено этими же мутациями.

Делеция 185delAG, встречающаяся у 1% евреев, вносит значительный вклад (16при ранних (до 50 лет) случаях РМЖ [Robles-Daz et al., 2004]. Мутации 5382insC в гене BRCA1 и 6174delT в гене BRCA2 обнаружены соответственно у 0,13% и 1,52% Ашкенази [Roa et al., 1996]. Наиболее распространенная в популяции евреев-Ашкенази делеция во втором экзоне гена BRCA1 185delAG возникла, по мнению S. L. Neuhausen et al. (1996), примерно в 1235 г. нашей эры.

Европа. В странах Восточной Европы распространена мутация гена BRCA1 в 20 экзоне – 5382insC, частота которой колеблется от 5,4 до 8,9% у жительниц Белоруссии и Украины [Zakhartseva et al., 2009; Silin et al., 2009; Uglanitsa et al., 2010]. Для северных регионов Европы характерно наличие других мутацийоснователей гена BRCA1: в Норвегии - 3347delAG, 1135insA, 1675insA, Финляндии - 3604delA, Дании - 2594delC, в Германии у больных наследственным РМЖ в возрасте до 41 года частота мутации 5382insC гена BRCA1 составляет 1,1% [Vehmanen et al., 1997; Sarantaus et al., 2001; Bergthorsson et al., 2001; Bjorge et al., 2004].

В странах Центральной и Южной Европы спектр мутаций гена BRCA1 при ЗНО женских репродуктивных органов значительно шире [Osorio et al., 2002;

Pohlreich et al., 2005; Capalbo et al., 2006; Koumpis et al., 2011; Blay et al., 2013]. У женщин Западной Польши в 3% случаев семейного РМЖ и РЯ выявлена мутация гена BRCA1, а для Словении характерна миссенс-мутация 1806СТ, которая с меньшей частотой обнаружена у жительниц Чехии [Pohlreich et al., 2005; Krajc et al., 2008]. В России наиболее распространенной мутацией гена BRCA1 является 5382insC, обнаруженная в 9% случаев раннего (до 40 лет) развития РМЖ, на долю которой приходится около 90% всех мутаций гена BRCA1, типированного для Центрального и Сибирского регионов России [Карпухин и др., 2002; Grudinina et al., 2005; Krylova et al., 2006].

Носительство 5382insC среди разных народов Европейских государств (Польши, Германии, Бельгии, Чехии, Румынии, Латвии, Белоруссии) как у евреевАшкенази, по мнению некоторых исследователей, объясняется ее независимым происхождением. Е.Н. Имянитов (2010) предполагает вероятность славянского происхождения мутации BRCA1 5382insC, а обнаружение данного варианта у евреев-Ашкенази в Восточной Европе является следствием длительного сосуществования славян и евреев на территории Прибалтики и некоторых государств (Приложение В).

Страны Азии и Африканского континента характеризуются минорными мутациями, не встречающимися в других географических зонах (Приложение Г).

В китайской и корейской популяциях среди пациенток РМЖ распространенность мутаций гена BRCA1/2 не превышает 1,1% [Khoo et al., 2002; Kwong et al., 2012;

Son et al., 2012; Kang et al., 2013]. Согласно исследованиям N.M. Suter et al. (2004) и по данным международной базы BIC, мажорная Tyr856His миссенс-мутация, выявляемая в 4,2% у онкологических больных в Китае, характерна также для населения Малайзии (HuGEN, Pubmed).

W. Mahfoudh et al. (2012) рассматривают 916delTT гена BRCA1 как founder mutation при РЯ и РМЖ у жительниц Туниса (частота составляет 12,5%). В Японии, согласно работам K. Sugano et al. (2008), семейные формы ЗНО женских репродуктивных органов ассоциированы с несколькими нонсенс-мутациями гена BRCA1: Leu63Stop, Tyr130Stop, Glu908Stop, Gln934Stop и др. 185delAG гена BRCA1 с частотой 0,4-2,4% встречается в этнических группах Ирана и Вьетнама [Yassaee et al., 2002; Mehdipour et al., 2006; Ginsburg et al., 2010].

Северная и Южная Америка.

На территории Соединенных Штатов Америки носительство мутаций гена BRCA1 напрямую зависит от происхождения популяций (табл. 3).

–  –  –

Для американцев с европейскими корнями характерны мутации, специфичные и для жительниц Европы. У латиноамериканских женщин, имеющих в анамнезе ЗНО женских репродуктивных органов преобладает мутация 5382insC - 8,5% и 185delAG - 1,2% [Loureno et al., 2004; Dufloth et al., 2005;

Esteves et al., 2009].

Австралия. Среди англо-австралийцев распространены делеции 3888delGA и 3415delC гена BRCA1, не характерные для жителей других стран и частей света [Southey et al.,1999].

Таким образом, наиболее распространенные мутации гена BRCA1 185delAG и 5382insC, ассоциированные с риском развития злокачественных новообразований женских репродуктивных органов обнаружены в разных этнических группах населения Америки, Африки, Восточной, Центральной Европы, в том числе и России (Центральный и Сибирский регионы), но распределены в мировых популяциях неравномерно и выявляются с низкими значениями частот даже при наследственных формах РМЖ и РЯ.

1.1.2. SNP промоторных регионов генов цитокинов и их ассоциация с неоплазиями женских репродуктивных органов Среди многочисленных факторов, вызывающих злокачественную трансформацию клеток, особая роль отводится эндогенным биорегуляторам и, в частности, медиаторам иммунной системы про- и противовоспалительным цитокинам, вовлеченным в системный воспалительный процесс [Smyth et al., 2004]. В многочисленных работах исследовано участие в канцерогенезе преимущественно провоспалительных цитокинов. Иммунопатогенетическая роль противовоспалительных цитокинов изучена в меньшей степени [Forones et al., 2001; Mocellin et al., 2004; Lyon et al., 2008; Hamidullah et al., 2012; Тугуз, 2002;

Антонеева и др., 2014].

Полиморфизмы генов цитокинов являются результатом единичных нуклеотидных замен в некодирующих областях генов и при этом могут влиять на продукцию медиаторов, что опосредовано изменением функциональных сайтов, контролирующих транскрипцию, созревание и транспортировку соответствующих мРНК. Таким образом, формируется механизм, связывающий генетические варианты цитокинов с их экспрессией в норме и при патологии.

Изучение влияния аллельных вариантов генов цитокинов на уровень продукции медиаторов раскрывает механизмы основных путей формирования полиморфности системы цитокинов [Hodges et al., 1994; Bidwell et al., 1999;

Haukim et al., 2002].

Полиморфизмы генов IL-17А (G197А) и IL-17F (His161Arg, A7488G) Интерлейкин 17А (IL-17А) из семейства IL-17 (IL-17A, IL-17B, C, D, E, F) впервые охарактеризован как цитотоксический T-лимфоцит-ассоциированный антиген-8 с широким спектром биологических эффектов и участвующий в физиологических и патофизиологических воспалительных процессах [Afzali et al., 2007; Iyoda et al., 2010]. Как ключевой медиатор иммунной системы, IL-17А синергичен с основными провоспалительными цитокинами IL-1, TNF-, IL-6, стимулирует продукцию других факторов воспаления: циклооксигеназы-2, хемокинов (IL-8, моноцитарного хемотоксического и макрофагального воспалительного протеинов), активирует нейтрофилы, G-CSF, GM-CSF;

макрофаги, Т-лимфоциты, фибробласты, эндотелиоциты и др. клетки. Кроме этого участвует в гемопоэзе, обладает иммуномодулирующими IL-17А свойствами, однако, в ряде работ отмечена вовлеченность IL-17А в патогенез аутоиммунных, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний посредством тех же механизмов активации клеточной адгезии, стимулирования пролиферации эндотелиоцитов, мезенхимальных стволовых и опухолевых клеток in vitro [Numasaki et al., 2003; Paunovic et al., 2008; Zhu X. et al., 2008; Martin-Orozco et al., 2009; Chen S. et al., 2010; Chen J. et al., 2011].

Роль IL-17А в развитии системных заболеваний обусловлена SNP гена медиатора в экзонах, интронах и в промоторных участках, регулирующих интенсивность экспрессии и, соответственно, биологические эффекты IL-17А, ген которого локализован в 6 хромосоме (рис. 3): 6p12.2 (www.genecards.org).

Рис.3 Локализация гена IL-17А в 6-ой хромосоме, стрелкой указано месторасположение гена (по данным GeneCards®) Ген IL-17А состоит из трех экзонов (с 5'UTR и 3'UTR нетранслируемыми и кодирующими областями) и двух интронов (рис.4) Рис.4 Схема строения гена IL-17А (по данным Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology) В гене IL-17А человека идентифицировано 74 SNP, 10 из которых наиболее изучены: 112GA и 175TC в 5 некодирурующем регионе, 1230GA во 2 экзоне;

rs8193037 (121GA), rs2275913 (197GA), rs3819024 (444AG), rs9791323 расположены в 5 (525AC), rs8193036 (737CT), rs4711998 (877AG) кодирующем регионе; rs3819025 (45GA) – в первом интроне. Из шести SNP гена ассоциированных с заболеваниями (ревматизмом, ревматоидным IL-17А, артритом, бронхиальной астмой, аллергическими заболеваниями, множественным склерозом, злокачественными новообразованиями желудка, молочной железы и др., в мировых популяций исследованы преимущественно G197A (rs2275913) или 197GA [Shibata et al., 2009; Wu et al., 2010; Zhang et al., 2011; Кутихин и др., 2012; Wang L. et al., 2012]. Установлена ассоциация гомозиготного A197A генотипа (OR=3.02; 95%CI, 1.86-4.91; p0.0001) и 197A аллеля (OR=1.42; 95%CI, 1.09-1.85; p=0.010) гена IL-17A у больных раком желудка интестинального типа [Shibata et al., 2009].

IL-17F. Четыре из 157 SNP IL-17F: 482AG (A7488G, His161Arg; rs763780), 34-361GT (rs7771466), 377AG (rs2397084), 368CG (rs612242) типированы при бронхиальной астме, колитах, кардио-васкулярных заболеваниях, раке желудка и молочной железы, артритах и рассеянном склерозе [Shibata et al., 2009; Wu et al., 2010; Paradowska-Gorycka et al., 2010; Wang L. et al., 2012; Qian et al., 2012].

Аллельные варианты генов IL-17А и IL-17F, вовлеченные в патогенез многих системных заболеваний, в ряде работ рассматриваются совместно [Wu et al., 2010; Paradowska-Gorycka et al., 2010; Quan et al., 2012]. Из 8 SNP гена IL-17А и IL-17F у жительниц Китая по данным Wang L. et al. (2012), со злокачественными новообразованиями молочной железы достоверно (р=0,0029) ассоциирована 197A аллель гена IL-17А. Частоты G/A аллелей IL-17A в группах доноров и больных с РМЖ составили соответственно 0,640:0,360 и 0,574:0,426.

Аналогичные результаты получены Quan Y. et al. (2012) при раке шейки матки (р=0,008). Значимых различий для полиморфизмов His161Arg гена IL-17F не представлено.

В России у онкологических больных Кемеровской области со злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта исследованы G197/197A полиморфизмы IL-17А (rs2275913). Частоты G197/197A аллелей у доноров и больных, по данным А.Д. Еникеевой с соавторами (2012 г.) достоверно не различались (соответственно 0,620/0,380, и 0,623/0,377, 2=0,01; р=0,91).

Ассоциации G197/197A полиморфизмов IL-17А и His161/161Arg аллелей IL-17F с другими локализациями новообразований в РФ не исследованы (HuGEN, Pubmed).

SNP гена IL-10 (1082G/A, 819C/T, 592C/A) Основной противовоспалительный – плейотропный цитокин, IL-10 ключевой регулятор иммунного ответа, который вырабатывается Th2-клетками, моноцитами, цитотоксическими Т-клетками, продуцируется не только разными популяциями иммунокомпетентных клеток, но и опухолевыми тканями. IL-10 способен ингибировать синтез других цитокинов, подавлять экспрессию молекул MHC II класса, пролиферацию Т-клеток, развитие гиперчувствительности замедленного типа, проявляет опухоль-стимулирующие и опухоль-ингибирующие свойства. Различные опухолевые линии способны продуцировать IL-10, подавляющий Т-клеточный иммунный ответ, активность Т-лимфоцитов, снижение экспрессии антигенов MHC I класса [Turner et al., 1997; Rao et al., 2006;

Alvero et al., 2012; Dobrzanski et al., 2012; Симбирцев, 2004; Кетлинский и др., 2008].

Mocellin et al. (2004) объясняют противоположные эффекты IL-10 полиморфизмами гена, регулирующими уровень его продукции (гипо- или оверэкспрессия) или структурные изменения соответствующих белковых продуктов с различной активностью. Однонуклеотидные замены в геномной ДНК

– SNP в специфических генах-кандидатах влияют на экспрессию и активность кодируемых белков и приводят к развитию новообразований, в том числе рака молочной железы [Jong et al., 2002]. По данным Turner et al. (1997) и Gibson et al.

(2001) SNP в промоторной области гена IL-10 воздействуют на экспрессию гена и, следовательно, играют определенную роль в патогенезе и клиническом течении рака молочной железы.

Ген IL-10 локализован на 1-ой хромосоме 1q31-1q32 (рис. 5) и состоит из пяти экзонов и четырех интронов (www.genecards.org). Сообщается, что несколько важных полиморфных сайтов в гене IL-10, в том числе три в области промотора (1082G/A, 819C/T, 592C/A) могут влиять на транскрипцию мРНК и экспрессию IL-10 in vitro [Eskdale et al., 1997].

Рис.5 Локализация гена IL-10 в 1-ой хромосоме, стрелкой указано месторасположение гена (по данным GeneCards®) В международных базах данных за последние пять лет в 155 работах отмечена ассоциация основных полиморфизмов промоторного региона гена IL-10 (1082G/A, 819C/T, 592C/A) с развитием злокачественных новообразований, в 8 из них – с РМЖ и РШМ (HuGEN, Pubmed). В некоторых исследованиях показано участие IL-10 в патогенезе, прогнозе течения рака молочной железы и шейки матки, однако еще не идентифицированы определенные полиморфизмы IL-10 как маркеры, ассоциированные у разных народов с новообразованиями женских репродуктивных органов [Langsenlehner et al., 2005; Howell et al., 2007; Gerger et al., 2010]. В таблице 4 обобщены данные (статистически не всегда значимые) по распределению и возможной ассоциации трех полиморфизмов гена IL-10 со ЗНО органов женской репродуктивной системы у разных народов. В России исследования по ассоциации полиморфизмов гена IL-10 с неоплазиями женских репродуктивных органов единичны.

–  –  –

Из всех аллельных вариантов IL-10, наиболее изучена роль 1082G/A SNP в патогенезе РМЖ и РШМ у азиатских народов. Так, у японских женщин с РШМ повышенная частота G1082 аллели достоверно (р=0,001) отличалась от группы контроля [Matsumoto et al., 2010]. Для здоровых и больных РМЖ жительниц Китая значимых различий не найдено [Wang Q. et al., 2011], но по данным Kong F.

высокие частоты 1082AA генотипа и ATA гаплотипа et al. (2010), (1082A/819T/592A) сопряжены с вовлеченностью в опухолевый процесс лимфатических узлов (соответственно p=0,041 и р=0,022) и увеличением размера опухоли (соответственно р=0,039 и р=0,028).

Abdolrahim-Zadeh H. et al. (2005) отмечают, что у иранских женщин полиморфизмы промоторного регионы гена IL-10 не могут рассматриваться как факторы риска развития РМЖ, однако достоверные различия найдены для 1082АА генотипа и ACC/ATA гаплотипа у больных РМЖ с положительным прогестерон-рецепторным статусом (соответственно р=0,03 и р=0,02).

1082G/A и 592C/A полиморфные варианты гена IL-10, исследованные в европейских популяциях Италии, Австрии и России, достоверно различаются у здоровых женщин и больных с РМЖ, что позволяет учитывать их возможную роль в канцерогенезе [Giordani et al., 2003; Langsenlehner et al., 2005; Gerger et al., 2010]. Благодатских А.Е. и др. (2011) рассматривают носительство 592АА генотипа как фактор повышенного риска возникновения РМЖ, ассоциированного с низкой экспрессией прогестероновых рецепторов, у 592СС гомозигот отмечена высокая вероятность лимфогенного метастазирования.

Таким образом, положительные ассоциации между частотами аллелей, генотипов или гаплотипов промоторного региона гена и IL-10 предрасположенностью к злокачественным новообразованиям женских репродуктивных органов, приведенные в 8 из 18 исследований (табл.4), весьма противоречивы. Одни и те же полиморфные варианты у разных народов могут играть как протективную, так и негативную роль в канцерогенезе.

Роль IL-2 и полиморфизмов гена IL-2 в канцерогенезе.

– основной провоспалительный цитокин, стимулирующий IL-2 пролиферацию и дифференцировку активированных Т-лимфоцитов в эффекторные Th-лимфоциты или цитотоксические Т-клетки, обнаружен в 1976 году в культуральной жидкости лимфоцитов, стимулированных митогенами, назван Т-клеточным ростовым фактором. IL-2 продуцируется преимущественно активированными Т-лимфоцитами, является фактором роста и активации естественных киллеров, В- и Т-лимфоцитов, стимулирует синтез и секрецию других лимфокинов: IL-4, IL-6, IFN, CSFs, TNFs. Противоопухолевый эффект ILреализуется путем повышения цитотоксичности Т-лимфоцитов, лимфокинактивированных и естественных киллеров [Morgan et al., 1976; Rosenberg, 2001;

Oppenheim, 2007; Бережная и др., 2000; Молчанов и др., 2001; Голвизин, 2001].

Мишенью действия IL-2 являются клетки, имеющие на поверхности мембраны специфический высокоаффинный рецептор (IL-2R). Взаимодействие IL-2 с IL-2R приводит к пролиферации Тh, которые затем воздействуют на дифференцировку и пролиферацию цитотоксических Т-клеток, NK-клеток, лимфокин-активированных киллеров, В-лимфоцитов и макрофагов, что обуславливает дальнейшее развитие иммунного ответа [Waldmann, 1993; Wei et al., 2010; Malek et al., 2010; Ярилин, 1997; Кетлинский и др., 2008].

Роль IL-2 в канцерогенезе связана с полиморфизмами гена в виде точечных мутаций – SNP в промоторных регионах, регулирующих интенсивность экспрессии и биологические эффекты медиатора [Wu et al., 2009; Sugimoto et al., 2010; Motoyama et al., 2011; Song et al., 2012]. IL-2 человека кодируется одним геном, локализованном в 4 хромосоме 4q27, включающим 6684 пар нуклеотидов и состоящим из 4-х экзонов и 3-х интронов (рис. 6).

Рис. 6 Локализация гена IL-2 в 4-ой хромосоме; стрелкой указано месторасположение гена (по данным GeneCards®) В мировых базах данных (HuGEN, Pubmed) исследована роль 10 полиморфных вариантов промоторного региона гена IL-2 в патогенезе бронхиальной астмы, рассеянного склероза, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сахарного диабета [Matesanz et al., 2001; Fedetz et al., 2002; ScarelCaminaga et al., 2002; Amirzargar et al., 2007; Movahedi et al., 2008; Shahbazi et al., 2010; Sayad et al., 2013; Ding et al., 2013]. При ЗНО пищевода, желудка, легких, предстательной железы, мочевого пузыря, носоглотки, неходжкинской лимфоме изучена роль пяти SNP: 114Т/G, 330Т/G, 384G/T, 475А/Т, 631G/А [Shin et al., 2008; Wu et al., 2009; Sugimoto et al., 2010; Tindall et al., 2010; Wei et al., 2010;

Motoyama et al., 2011; Song et al., 2012; Shen et al., 2012].

Данные по распределению частот rs2069762 (T330G) гена IL-2 при ЗНО женских репродуктивных органов немногочисленны (HuGEN, Pubmed). Hu X.B. et (2013) отмечают ассоциацию гетерозиготного (р=0,0021) и al. T330G гомозиготного G330G генотипов (р0,0001) IL-2 с РМЖ у китайских женщин.

Исследована роль и других SNP гена IL-2 по 114, 384, 475 и 631 сайтам промоторного региона в патогенезе РМЖ. В работе Силкова А.Н. (2013) выявлен повышенный уровень (р=0,022) гетерозиготного генотипа G114T у больных РМЖ по сравнению с донорами. Горева Е.П. с соавт. (2010) не выявили ассоциации 631G/A и 475A/T полиморфных вариантов гена IL-2 с РМЖ, Erdei E. et al. (2010) отмечают неэффективность использования 384G/T SNP гена IL-2 в качестве маркера РМЖ.

Ассоциация SNP гена IL-4 с неоплазиями IL-4 - фактор дифференцировки Т- и В-клеток, продуцируется Tх2 и относится к группе гемопоэтинов, содержащий 129 аминокислотных остатков.

Наиболее сильный эффект IL-4 оказывает на регуляцию образования других цитокинов посредством участия в иммунном ответе и воспалительных реакциях.

IL-4 ограничивает синтез макрофагами провоспалительных IL-1, -6, -8, -12, TNFобразование высокоактивных метаболитов кислорода, азота, служит кофактором пролиферации покоящихся В-лимфоцитов, индуцирует в этих клетках синтез IgE и IgG. IL-4 способен генерировать активность лимфокинактивированных киллеров и усиливать противоопухолевую активность макрофагов. Механизм противоопухолевого эффекта IL-4 связан с блокированием клеточного цикла и повышением экспрессии молекул МНС I и II классов [Paul, 1991; Callard, 1991; Ярилин, 1997; Витковский и др., 2001; Симбирцев, 2004].

В ряде работ представлены весьма противоречивые сведения о роли IL-4 при некоторых злокачественных новообразованиях. Показано, что IL-4 обладает антипролиферативным эффектом, ингибирует опухолевый рост посредством активации макрофагов и индукции апоптоза, является активным стимулятором функций различных цитотоксических клеток, которые экспрессируют рецепторы к самому медиатору [Hoon et al., 1993; Hillman et al., 1994; Gooch et al., 1998;

Nagai et al., 2000]. Участие IL-4 в канцерогенезе может быть обусловлено SNP промоторных регионов гена цитокина, локализованного в 5 хромосоме 5q31.1 (рис.7).

Рис. 7 Локализация гена IL-4 в 5-ой хромосоме; стрелкой указано месторасположение гена (по данным GeneCards®) Полиморфизмы промоторного региона гена IL-4 исследованы в мировых популяциях в основном при бронхиальной астме и ревматоидном артрите [Moreno et al., 2007; Yang et al., 2011; Daneshmandi et al., 2012; Zhu N. et al., 2013; Inanir et al., 2013; Liang et al., 2014]. В европейских, американских и азиатских популяциях подтверждена ассоциация 8 SNP гена IL-4 с риском развития рака легких, желудка, кишечника, предстательной железы, почек и мочевого пузыря [El-Omar et al., 2003; Yannopoulos et al., 2007; Zhu J. et al., 2010; Kwon et al., 2011; Gomes et al., 2012; Li et al., 2012; Chu et al., 2012]. Полиморфизмы промоторного региона гена IL-4, связанные с неоплазиями женских репродуктивных органов, обсуждаются в немногочисленных работах. Так, Joshi N. et al. (2013) отмечают протективную роль 589Т аллеля гена IL-4 для жительниц Индии с РМЖ. Konwar R. et al. (2009) не установили достоверного (р=0,095) повышения частот C589T полиморфных вариантов гена IL-4 у больных РМЖ (Индия). Erdei E. et al., 2010 (США) определили значимые (р0,05) различия для частот 1098G/T генотипов ILу больных РМЖ по сравнению с донорами.

Полиморфизмы гена IL-12

– основной провоспалительный, плейотропный цитокин, IL-12 синтезируемый стимулированными макрофагами, В-клетками и другими АПК, которые модулируют адаптивный иммунный ответ, преимущественно стимулируя продукцию Кроме стимуляции Th1 и способности повышать Th1.

цитолитическую активность, опосредует физиологические реакции, IL-12 действуя в качестве сильного индуктора синтеза IFN и других цитокинов T- и NK-клетками периферической крови, генерируя противоопухолевый клеточный иммунитет [Gubler et al., 1991; Bright et al., 1999; Portielje et al., 2003; Ferlazzo et al., 2004; Paunovic et al., 2008; Rao et al., 2008; Ярилин, 1997; Витковский и др., 2001; Симбирцев, 2004].

Известно около 40 SNP гена IL-12В в промоторном регионе, интронах, экзонах, 3'UTR- и 5'UTR-регионах, влияющих на экспрессию медиатора при различных патологиях [Litjens et al., 2004; Wang J. et al., 2010; Morris et al., 2011;

Boca et al., 2013]. Ген IL12B картирован в 3 хромосоме 3q25.33 (рис. 8) Рис. 8 Локализация гена IL-12В в 3-ей хромосоме; стрелкой указано месторасположение гена (по данным GeneCards®) В базах данных (HuGEN, Pubmed) представлены работы по исследованию 12 SNP гена IL-12В, отражающие участие полиморфных вариантов гена медиатора в патогенезе псориаза, бронхиальной астмы, болезни Крона, туберкулеза, рассеянного склероза [Morahan et al., 2002; Randolph et al., 2004;

–  –  –

Достоверные различия по частотам A1188C аллельных вариантов IL-12В получены для жителей Европы, Китая, Индии и Южной Кореи. Roszak A. et al.

(2012), Chen X. et al. (2009), Tamandani D. et al. (2009), Han S.S. et al. (2008) отмечают ассоциированность «мутантного» 1188С аллеля и гетерозиготного A1188C генотипа гена IL-12В с РШМ. Повышение частот нормальной А1188 аллели и гомозиготного А1188А генотипа гена IL-12В у больных РМЖ по сравнению с донорами установлено для жительниц Норвегии Kaarvatn M.H. et al.

(2012). Немногочисленные исследования SNP гена IL-12В в патогенезе ЗНО женских репродуктивных органов предполагают проведение частотного анализа распределения для выявления ассоциации полиморфных вариантов промоторного региона гена IL-12В с онкопатологией для разных этнических групп.

1.2. Сывороточные уровни, спонтанная и стимулированная продукция цитокинов in vitro PBMC больных и доноров Пролиферативная активность основного провоспалительного IL-17А.

цитокина, вовлеченного в патогенез онкологических заболеваний определяет направление исследования сывороточных концентраций уровней IL-17А, спонтанной и стимулированной ФГА продукции медиатора in vitro в культуре PBMC больных со ЗНО женских репродуктивных органов [Zhu X. et al., 2008;

Martin-Orozco et al., 2009; Chen S. et al., 2010].

Концентрации IL-17А в нативных сыворотках, среде инкубации интактных и стимулированных in vitro PBMC доноров и больных с неоплазиями проанализированы в немногочисленных работах. Lyon D. et al., 2008 не выявили достоверных различий между уровнями IL-17 в сыворотках больных РМЖ и доноров (Канада). Souza J. et al., 2013 отмечают, что РШМ ассоциирован с достоверным повышением уровня IL-17 в сыворотке больных по сравнению с донорами.

Способность PBMC продуцировать IL-17A и отвечать in vitro на стимулирующее влияние ФГА исследованы в единичных работах (HuGEN, Pubmed). Селихова Ю.Б., 2008 отмечает, что у больных РМЖ на этапе завершения радиотерапии и хирургического лечения наблюдается возрастание индуцированной ЛПС и ФГА продукции IL-17 PBMC, связанное с изменениями цитокин-продуцирующей функции клеток.

Противоречивый характер немногочисленные работ, отсутствие данных по влиянию SNP гена IL-17A на уровни медиатора в сыворотках, спонтанную и стимулированную продукцию предполагает проведение in vitro PBMC исследований концентраций IL-17А между донорами и больными с неоплазиями женских репродуктивных органов.

IL-10. Плейотропный IL-10 – иммуносупрессивный цитокин, исторически определяемый как противовоспалительный, подавляет пролиферацию и активность Т-клеток, продукцию синтеза ряда цитокинов, развитие гиперчувствительности замедленного типа, снижает активность макрофагов и моноцитов, стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов, тимоцитов и синтез IgM и IgA. Показано, что опухолевые клетки способны продуцировать повышенные концентрации IL-10, оказывая негативное влияние на онкологических больных с подавлением Т-клеточного иммунного ответа, стимуляции опухолевого роста [Turner et al., 1997; Bidwell et al., 1999; Hamidullah et al., 2012; Бережная, 2009].

Несмотря на многочисленные работы в области изучения уровней цитокинов, многие вопросы комплексного анализа цитокинов при онкологических заболеваниях, в частности, при РМЖ, РЯ, РШМ, РТМ требуют дальнейшего изучения.

Статистически значимое повышение концентрации IL-10 в сыворотках больных РМЖ по сравнению с донорами отмечено для жительниц Европы, Азии и Канады [Kozowski et al., 2003; Lyon et al., 2008; Althwani et al., 2011; Злобнова, 2013; Алимходжаева, 2009]. Данные Садвакасовой Г.С. (2010) по сывороточным концентрациям IL-10 у больных РМЖ и здоровых жительниц Казахстана отличаются от цитируемых источников: при аденокарциноме молочной железы IIIа стадии сывороточные уровни IL-10 достоверно превышают аналогичные показатели доноров. Антонеева И.И. с соавт. (2014) проанализировали концентрации противовоспалительного IL-10 в сыворотке больных РЯ: отмечено, что уровень цитокина достоверно повышался по сравнению с донорами в зависимости от стадии заболевания и проведения химиотерапии. В исследованиях для жительниц Индии, Кореи, Великобритании, России значимых различий по уровням IL-10 в сыворотках доноров и больных с неоплазиями женских репродуктивных органов не найдено [Roh J. et al., 2002; Rao V. et al., 2008; Pooja S. et al., 2012; Тугуз А.Р. и др., 2003].

Продукция IL-10 in vitro PBMC больных с неоплазиями женских репродуктивных органов в мировых базах данных представлена единичными работами. Merendino R.A. et al. (1999) отмечают повышение уровня продукции ILинтактными PBMC больных РМЖ по сравнению с донорами. Я.В. Кухарев (г.

Томск, 2010), сравнивая функциональные возможности PBMC больных РМЖ до и после химиотерапии, отмечает, что высокая эффективность неоадъювантной химиотерапии прямо коррелирует с уровнем повышенной секреции противовоспалительного IL-10: спонтанная и стимулированная in vitro продукция IL-10 PBMC до лечения у больных с полной регрессией достоверно выше в сравнении с прогрессирующими формами.

В опубликованных работах обсуждаемые сывороточные концентрации медиатора не превышают физиологических значений, продукция IL-10 PBMC онкологических больных изучена недостаточно, исследования по влиянию полиморфных вариантов гена IL-10 на уровни медиатора не проводились, поэтому необходимо провести анализ концентраций IL-10 в сыворотке, интактных и стимулированных PBMC в регионах между донорами и больными со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов.

IL-2. Концентрация IL-2 в сыворотке у доноров и онкологических больных исследована в немногочисленных работах для некоторых мировых популяций.

Forones N. et al., 2001 (Бразилия) отмечают достоверные (р=0,002) повышения сывороточных уровней IL-2 у больных аденокарциномой желудка III-IV стадии по сравнению с донорами. Тугуз А.Р. (2002, Россия) выявлены статистически значимые различия (р0,05) концентраций IL-2 в сыворотках у больных ЗНО разных локализаций. Lyon D. et al., 2008 (Канада) и Erdei E. et al., 2010 (США) отмечают достоверные повышения IL-2 в сыворотках больных РМЖ по сравнению с донорами. В диссертационной работе Садвакасовой Г.С., 2010 (Казахстан) выявлены достоверные различия (р0,05) по сывороточным уровням IL-2 между больными РМЖ IIIа клинической стадии и контрольной группой.

В электронных базах данных (HuGEN, Pubmed) представлены весьма пртиворечивыерезультаты по продукции IL-2 в культуральной среде интактных и стимулированных in vitro PBMC при онкопатологии. Тугуз А.Р. (2002) отмечает снижение продукции IL-2 в группе онкологических больных различных локализаций, что обусловлено блокированием экспрессии мРНК медиатора.

Влияние SNP гена IL-2 на сывороточные уровни, спонтанную и стимулированную in vitro продукцию PBMC в мировых базах данных практически не отражены поэтому представляется (HuGEN, Pubmed), целесообразным провести анализ уровней IL-2 в нативных сыворотках, культуральной среде интактных, стимулированных in vitro PBMC у доноров и больных с неоплазиями в разных этнических группах.

IL-4. Сывороточные уровни IL-4, спонтанная и стимулированная in vitro продукции медиатора у доноров и онкологических больных в мире практически не исследованы. Lyon D. et al. (2008) установили достоверное повышение уровня IL-4 в сыворотке больных РМЖ по сравнению с донорами. Алимходжаева Л.Т.

(2009) отмечает функциональную активность противовоспалительного IL-4 у больных РМЖ. Достоверное повышение концентрации IL-4 в сыворотках доноров по сравнению с больными ЗНО разных локализаций показано в диссертационном исследовании Тугуз А.Р. (2002).

В работах Gooch J. et al. (1998) и Leland P. et al. (2000) отражена роль только в культуре клеточных линий, но не продукция самого IL-4R противовоспалительного медиатора Кухарев Я.В. (2010), исследуя IL-4.

функциональные возможности PBMC больных РМЖ до и после химиотерапии, отмечает, что недостаточная эффективность неоадъювантной химиотерапии сопряжена с низкой спонтанной секрецией IL-4 и высоким относительным и абсолютным содержанием CD16+-клеток в периферической крови.

Влияние C589T (rs2243250) полиморфизмов гена IL-4 на сывороточные уровни медиатора, спонтанную и стимулированную in vitro продукцию PBMC при злокачественных новообразованиях женских репродуктивных органов в мире не исследованы и не отражены в базах данных Резюме. Актуальность исследования цитокинов в патогенезе злокачественных новообразований обусловлена их ролью в регуляции клеточных эффектов, однако системная циркуляция цитокинов в ряде случаев выходит за пределы медиаторных функций и запускает патологические реакции [Ковальчук Л.В. и др., 2001]. Среди возможных причин нарушения цитокиновой регуляции выделяют мутации и полиорфные варианты генов, ассоциированные с социально значимыми онкологическими и другими заболеваниями.

–  –  –

2.1. Реактивы, тест-системы и материалы Реактивы и среды для выделения и культивирования PBMC Фиколл (плотность 1,077 г/см3), «ПанЭко», г. Москва Гентамицин (10 мг/мл, 10 мл 1000х раствора), «ПанЭко», г. Москва HEPES (Na-соль, 1М раствор, pH 7,2-7,4), «ПанЭко», г. Москва L-глютамин («ПанЭко», г. Москва) Фитогемагглютинин («ПанЭко», г. Москва) Эмбриональная сыворотка телят (FS) («HyClone», Россия) Среда 199 с солями Хенкса и глутамином («ПанЭко», г. Москва) Среда RPMI-1640 («ПанЭко», г. Москва) Тест-системы для определения уровня цитокинов Концентрации цитокинов IL-2, IL-4, IL-10, IL-17А определены ИФАметодом с использованием коммерческих тест-систем OOO “Цитокин” (г. СанктПетербург).

Тест-системы для выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови «ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь», НПФ «ЛИТЕХ», г. Москва «ПРОБА–ГС», ООО «НПО ДНК-Технология», г. Москва Тест-системы для SNP-типирования полиморфизмов генов цитокинов Комплекты реагентов для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией результатов (НПФ «Литех», Россия);

Тест-системы для типирования мутаций генов BRCA1/2 Комплекты реагентов для постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (РCR-Real Time) - ООО «ДНК-технология», Россия В работе использованы праймеры, синтезированные НПФ «Литех» и ООО «ДНК-технология», Россия (табл. 6).

Таблица 6. Список праймеров, использованных в эксперименте

–  –  –

2.2 Экспериментальные методы 2.2.1 Молекулярно-генетические методы.

Выделение ДНК. Образцы геномной ДНК обследованных лиц выделены из лейкоцитов цельной крови, стабилизированной ЭДТА в вакуумных пробирках «VACCUETTE» (Австрия) с помощью реагентов «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех», Россия) и «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» (ООО «ДНК-Технология», Россия).

Выделение ДНК по методу НПФ «Литех», Россия. 1000 мкл цельной крови отобраны в пластиковые пробирки на 1,5 мл («Эппендорф» с замком «PCR®TUBES», Axygen, США) отцентрифугированы в режиме 3000 об/мин при комнатной температуре (+18...+25°С) в течение 5 мин для разделения крови.

После удаления плазмы, замороженные при -20°С 1 час форменные элементы разморожены при комнатной температуре. смешаны с равным объемом реактива «ДНК-экспресс-кровь», тщательно перемешаны (10 сек) на вортексе и на 15 минут помещены в предварительно прогретый до 98°С термостат. Затем пробирки охлаждены до 70°С, отцентрифугированы при 8000-14000 об/мин в течение 15 сек (+18...+25°С). Полученный супернатан отобран в пластиковые пробирки и использован в качестве исследуемого образца ДНК с режимом хранениния -30°С до 6 месяцев.

Вылеление ДНК с использованием наборов «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» ООО «ДНК-Технология», Россия. Смешивали в отдельной пробирке: 150х(N+1) мкл лизирующего раствора, 20х(N+1) предварительно ресуспендированного сорбента, (где N – количество анализируемых образцов с учётом отрицательного контроля).

Вносили по 170 мкл полученной смеси в промаркированные пробирки и добавляли 100 мкл периферической крови, перемешанной на вортексе и термостатировали при 50°С в течение 10 мин. Затем пробирки центрифугировали в микроцентрифуге СМ-50 ПЦР («Elmi», Латвия) при 13000 об/мин 1 мин, удаляли надосадочную жидкость и добавляли к осадку 400 мкл промывочного раствора №1, 200 мкл – №2, 200 мкл – №3, встряхивали на вортексе, центрифугировали при 13000 об/мин в течение 1 мин. удаляли надосадочную жидкость, 5 мин термостатировали при 50°С, добавляли 300 мкл элюирующего раствора, повторно термостатировали и центрифугировали при тех же условиях.

Аликвоты надосадочной жидкости, содержащей геномную ДНК использовали при SNP-типировании или хранили в замороженном состоянии при -30°С в течение года.

Анализ качества образцов геномной ДНК. Чистота образцов ДНК тестирована на спектрофотометре «NanoDrop 2000c» (Termo Scientific, США), основанном на измерении оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения: 280 и 260 нм. Соотношение оптических плотностей, полученных при 280/260 нм превышало 1.8, что соответствует высокой чистоте образцов ДНК [В.А. Голенченко, 2003].

ПЦР с электрофоретической детекцией (ПЦР-ЭФ).

Амплификация ПЦР. В соответствии с инструкциями фирмы исготовителя амплификация проб и отрицательного контроля проводен в пластиковых пробирках на 200 мкл с плоскими крышками PCR®TUBES (Axygen, США). Для

–  –  –

Электрофорез в агарозном геле. Детекция продуктов амплификации проведена методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле с 1% бромистым этидием (НПФ «Литех», Россия) в электрофоретической камере (SUB

– CELL GT «Bio-Rad», США) при напряженности электрического поля 10-15 В/См, после внесения в лунки агарозного геля амплификата (15-20 мкл) в последовательности, соответствующей нумерации проб. Контроль над электрофоретическим разделением осуществлен визуально по движению полосы красителя от старта на 1,5-2 см (время разгонки 30±2 мин.).

Визуализация и интерпретация результатов электрофореза. Результаты исследований визуализированы при УФ-облучении (длина волны 310 нм) в трансиллюминаторе (Gel Doc XR, «Bio-Rad», США) с помощью программы США). Наличие сигнала определялось по «Quantity One» («Bio-Rad», интенсивности свечения полос ампликонов (рис.

9):

Рис.9 Иинтерпретация результатов горизонтального электрофореза в агарозном геле:

N – нормальная аллель; Р – патологическая аллель;

1 – контрольный образец;

2,3,5,7– гетерозигота;

4,6,8 – нормальная гомозигота;

9 – мутантная гомозигота.

ПЦР в режиме реального времени. РCR-Real Time проводили в термоциклере ДТ-Lite (ООО «ДНК-Технология», Россия) в объеме 35 мкл реакционной смеси по программе амплификации, представленной в таблице 8.

Состав реакционной смеси: по 0,20 мкМ каждого оригинального праймера; по 200 мкМ нуклеозидтрифосфата; 1,0 единица активности Тaq-полимеразы; буфер для ПЦР (670 мМ трис pH 8,4, 166 мМ сульфата аммония, 20 мМ MgCl2 и 100 мМ меркаптоэтанол); сигнальные зонды с флуоресцентными метками FAM и HEX, минеральное масло в объеме 20 мкл. Детекция и учёт результатов осуществлялись амплификатором автоматически. На графике (рис. 10) отображена зависимость флуоресценции от температуры плавления для каждой пробирки в термоблоке.

Рис. 10 Пример интерпретации результатов ПЦР-РВ (5382insC)

–  –  –

2.2.2 Культуральные работы.

Подготовка сыворотки. После забора в пробирки с Serum Clot Activator «VACCUETTE» (Австрия), образцы венозной крови инкубированы 30 мин в термостате при 37оС. Образовавшиеся сгустки обведены пастеровской пипеткой для отделения от стенки пробирки и помещены для ретракции сгустка в холодильник при 4оС и через 30 мин отцентрифугированы в режиме 3000 об/мин (15 мин). Аликвоты сыворотки отобраны в промаркированные пластиковые пробирки и помещены в морозильную камеру при -70 о С.

Выделение Мононуклеарные клетки периферической крови PBMC.

выделены из стабилизированной гепарином (25ед/мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла («Histopaque», плотность 1.077, «Sigma», США), центрифугированием при 4oС и 400g в течение 30 минут. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собраны пипеткой и трехкратно отмыты средой 199 («ПанЭко», Москва). После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждены центрифугированием при 1000 об/мин и 4oС.

Ресуспендированные в 1 мл среды PBMC разведены рабочей культуральной средой (фосфатным солевым буфером) до концентрации 2-5106 клеток/мл.

Подсчет PBMC проведен в 25 больших квадратах камеры Горяева по формуле:

N = a501000, где: N – общее количество нейтрофилов в 1 мл среды, а – количество нейтрофилов в 25 больших квадратах камеры Горяева Постановка спонтанной и стимулированной продукции цитокинов.

При исследовании продукции цитокинов выделенные PBMC культивированы в концентрации 2-5106 кл/мл в 24-луночных плоскодонных планшетах в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крови телят, 80 мкг/мл гентамицина в течение 18 часов в СО2 – инкубаторе («Sanyo», Япония) при 37°С и 5% СО2 (спонтанная продукция) и в присутствии ФГА (5 мкг/мл, «ПанЭко», Москва) (стимулированная продукция).

ELISA – твердофазный иммуноферментный анализ.

Для определения уровня цитокинов использован твердофазный сэндвичИФА. Антитела к одному из эпитопов сорбированы на твердой фазе, испытуемая проба добавлена к твердой фазе и инкубирована при соответствующих условиях.

После трехкратной отмывки, в лунки добавлены коньюгированные с биотином антитела ко второму эпитопу определяемого антигена – вторые антитела. В тестсистемах для определения IL-2, IL-4, IL-17А, IL-10 в качестве индикаторного фермента использована пероксидаза хрена, конъюгированная со стрептавидином, имеющим сродство к биотину. После инкубации в лунки внесен субстрат с пероксидом водорода (Н2О2) для измерения активности связанного фермента;

реакция остановлена добавлением 1N раствор Н2SO4.

Учет результатов произведен на в 96-плашечном спектрофотометре («BioRad», США) при длине волны 450 нм. Образцы сыворотки протестированы в триплетах, в расчетах использованы вычисленные средние значения оптической плотности.

2.3 Контингент обследованных лиц

В проспективное исследование включено 343 женщин, представленных этническими группами адыгов (n=83), русских (n=242) и других национальностей (n=18), проживающих в Республике Адыгея, (табл. 9-10). Группа онкологических больных сформирована из 172 пациенток (средний возраст 52,8±9,8 лет) Адыгейского республиканского клинического онкологического диспансера (АРКОД) г. Майкопа (2011-2013гг.) с гистологически верифицированными диагнозами злокачественных новообразований женских репродуктивных органов, без учета семейной истории заболевания. Доноры (n=171) 18-72 лет (средний возраст 31,3±13,8 лет) подобраны эмпирически, без клинических проявлений онкопатологии. Исследование проведено с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с ФЗ РФ от 21 ноября 2011 г. № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации».

Таблица 9. Этнический и возрастной состав доноров

–  –  –

Группа онкологических больных распределена с учетом основного заболевания, гистологических вариантов и стадий по системе TNM (TNM.

Classification of malignant tumours) (табл. 11-12).

Таблица 11. Распределение больных по нозологиям и гистологическим вариантам

–  –  –

2.4. Статистическая обработка данных Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью критерия 2 (хи - квадрат). Описательная статистика групп представлена в формате: значения медианы (Ме), 25-го и 75-го квартилей (Ме, 25% 75%). Под частотой генотипа и аллеля понимали долю, отнесенную к общему количеству генотипов (или аллелей) в исследуемой группе. Частоты генотипов, гаплотипов и аллелей генов цитокинов выражали в долях единицы.

Сравнительный статистический анализ частот генотипов, гаплотипов и аллелей генов цитокинов опытной и контрольной групп проведен с использованием U-критерия Манна-Уитни. Достоверность различий концентраций цитокинов в образцах сывороток, культуральной среде мононуклеарных клеток периферической крови доноров и больных определяли с использованием параметрического критерия Стьюдента (t). Различия считались статистически значимыми при р0,05. Расчеты проводили с использованием пакета программ SPSS Statistics 17.0 (Inc., Chicago, USA).

–  –  –

3.1 Мутации генов BRCA1/2 при злокачественных новообразованиях женских репродуктивных органов у жителей РА Функции генов-супрессоров опухолевого роста BRCA1/2, связанные с поддержанием стабильности генетического аппарата клеток, репарации ДНК, обеспечивают целостность генома [Wang Y. et al., 2000]. Мутации и многочисленные полиморфные варианты генов BRCA1/2, снижающие супрессивный эффект продуктов генов BRCA1/2 на опухолевые клетки и обуславливающие развитие ЗНО молочной железы, желудка и др. локализаций, неравномерно распределены в мировых популяциях, исследованы для жителей центральных регионов России, Сибири, г. Краснодара без учета их этнической принадлежности [Grudinina et al., 2005; Krylova et al., 2006; Смирнова, 2008;

Порханова, 2009; Любченко, 2009; Часовникова и др., 2010; Поспехова, 2011;

Шубин, 2011; Фарахтдинова, 2012; Лобейко, 2012]. В соответствии с поставленными задачами, впервые у жителей Республики Адыгея проанализированы этногенетические особенности в распределении мутаций генов BRCA1/2 в норме и при онкопатологии.

Частоты мутаций генов BRCA1/2 у доноров и онкологических больных.

Распределение мутаций генов-супрессоров BRCA1/2 при злокачественных новообразованиях женских репродуктивных органов проанализировано у 153 женщин, в том числе 83 онкологических больных и 70 доноров двух этнических групп (адыгов и русских), проживающих в РА (табл. 13).

Таблица 13. Частоты исследованных мутаций генов BRCA1/2 у онкологических больных РА

–  –  –

В обследованной группе больных РА (n=56) только у одной (1,8%) женщины в возрасте 33 лет с протоковым раком, инфильтрирующим в регионарные лимфоузлы и гистологически верифицированной низкодифференцированной аденокарциномой молочной железы (IIIa стадии), выявлена мутация гена BRCA1 – 5382insC, наиболее распространенная преимущественно у евреек-Ашкенази и европейских женщин, проживающих в Румынии, Белоруссии, Украине, Италии, других странах Европы и мира (табл.2).

Однако мутация гена BRCA1 – 5382insC в других этнических группах населения мира не является маркерной при ЗНО женских репродуктивных органов (Приложение А).

Полученные данные по РА согласуются с результатами, опубликованными в международных базах (HuGEN, Pubmed) для жителей Бельгии (0,2% - K.Claes et al., 2004), Германии (1,1% - U.Hamann et al., 2003), Польши (1,9% - I.Brozek et al.,

2011) и Чили (0% - L.Jara et al., 2006), некоторых регионов России (1,9% O.B.Chasovnikova et al., 2010), но существенно отличаются от результатов, полученных для жительниц граничащего с РА Краснодарского края, где частота мутации гена BRCA1 – 5382insC при РМЖ составила 19,1% [Порханова Н.В., 2009]. Следовательно, мутации генов BRCA1/2, в том числе и 5382insC BRCA1, используемые в мировых популяциях для диагностики наследственных форм РМЖ и других новообразований, у жительниц РА не имеют прогностической значимости и не могут быть рекомендованы в качестве маркерных генов при неоплазиях.

3.2 Полиморфизмы генов про- и противовоспалительных цитокинов Низкий процент выявляемости мутаций BRCA1/2 у жителей РА, как и в других регионах мира, предполагает необходимость поиска более информативных генов-кандидатов, вовлеченных в патогенез неоплазий женских репродуктивных органов. В соответствии с медиаторной концепцией канцерогенеза или так называемой цитокиновой теорией развития заболеваний [Симбирцев А.С., 2013], перспективными маркерами опухолевого роста являются гены про- и противовоспалительных цитокинов. Полиморфные варианты промоторных и кодирующих регионов генов цитокинов могут запускать патогенетические механизмы цитокин-опосредованных заболеваний, в том числе и онкологических.

Распределение SNP промоторных регионов генов IL-17 (IL-17А и ILF) у доноров и онкологических больных.

В основе многих патологических состояний организма – трансформация базовой воспалительной реакции, в которой ведущая роль принадлежит провоспалительным цитокинам и, в частности, IL-17 – основному медиатору воспаления [Numasaki et al., 2003; Paunovic et al., 2008; Zhu X. et al., 2008; Chen S.

et al., 2010]. IL-17А и IL-17F, гены которых возможно сцеплено наследуются, кодируют идентичные на 50% белковые молекулы. Полиморфизмы генов IL-17А (rs2275913) и IL-17F (rs763780), вовлеченные в патогенез многих системных заболеваний, в том числе и онкологических, рассматриваются совместно [Wu, 2010; Paradowska-Gorycka et al., 2010; Quan Y. et al., 2012], однако в России, ЮФО и в РА не исследованы.

Для исследования роли полиморфных вариантов G197A гена IL-17А и His161Arg (7488A/G) гена IL-17F в патогенезе злокачественных новообразований

–  –  –

Учитывая этногенетические особенности распределения полиморфизмов генов в мировых популяциях, проанализированы частоты исследуемых аллелей в этнических группах доноров и больных РА (табл. 15).

–  –  –

В группах русских женщин с РМЖ, РШМ, РТМ и РЯ преобладают гомозиготные генотипы: G197G IL-17A (р=0,11) и His161His IL-17F (р=0,08), достоверно (р=0,017) повышена частота G197 аллели IL-17A, ассоциированная с ЗНО женских репродуктивных органов преимущественно у этнических русских.

Для этнических адыгов по G197/197А генотипам и G/A аллелям гена IL-17А достоверных различий не выявлено (р0,05), тогда как носительство гетерозиготного His161Arg (A7488G) генотипа и 161Arg (7488G) аллели гена ILF ассоциировано с риском развития ЗНО женских репродуктивных органов (соответственно р=0,002 и 0,003).

Таким образом, для разных этнических групп экспериментально установлены достоверные различия по SNP двух представителей семейства IL-17 (IL-17А, IL-17F). У русских женщин с неоплазиями ассоциированы SNP промоторного региона гена IL-17А, а у адыгов – SNP IL-17F, влияющий на структуру белкового продукта.

G197/197A полиморфизмы гена IL-17А и His161/161Arg гена IL-17F при опухолевой прогрессии.

Частоты G197/197A полиморфизмов гена IL-17А и His161/161Arg гена ILF исследованы в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и вовлеченности регионарных лимфатических узлов (таблицы 16-17).

–  –  –

В зависимости от метастазирования опухолевого процесса в лимфатические узлы выявлены достоверные различия по частотам SNP, генотипам IL-17A и ILF. При распространенных формах ЗНО женских репродуктивных органов достоверно чаще выявляются G197 аллель (р=0,008) и G197G генотип IL-17A (р=0,040), A7488 (His161) аллельный вариант и A7488А (His161His) генотип (р=0,050 и 0,037 соответственно) IL-17F, что определяет их как прогностически неблагоприятный маркер опухолевой прогрессии.

Таблица 17. Соотношение частот rs2275913 IL-17А и rs763780 IL-17F с уровнем дифференцировки аденокарциномы

–  –  –

С прогностически неблагоприятными гистотипами низкодифференцированной аденокарциномы ассоциирована G197 аллель IL-17A (р=0,031).

Статистически значимых различий по His161 (A7488) и 161Arg (7488G) аллелям гена и генотипам IL-17F не установлено.

При анализе сочетанного носительства полиморфизмов генов двух исследованных цитокинов IL-17А (G197/197A) и IL-17F (His161/161Arg) у больных со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов частоты G197-161Arg и 197А-His161 полиморфизмов двух генов у онкологических больных повышены и достоверно (р=0,008) отличаются от группы контроля. Наличие 161Arg полиморфизма в структурной области гена ILF и G аллели в 197 позиции промоторного региона гена IL-17А является фактором повышенного риска развития ЗНО.

G1082A, C819Т и C592A полиморфизмы гена противовоспалительного IL-10

В промоторном регионе гена IL-10 идентифицирован ряд SNP, из которых наиболее изучены G1082A (rs1800896), C819Т (rs1800871) и C592A (rs1800872), влияющие на транскрипцию мРНК и экспрессию IL-10 [Gibson et al., 2001; Jong et al., 2002].

С целью выявления SNP IL-10, ассоциированных у жительниц РА с онкопатологией, обследовано 114 женщин двух этнических групп (адыгов и русских), в том числе 49 доноров, 65 онкологических больных с I-IV стадиями ЗНО женских репродуктивных органов: РМЖ (n=54), РТМ (n=10); РШМ (n=1).

Гистологически у 63 женщин верифицирована аденокарцинома 1-3 степени злокачественности. Распределение генотипов и аллельных вариантов IL-10 проанализировано в норме и при онкопатологии в общих выборках доноров и больных с ЗНО женских репродуктивных органов (табл. 18).

В общих выборках доноров и онкологических больных, независимо от гистотипов, локализации и распространенности опухолевого процесса достоверных различий по частотам трех исследованных SNP не выявлено, что согласуется с исследованиями, проведенными в других регионах мира [Onay et al., 2006; Ivansson et al., 2007; Singh et al., 2009].

Таблица 18. Частоты SNP гена IL-10 в общих выборках доноров и онкологических больных

–  –  –

Учитывая этногенетические особенности распределения полиморфизмов генов в мировых популяциях, нами проанализированы частоты исследуемых аллелей в норме и при РМЖ для этнических групп адыгов и русских, проживающих в РА (табл. 19).

РМЖ у жительниц РА в зависимости от их этнической принадлежности ассоциирован с разными SNP гена IL-10: у этнических адыгов по аналогии с европейцами повышена частота 592A аллели (р=0,02), а у русских женщин – 819T полиморфизма гена IL-10 (р=0,04) [Langsenlehner et al., 2005; Благодатских А.Е. и др., 2011].

–  –  –

Распределение SNP гена IL-10 при опухолевой прогрессии.

Влияние 1082G/A, 819C/T, 592C/A полиморфизмов гена IL-10 на опухолевую прогрессию проанализировано при РМЖ в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и вовлеченности регионарных лимфатических узлов (табл. 20).

При анализе распределения частот генотипов и аллелей исследованных SNP трех локусов (1082, 819 и 592) промоторного региона гена IL-10 у больных РМЖ в зависимости от опухолевой прогрессии статистически значимые различия выявлены по двум SNP: G1082A (rs1800896) и C819T (rs1800871).

–  –  –

Примечание: * р0,05 У больных с метастазами в регионарные лимфатические узлы достоверно (р=0,05) повышена частота 819T аллели, ассоциированная с опухолевой прогрессией РМЖ (табл. 20). Низкодифференцированная аденокарцинома в сравнении с высокодифференцированным гистотипом сопряжена с G1082 аллелью гена IL-10 (р=0,03), что является неблагоприятным фактором прогнозом.

Аллельная гетерогенность и гаплотипы 592, 819, 1082 локусов гена IL-10

Фенотипические различия в устойчивости и предрасположенности к целому ряду заболеваний обусловлены единичными нуклеотидными заменами (SNP) и «аллельным полиморфизмом генов». В промоторных регионах генов SNP регулируют экспрессию генов и уровни продукции медиаторов иммунной системы, что особенно важно в отношении основного противовоспалительного подавляющего активность макрофагов, продукцию цитокинов ТIL-10, хелперами, цитотоксический ответ, противоопухолевый иммунитет и др.

защитные реакции организма [Turner et al., 1997; Bidwell et al., 1999]. IL-10 вовлечен в патогенез широкого спектра онкологических заболеваний и при некоторых неоплазиях оверэкспрессия IL-10 сочетается с выраженной опухолевой прогрессией, что является плохим прогностическим признаком [Turner et al., 1997;

Gibson et al., 2001].

В современных базах данных (HuGEN, Pubmed) сочетанное носительство аллельных вариантов промоторного региона гена IL-10 в виде гаплотипов исследовано только для азиатских популяций, Ирана, Турции [Roh et al., 2002;

Abdolrahim-Zadeh et al., 2005; Gonullu et al., 2007; Kong et al., 2010]. При отсутствии аналогичных работ в России, научный интерес представляет поиск возможных гаплотипов, ассоциированных с онкопатологией в этнических группах населения РА. По всем возможным вариантам ATA, ACC, GCA, GCC, GTA, ACA, ATC, GTC гаплотипов трех сайтов промоторного региона (592, 819, 1082) гена ILпроанализирована ассоциация с РМЖ (табл. 21).

Статистически значимые различия в группах доноров и онкологических больных (табл. 21) выявлены по трем парам гаплотипов IL-10: ATA/ACC (р=0,047), ACC/GCA (р=0,004) и GCA/GCC (р=0,039).

Таблица 21. Частоты гаплотипов промоторного региона гена IL-10 у доноров и больных РМЖ

–  –  –

Примечания: * р0,05 при сравнении ATA/ACC; ** р0,05 при сравнении ACC/GCA; *** р0,05 при сравнении GCA/GCC С неоплазиями молочной железы ассоциированы ATA и GCA гаплотипы противовоспалительного IL-10. Экспериментально установлено, что 1082G/A, 819C/T, 592C/A полиморфизмы промоторного региона гена IL-10 у жительниц РА ассоциированы со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов в зависимости от их этнической принадлежности: 592A аллель (р=0,02) у адыгов и 819T аллель – у русских женщин (р=0,04).

Таким образом, опухолевая прогрессия с вовлечением регионарных лимфоузлов (T1-4N1-3M0), у русских и адыгов с диагнозом РМЖ ассоциирована с 819T аллелью, а с прогностически неблагоприятным гистотипом низкодифференцированной аденокарциномы – 1082G полиморфизм гена IL-10.

ATA или GCA гаплотипы IL-10 являются информативными маркерами риска развития РМЖ.

T330/330G аллели и генотипы гена IL-2

Противоопухолевые эффекты реализуются путем повышения IL-2 цитотоксичности Т-лимфоцитов, лимфокин-активированных и естественных киллеров [Rosenberg, 2001; Oppenheim, 2007; Malek et al., 2010]. Однако пролиферативная активность IL-2 в отношении антиген-активированных Тлимфоцитов предполагает его вовлеченность в патогенез новообразований, Участие IL-2 в канцерогенезе связано с полиморфизмами гена в промоторных регионах, регулирующих интенсивность экспрессии и биологические эффекты медиатора [Motoyama et al., 2011; Song et al., 2012].

Роль T330G SNP (rs2069762) гена IL-2 в патогенезе злокачественных новообразований исследована у 104 женщин двух этнических групп (адыгов и русских), проживающих в РА, в том числе в образцах ДНК 51 донора и 53 онкологических больных (табл. 22).

–  –  –

Частоты аллелей и генотипов гена IL-2 в общих выборках доноров и онкологических больных не различались (р0,05), поэтому нами проанализированы частоты T330G (rs2069762) SNP в зависимости от этнической принадлежности обследованных лиц (табл. 23).

Таблица 23. Этногенетический анализ распределения SNP гена IL-2 в норме и при неоплазиях женских репродуктивных органов

–  –  –

По частотам исследованных SNP гена IL-2 в обследованных группах русских и адыгов экспериментально не установлено межэтнических различий, что не согласуется с данными, полученными в работах для жителей других регионов мира [Hu X.B. et al., 2013].

В международных электронных базах данных HuGEN, Pubmed не представлена информация об ассоциации T330G полиморфизмов гена IL-2 с опухолевой прогрессией, поэтому нами впервые в мире проанализировано распределение аллельных вариантов гена в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы, вовлеченности регионарных лимфатических узлов в опухолевый процесс у больных с верифицированным диагнозом рака молочной железы (табл. 24).

Таблица 24. Распределение SNP гена IL-2 у больных РМЖ в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и метастазирования в регионарные лимфоузлы

–  –  –

Примечание: * р0,05 У больных с метастазами в регионарные лимфатические узлы достоверно (р=0,03) повышена частота Т330 аллеля IL-2, ассоциированная с опухолевой прогрессией и неблагоприятным фактором прогноза течения РМЖ. Достоверных различий по частотам генотипов и аллелей Т330G гена IL-2 в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы не выявлено (табл. 24).

C589Т полиморфизмы гена IL-4

Противовоспалительный IL-4 – фактор дифференцировки Т- и Влимфоцитов с широким спектром биологических свойств, участвует в иммунных реакциях и неопластических процессах, способствуя опухолевому росту и может проявлять противоопухолевую активность. Двойственность поведения основного противовоспалительного медиатора обусловлена единичными нуклеотидными заменами, регулирующими уровень его экспрессии и биологическую активность [Gooch et al., 1998; Nagai et al., 2000].

В промоторном регионе гена IL-4 при неоплазиях типированы полиморфные варианты, из которых наиболее изучен С589Т (rs2243250) в основном для жителей Китая, Индии [Konwar R. et al., 2009; Joshi N. et al., 2013].

Аналогичные исследования в России не проводились, поэтому с целью выявления возможной ассоциации полиморфного локуса rs2243250 гена IL-4 с ЗНО женских репродуктивных органов, генотипировано 103 образца ДНК в группах здоровых и больных женщин двух этнических групп (адыгов и русских), проживающих в РА, в том числе 51 доноров, 52 больных (табл. 25).

Таблица 25. Частоты C589Т полиморфизмов гена IL-4 в общих выборках доноров и больных

–  –  –

Примечание: * р0,05 В общей выборке онкологических больных по сравнению с донорами статистически значимо повышены частоты T589T генотипа (р=0,007) и 589T аллеля (р=0,0009).

Экспериментальные данные, полученные для жителей РА, отличаются от результатов аналогичных исследований в разных регионах мира:

Китае, Индии [Konwar R. et al., 2009; Joshi N. et al., 2013].

Учитывая этногенетические особенности распределения полиморфных вариантов генов в мировых популяциях и ассоциированности с заболеваниями, нами типированы частоты исследуемых SNP гена IL-4 в этнических группах адыгов и русских (табл. 26).

Таблица 26. Анализ распределения SNP гена IL-4 в норме и при злокачественных новообразованиях органов женской репродуктивной системы

–  –  –

Примечание: * р0,05 В группе обследованных больных независимо от этнических различий статистически значимо повышена частота 589Т аллели IL-4 (табл.26), ассоциированная с онкопатологией. Следовательно, 589Т аллель гена IL-4 может быть использована в качестве маркера риска развития злокачественных новообразований у русских и адыгов.

Частоты полиморфизмов гена IL-4 при метастазировании в регионарные лимфатические узлы, а также в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы проанализированы нами при РМЖ (табл. 27).

Впервые на основе экспериментальных данных показано, что метастазирование в регионарные лимфатические узлы достоверно (р=0,03) сопряжено с повышением частоты 589T аллеля, ассоциированной с опухолевой прогрессией и неблагоприятным фактором прогноза течения РМЖ (табл. 27).

Таблица 27. Частоты SNP гена IL-4 при РМЖ в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и метастазирования в регионарные лимфатические узлы

–  –  –

Примечание: * р0,05 В зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы статистически значимых различий по C589С, С589T, Т589T генотипам и C589/589T аллелям гена IL-4 не установлено. Патогенетическая роль 589T аллеля гена IL-4 в опухолевой прогрессии, возможно, связана с регуляцией уровня экспрессии медиатора и сочетанием с другими единичными нуклеотидными заменами [Zhu J. et al., 2010; Kwon et al., 2011].

А1188/1188С аллели и генотипы гена IL-12В

–  –  –

физиологические эффекты в качестве сильного индуктора IFN и других цитокинов T- и NK-клетками периферической крови, генерирует противоопухолевый клеточный иммунитет [Paunovic et al., 2008; Rao et al., 2008;

Кетлинский, 2008].

Наиболее изученные в мировых популяциях А1188С SNP гена IL-12B в РФ и РА не типированы. Ассоциации A1188C SNP гена IL-12B со злокачественными новообразованиями женских репродуктивных органов проанализированы в общих группах доноров (n=51) и больных (n=53) (табл. 28).

Таблица 28. Распределение генотипов и А1188/1188С аллелей гена IL-12В в общих выборках доноров и онкологических больных

–  –  –

Примечание: * р0,05 В общих выборках доноров и онкологических больных статистически значимые отличия (р=0,05) найдены по частотам аллельных вариантов, но не генотипов провоспалительного IL-12В (табл. 28). Аналогично исследованиям Kaarvatn M.H. et al. (2012) для жительниц Норвегии с диагнозом РМЖ, экспериментально нами показано достоверное повышение частоты А1188 аллели в группе больных по сравнению с донорами.

Этнические особенности в распределении частот исследуемых SNP гена ILВ в норме и при онкопатологии представлены в табл. 29. В группе русских женщин выявлены определенные закономерности: у больных по сравнению с донорами достоверно повышены частоты А1188А генотипа (р=0,004) и А1188 аллели (р=0,002) гена IL-12В. Полученные данные не согласуются с работами авторов Европы, Китая, Индии и Южной Кореи, которые отмечают ассоциированность «мутантного» 1188С аллеля и гетерозиготного A1188C генотипа гена IL-12В с РШМ [Han S.S. et al., 2008; Chen X. et al., 2009; Tamandani D. et al., 2009; Roszak A. et al., 2012].

Таблица 29. Этногенетический анализ распределения SNP гена IL-12В в норме и при неоплазиях

–  –  –

Примечание: * р0,05 Для этнических адыгов статистически значимых отличий по исследованным SNP нами не установлено.

Ассоциация полиморфизмов гена IL-12В с опухолевой прогрессией в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и вовлеченности регионарных лимфатических узлов в опухолевый процесс при раке молочной железы отражена в таблице 30.

Таблица 30. Частоты SNP гена IL-12В при РМЖ в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и метастазирования в регионарные лимфоузлы

–  –  –

Примечание: * р0,05 У больных с метастазами в регионарные лимфатические узлы достоверно (р=0,04) повышена частота А1188 аллели IL-12В, что позволяет рассматривать ее как ассоциированную с опухолевой прогрессией и неблагоприятным фактором прогноза течения РМЖ. Однако в зависимости от степени дифференцировки гистотипов аденокарциномы достоверных различий по генотипам и аллелям провоспалительного гена IL-12В не выявлено.

3.3 Сывороточные уровни, спонтанная и стимулированная in vitro продукция цитокинов PBMC IL-17А Вовлеченность IL-17А в патогенез аутоиммунных, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний путем активации Т-лимфоцитов, клеточной адгезии, стимулирования пролиферации эндотелиоцитов, мезенхимальных стволовых клеток, опухолевых клеток in vitro обуславливает необходимость исследования сывороточных концентраций, продукции в культуре интактных IL-17А мононуклеарных клеток периферической крови и при активации in vitro ФГА у доноров и обследованных больных со злокачественными новообразованиями огранов женской репродуктивной системы (табл. 31).

Таблица 31. Уровни IL-17A в сыворотках, культуральной среде PBMC доноров и больных ЗНО женских репродуктивных органов

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего;

Me- медиана; t- критерий Стьюдента Для большинства медиаторов иммунной системы низкие сывороточные концентрации, в норме не превышающие 100 pg/ml, сочетаются с высоким уровнем спонтанной и стимулированной продукции в культуре PBMC. Однако по IL-17А у обследованных больных и доноров выявлены чрезвычайно высокие сывороточные уровни IL-17A, варьирующие в диапазоне значений 2003-2624 превышающие pg/ml (M±m=2218,2±214,8/2561,6±62,8; Me=2308,8/2496,6), физиологические нормы для других провоспалительных цитокинов в десятки раз и не имеющие научной ценности. В культуральной среде интактных и стимулированных ФГА доноров и больных с онкопатологией PBMC концентрации IL-17A достоверно отличались от сывороточных значений (табл.

31). Интактные PBMC онкологических больных по сравнению с донорами характеризовались достоверно сниженной продукцией IL-17A и отсутствием стимуляции при инкубации с ФГА (Me: 0/36,8; 0/92,1 соответственно).

Полученные данные по спонтанной и стимулированной продукции IL-17A PBMC больных подтверждают клеточную ареактивность онкологических больных по медиаторному звену иммунной системы.

Уровни спонтанной и стимулированной продукции IL-17A PBMC больных в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы, вовлечения регионарных лимфатических узлов проанализированы при РМЖ (таблицы 32-33).

Таблица 32. Концентрации IL-17А в сыворотке, PBMC больных РМЖ в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего; Meмедиана; t- критерий Стьюдента Таблица 33. Уровни продукции IL-17А PBMC больных с метастазами в регионарные лимфатические узлы

–  –  –

При высоко- и низкодифференцированных гистотипах аденокарциномы с вовлечением регионарных лимфатических узлов, интактные PBMC больных в подавляющем большинстве случаев (95%, Me =0) не продуцируют IL-17А (табл.

32-33). В отличие от других медиаторов иммунной системы, ФГА не оказывает стимулирующего влияния на синтез этого провоспалительного цитокина.

Согласно полученным экспериментальным данным можно предположить, что in vivo PBMC онкологических больных не являются продуцентами IL-17А, обуславливающими повышенные сывороточные концентрации медиатора.

Поэтому наиболее информативным критерием экспрессии гена IL-17А является способность PBMC продуцировать медиатор и отвечать на стимулирующее влияние ФГА.

IL-10 Ключевой регулятор иммунного ответа IL-10 ингибирует синтез других цитокинов, подавляет экспрессию MHC II класса. При некоторых неоплазиях системное повышение IL-10 сочетается с опухолевой прогрессией и является плохим прогностическим признаком [Gibson et al., 2001], однако, при злокачественных новообразованиях женских репродуктивных органов спонтанная и стимулированная in vitro продукции IL-10 практически не исследованы (HuGEN, Pubmed). Экспериментально нами определены концентрации медиатора в сыворотках, культуральной среде интактных и стимулированных ФГА PBMC у доноров и больных с неоплазиями (табл. 34).

–  –  –

В культуральной среде интактных PBMC больных со ЗНО женских репродуктивных органов IL-10 детектируется в следовых количествах (0-3 pg/ml).

ФГА не оказывает стимулирующего влияния. PBMC доноров в отличие от больных способны к спонтанной и индуцированной ФГА продукции IL-10 (t = 4,99 и 10,32 соответственно).

Уровни продукции IL-10 интактными и стимулированными ФГА PBMC больных с разными вариантами прогностически неблагоприятных гистотипов аденокарциномы, вовлеченности регионарных лимфатических узлов при ЗНО женских репродуктивных органов представлены в таблице 35.

Таблица 35. Продукция IL-10 в культуральных средах PBMC больных в зависимости от опухолевой прогрессии

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего;

Me- медиана; t- критерий Стьюдента: 1- уровня дифференцировки аденокарциномы; 2вовлеченности регионарных лимфатических узлов В зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и метастазирования в лимфатические узлы концентрации IL-10 в сыворотках, культуральной среде интактных и стимулированных ФГА PBMC больных не превышали физиологических значений (Me= 0,4-3,9) и достоверно не различались (табл. 35).

IL-2 Потенциальная роль IL-2 как фактора пролиферации Т-лимфоцитов в канцерогенезе определяется его сигнальными путями, которые ведут к клеточным онкогенам. Содержание этого медиатора иммунной системы в образцах сыворотки (но не в культуральной среде интактных и стимулированных PBMC) исследованы в мировых популяциях для немногочисленных групп доноров и больных со ЗНО различных локализаций [Forones N. et al., 2001; Lyon D. et al., 2008; Тугуз А.Р., 2002]. Экспериментально нами проанализированы концентрации IL-2 у доноров и больных с РМЖ, РТМ, РШМ (табл. 36) в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и метастазирования в регионарные лимфоузлы (табл. 37).

Таблица 36. Уровни IL-2 в сыворотках, культуральных средах PBMC доноров и больных ЗНО женских репродуктивных органов

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего;

Me- медиана; t- критерий Стьюдента По сравнению с другими цитокинами, сывороточные концентрации IL-2 колеблются в широком диапазоне значений (M±m = 0-428), у доноров и больных со ЗНО достоверно не различаются. Интактные PBMC доноров продуцируют более высокие уровни IL-2 (р0,05), но не стимулируются поликлональным митогеном ФГА.

Таблица 37. Продукция IL-2 в культурах PBMC больных в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и метастазирования в регионарные лимфатические узлы

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего;

Me- медиана; t- критерий Стьюдента для: 1- уровня дифференцировки аденокарциномы; 2вовлеченности регионарных лимфатических узлов; * р0,05 Достоверное повышение спонтанной продукции IL-2 PBMC отмечено при низкодифференцированной аденокарциноме (t=2.30; р0.05). Вовлеченность лимфатических узлов в опухолевый процесс не оказывает влияния на содержание IL-2 в исследованных образцах биоматериалов (табл. 37).

IL-4 Патогенетическая роль цитокинов в неопластических процессах обусловлена преимущественно их гипо- или гиперпродукцией, которая зависит от полиморфных вариантов промоторных регионов, регулирующих уровни экспрессии мРНК генов и синтез белкового продукта [Gooch et al., 1998; Nagai et al., 2000]. Влияние SNP гена IL-4 на сывороточные концентрации, уровни спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции медиатора практически не исследовано (HuGEN, Pubmed), но может иметь важное значение в процессах канцерогенеза, т.к. IL-4 регулирует экспрессию молекул МНС и состояние протвоопухолевого иммунитета [Morga, 1996; Zhong, 1996].

Поэтому нами исследовано содержание противовоспалительного IL-4 в биологических средах (сыворотке, культуральной среде PBMC) доноров и больных в общих группах (табл. 38), а также изменение его концентрации в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и вовлеченности регионарных лимфатических узлов в опухолевый процесс (табл. 39).

Таблица 38. Уровни IL-4 в сыворотках, культуральной среде PBMC доноров и больных со ЗНО

–  –  –

Согласно данным, представленным в таблице 38, концентрации IL-4 в нативной сыворотке доноров и онкологических больных не превышают физиологических значений (Me = 63,5-78,5) и достоверно не отличаются.

Интактные и стимулированные ФГА PBMC в норме и при онкопатологии секретируют невысокие уровни противовоспалительного IL-4.

Таблица 39. Продукция IL-4 PBMC больных в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и метастазирования в регионарные лимфатические узлы

–  –  –

Сыворотка крови 80,5±10,6 64,5 132,9±38,1 81,9 1,16 108,4±26,7 82,2 113,0±40,7 65,4 0,09 Культура ннтактных PBMC 90,9±13,6 75,8 74,9±7,6 68,4 1,09 87,4±10,7 79,6 74,3±9,3 66,8 0,89 (спонтанная продукция) Культура стимулированных 65,8±4,5 65,9 72,8±9,0 58,9 0,62 68,1±4,7 66,1 72,2±11,6 58,6 0,36 PBMC+ФГА Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего;

Me- медиана; t- критерий Стьюдента для: 1- уровня дифференцировки аденокарциномы; 2вовлеченности регионарных лимфатических узлов У больных с низкодифференцированной аденокарциномой молочной железы, тела и шейки матки сывороточные концентрации, уровни спонтанной и стимулированной продукции IL-4 достоверно не различаются. Аналогичные закономерности отмечены и при метастазировании неоплазий в регионарные лимфатические узлы (табл. 39).

Таким образом, у здоровых и больных женщин со злокачественными новообразованиями органов репродуктивной системы не выявлено различий в сывороточных уровнях, спонтанной и стимулированной in vitro продукции PBMC основного противовоспалительного Это подтверждается данными, IL-4.

полученными в исследованиях Тугуз А.Р. (2002) на онкологических больных со злокачественными новообразованиями разных локализаций.

3.4 Влияние генотипов и гаплотипов промоторных регионов генов цитокинов на продукцию медиаторов.

Продукция IL-17А в зависимости от G197A полиморфизмов.

Продукция медиаторов иммунной системы обусловлена SNP, расположенными в промоторных регионах соответствующих генов. Влияние G197A (rs2275913) полиморфизмов на продукцию IL-17А PBMC в норме и при онкопатологии в международных базах данных не представлены (HuGEN, Pubmed). Роль SNP rs2275913 в развитии злокачественных новообразований женских репродуктивных органов посредством влияния на уровни спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-17А PBMC 20 больных с гистологически верифицированными диагнозами РМЖ (n=17), РТМ (n=3) и доноров (n=17) исследована нами в зависимости от носительства G197G, G197A, А197А генотипов (табл. 40).

Таблица 40. Уровни продукции IL-17А PBMC больных и доноров в зависимости от генотипа

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего; Me- медиана;

t1- критерий Стьюдента для больных и t2 – для доноров между: a-GG/GA; b-GG/AA; c-GA/AA; t3критерий Стьюдента в сравнении уровней цитокинов в зависимости от генотипов: g-GG; h-GA;

* р0,05 В обследованной группе доноров не типированы A197A генотипы IL-17А, поэтому продукция основного провоспалительного цитокина IL-17А исследована в культуре среде мононуклеарных клеток периферической крови с G197G и G197A вариантами генотипов. Как следует из данных, представленных в таблице 40, уровни спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-17А PBMC доноров не зависят от сочетания аллельных вариантов. Интактные и инкубированные с ФГА PBMC G197G генотипов онкологических больных по сравнению с донорами in vitro не секретируют IL-17А (табл. 40).

Таким образом, нами впервые экспериментально установлено, что G197A полиморфизмы (rs2275913) промоторного региона гена IL-17 не влияют на продукцию триггерного воспалительного медиатора в культуре PBMC.

Влияние 1082G/A, 819C/T, 592C/A SNP на продукцию гена IL-10

Патогенетическая роль SNP G1082A (rs1800896), C819Т (rs1800871) и C592A (rs1800872) и соответствующих генотипов в развитии злокачественных новообразований женских репродуктивных органов посредством влияния на уровни спонтанной и стимулированной in vitro ФГА продукции IL-10 PBMC онкологических больных в мировых популяциях практически не исследована (HuGEN, Pubmed), поэтому нами впервые экспериментально проанализирована зависимость концентраций IL-10 в культуральной среде мононуклеарных клеток периферической крови от вариантов генотипов промоторного региона гена медиатора в норме и при неоплазиях (табл. 41).

Обобщая данные по трем исследованным полиморфизмам гена IL-10 можно предположить их опосредованную роль в канцерогенезе, т.к. у больных и доноров одни и те же генотипы действуют разнонаправлено на продукцию противовоспалительного цитокина в культуре PBMC.

Таблица 41. Уровни спонтанной и стимулированной продукции IL-10 PBMC онкологических больных и доноров в зависимости от вариантов генотипа

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего; Me- медиана;

t1- критерий Стьюдента для больных и t2 – для доноров между генотипами: a- GG/GA; b- GG/AA; cGA/AA; n- CC/CT; p- CC/TT; r- CT/TT; o- CC/CA; q- CC/AA; u- CA-AA;

t3-критерий Стьюдента в сравнении уровней цитокинов в зависимости от генотипов: g- GG; h- GA; iAA; d- TT; s- CC; w- CT; x- CC; y- CA; * р0,05 Мутантный гомозиготный А1082А генотип IL-10 у здоровых женщин ассоциирован с достоверно повышенной, а G аллель в гомо- и гетерозиготном состоянии (G1082G, G1082А) - со сниженной спонтанной продукцией IL-10. У онкологических больных в отличие от доноров А1082А генотип подавляет, а GA, GG генотипы повышают способность интактных PBMC продуцировать следовые количества IL-10 и отвечать на стимулирующее воздействие поликлонального активатора ФГА (табл. 41).

С819Т SNP гена IL-10 влияют преимущественно на стимулированную продукцию медиатора. Несмотря на низкие общие уровни спонтанной продукции IL-10 PBMC доноров, у лиц с гетерозиготным С819Т генотипом по сравнению гомозиготным мутантным С819С, статистически значимо повышена продукция IL-10. Таким образом, «мутантный» 819Т полиморфизм в гетерозиготном состоянии у доноров повышает продукцию IL-10. Между донорами и больныминосителями определенных генотипов 819 сайта выявлены достоверные различия также по стимулированной ФГА продукции этого in vitro противовоспалительного интерлейкина: С819Т генотип у доноров в отличие от больных ассоциирован с повышенной секрецией IL-10. PBMC доноров, но не больных, независимо от генотипа повышают стимулированную in vitro ФГА продукцию IL-10 (табл. 41).

С592А SNP IL-10 сходны с G1082A аллелями по своему действию на продукцию медиатора PBMC (табл. 41). У больных и доноров С592А полиморфизмы гена не влияют на сывороточные концентрации IL-10 противовоспалительного медиатора. Интактные и инкубированные с ФГА PBMC доноров по сравнению с PBMC онкологических больных продуцируют достоверно более высокие уровни IL-10, которые в свою очередь определяются генотипом. Наиболее низкие концентрации IL-10 детектированы в культуральной среде интактных и инкубированных с ФГА PBMC доноров с гомозиготным «мутантным» генотипом; носительство «нормального» С592 аллельного варианта в гетерозиготном (С592А) и в гомозиготном (С592С) состоянии сопряжено с более высокой спонтанной продукцией IL-10. Низкие уровни IL-10 в культуральной среде PBMC больных со ЗНО женских репродуктивных органов не зависят от генотипов.

Влияние гаплотипов гена IL-10 (592, 819, 1082) на продукцию цитокина

Сочетанное влияние полиморфизмов трех сайтов (1082, 819, 592) промоторного региона – гаплотипов гена IL-10 на способность PBMC секретировать противовоспалительный цитокин практически не исследовано.

Уровни IL-10 в образцах нативных сывороток, супернатантов интактных и стимулированных ФГА PBMC доноров и больных проанализированы в зависимости от 8 типированных гаплотипов (табл. 42-43).

Таблица 42. Концентрации IL-10 в сыворотках, культуральной среде PBMC у доноров в зависимости от гаплотипов

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего; Me- медиана;

t- критерий Стьюдента при сравнении концентраций цитокинов: 1- сывороточных значений и интактных PBMC, 2- сывороточных значений и стимулированных PBMC, 3- интактных и стимулированных PBMC.

У доноров в зависимости от исследованных гаплотипов не установлено достоверных различий по сывороточным концентрациям IL-10 (M±m = 3,2-42,6).

Интактные PBMC доноров – носителей пяти из 8 гаплотипов продуцируют достоверно (р0,05) более высокие уровни медиатора (Me = 42,9-60,1). PBMC доноров с GCA, GTA, ACA гаплотипами с общей для трех вариантов А592 аллелью синтезируют значительно меньшие количества IL-10. Присутствие этой аллели в гаплотипе не сказывается на уровне секреции A1082T819A592 противовоспалительного цитокина. Продукция IL-10 при стимуляции ФГА повышается у PBMC доноров с GCC гаплотипом.

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего; Me- медиана;

t- критерий Стьюдента при сравнении концентраций цитокинов: 1- сывороточных значений и интактных PBMC, 2- сывороточных значений и стимулированных PBMC, 3- интактных и стимулированных PBMC.

Следовые концентрации IL-10 в образцах сывороток, культуральной среде интактных и стимулированных ФГА PBMC онкологических больных не зависят от гаплотипов, варьируют в узком диапазоне значений (0,06-5,5 pg/ml), не превышающих чувствительность метода ИФА (табл. 43).

В образцах биоматериалов доноров и больных с исследованными вариантами гаплотипов достоверные различия обнаружены только по спонтанной и стимулированной продукции IL-10. Интактные и индуцированные ФГА PBMC доноров по сравнению с PBMC больных-носителей исследованных гаплотипов (кроме GCA и АСА) секретируют более высокие концентрации IL-10 (табл. 44).

Таблица 44. Концентрации IL-10 в сыворотках, культуральной среде PBMC онкологических больных и доноров в зависимости от гаплотипов

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего; Me- медиана;

t – коэффициент достоверности между больными и донорами для: 1- сывороточных значений, 2- интактных PBMC, 3- стимулированных PBMC Отсутствие каких-либо достоверных различий в продукции противовоспалительного IL-10 PBMC больных в зависимости от вариантов гаплотипов может быть обусловлено влиянием других SNP, что требует дальнейшего исследования или секвенирования гена IL-10.

Таким образом, отдельные полиморфные варианты трех сайтов промоторного региона гена IL-10 (1082, 819, 592) в норме оказывают более значимый эффект на экспрессию гена и секрецию белкового продукта, чем исследованные варианты гаплотипов. Это вероятнее всего подтверждает отсутствие взаимного влияния G1082A, C819T, С592А SNP гена IL-10 на продукцию медиатора. Следует отметить, что и при онкопатологии исследованные полиморфизмы и гаплогруппы не регулируют секрецию IL-10 PBMC.

Продукция IL-2 в зависимости от T330G генотипов промоторного региона гена Влияние T330G полиморфизмов гена IL-2 на продукцию медиатора при злокачественных новообразованиях органов женской репродуктивной сферы ранее не исследовано, поэтому в соответствии с поставленными задачами нами проанализировано содержание IL-2 в образцах сыворотки, культуральной среде интактных и стимулированных ФГА PBMC больных и доноров в зависимости от генотипов IL-2 (табл. 45).

Таблица 45. Влияние генотипов на уровни спонтанной и стимулированной продукции IL-2 PBMC

–  –  –

Примечания: М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка среднего; Me- медиана;

t1- критерий Стьюдента для больных и t2 – для доноров между: a-TT/TG; b-TT/GG; c-TG/GG; t3критерий Стьюдента в сравнении уровней цитокинов в зависимости от генотипов: d-TT генотипам; e TG генотипам; f- GG генотипам; * р0,05 Согласно экспериментальным данным, интактные и стимулированные PBMC доноров по сравнению с больными продуцируют достоверно более высокие концентрации медиатора, не зависящие от генотипа. Таким образом, Т330Т, Т330G и G330G генотипы промоторного региона IL-2 не влияют на уровни спонтанной и стимулированной ФГА продукции in vitro как у доноров, так и у онкологических больных.

Влияние C589Т полиморфизмов гена на спонтанную и стимулированную продукцию IL-4 Продукция основного противовоспалительного медиатора в зависимости от SNP гена IL-4 в норме и при онкопатологии органов женской репродуктивной системы не была исследована ранее. В работах Тугуз А.Р. (2002), Lyon D. (2008), Алимходжаевой Л.Т. (2009) представлены малоинформативные данные о сывороточных концентрациях IL-4, однако исследование способности PBMC продуцировать in vitro один из важнейших противовоспалительных цитокинов, обуславливающих экспрессию молекул MHC II, важно для понимания механизмов реализации противоопухолевого иммунитета. С этой целью проанализировано влияние SNP (rs2243250) промоторного региона гена IL-4 на уровни спонтанной и стимулированной ФГА продукции медиатора интактными PBMC доноров и онкологических больных РМЖ, РТМ, РШМ, РЯ (табл. 46).

–  –  –

Концентрации IL-4 в образцах сывороток, культурах PBMC онкологических больных не различаются и не зависят от исследуемых генотипов. Интактные PBMC доноров-носителей 589Т аллели в гетерозиготном состоянии (С589Тгенотип) продуцируют IL-4 в меньшей степени, чем PBMC доноров с гомозиготным «нормальным» и «мутантным» генотипами (табл. 46).

Обсуждение результатов Неоплазии женских репродуктивных органов имеют самые высокие показатели заболеваемости и смертности в большинстве стран мира, что связано с отсутствием надежных маркеров и скрининговых программ, позволяющих выявить злокачественные новообразования на ранних стадиях.

ЗНО относятся к мультифакториальным заболеваниям с неясным этиологическим генезом, но выраженной наследственной предрасположенностью, связанной с генетическим аппаратом половых или соматических клеток. Из идентифицированных генов и генных мутаций, вовлеченных в канцерогенез, наиболее исследованы мутации в генах-супрессорах опухолевого роста BRCA1/2, нормальная функция которых связана с поддержанием стабильности генетического аппарата клеток, репарации ДНК, обеспечивающей целостность генома [Miki et al., 1994; Wooster et al., 1995; Wang et al., 2000; Карпухин и др., 2002; Любченко и др., 2007; Kadouri et al., 2007].

Следует отметить, что мутации генов BRCA1/2, в мировых популяциях распределены с разной частотой и информативны в качестве ранних маркеров злокачественных новообразований молочной железы, яичников, тела и шейки матки, а также других органов только для некоторых этнических групп: евреекАшкенази, жительниц таких европейских стран как Польша, Дания [Levy-Lahad et al., 1997; Phelan et al., 2002; Osorio et al., 2002; Gorski et al., 2004; Pohlreich et al., 2005; Vinodkumar et al., 2007; Soumittra et al., 2009; Порханова, 2009; Любченко, 2009; Negura et al., 2010; El-said El-Debaky et al., 2011; Лобейко, 2012].

Для жителей РА данных по распределению мутаций BRCA1/2, их возможной ассоциации с онкопатологией и, в частности с ЗНО органов репродуктивной системы нет, поэтому нами проведен скрининг восьми наиболее известных полиморфных вариантов генов BRCA1/2 у больных с гистологически верифицированными диагнозами РМЖ, РЯ, РТМ, РШМ в сравнении со здоровыми женщинами. Экспериментально только у одной (1,8%) из 56 обследованных женщин с онкопатологией нами выявлена 5382insC – вторая по распространенности в мире мутация гена BRCA1. Это подтверждает мнения многих исследователей о низкой диагностической и прогностической значимости мутаций генов BRCA1/2 в развитии злокачественных новообразований женских репродуктивных органов. Более того, эти мутации вовлечены в патогенез не только неоплазий женских репродуктивных органов, но и ЗНО желудочнокишечного тракта, предстательной железы, мочевого пузыря, желчевыводящих путей и др. [Mai et al., 2009; Gallagher et al., 2010; Manguoglu et al., 2010; Slater et al., 2010; Hughes et al., 2012; Iqbal et al., 2012; Lucas et al., 2014].

Низкий процент выявляемости 5382insC у жительниц РА сравним с населением Испании (0%), Дании (0,8%), Германии (1,1%), Ирана (0%), Чили (0%) и других стран Европы, возможно вследствие неоднородности этнических популяций [Diez et al., 1999; Bergthorsson et al., 2001; Hamann et al., 2003; Jara et al., 2006; Mehdipour et al., 2006]. Мутация BRCA1 5382insС – founder mutation для некоторых народов мира является причиной возникновения РМЖ и РЯ в 30 % случаев. В Европе частота мутации 5382insС гена BRCA1 колеблется от 1,9% (у жительниц Бельгии) до 34% (в Польше), а в России чаще регистрируется в Центральном округе (4,0-28,6%), Сибирском регионе (1,9%), Северо-Западном (9,3-9,7%), Приволжском (3,3-4,6%) и Южно-федеральном округах (19,1%) [Sermijn et al., 2004; Gorski et al., 2004; Grudinina et al., 2005; Смирнова, 2008;

Любченко, 2009; Порханова, 2009; Ходорович, 2009; Chasovnikova et al., 2010;

Поспехова, 2011; Шубин, 2011; Фарахтдинова, 2012; Лобейко, 2012].

Отсутствие других мутаций генов BRCA1/2 (185delAG, 4153delA, 300T/G, 2080delA, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, 6174delT) у онкологических больных как РА, так и других регионов России, мира подтверждают нецелесообразность использования их в качестве диагностических панелей для донозологической диагностики неоплазий у женщин не-Ашкенази. Характерные для многих популяций минорные мутации BRCA1/2 не встречаются в других регионах мира, поэтому актуален поиск иных, более информативных и прогностически значимых полиморфизмов других генов-кандидатов, и в частности, про- и противовоспалительных цитокинов IL-2, IL-4, IL-10, IL-12В, IL-17А, IL-17F – иммунорегуляторных низкомолекулярных медиаторов, регулирующих системные воспалительные реакции организма и вовлеченные в канцерогенез [Osorio et al., 2002; Suter et al., 2004; Sugano et al., 2008; Soumittra et al., 2009; Donenberg et al., 2010; Kang et al., 2013].

IL-17A, F. По данным немногочисленных исследований, включенных в международные базы данных, только для жительниц Китая показана ассоциация полиморфных вариантов IL-17А с РМЖ и РШМ. Wang L. et al. указывают на А197А генотип и 197А аллель IL-17А как ассоциированные с РМЖ (р=0,0016;

р=0,0029 соответственно). По данным Quan Y. et al. (2012) с РШМ сопряжена 197А аллель IL-17А (р=0,008), для Arg161His (rs763780) SNP IL-17F достоверных различий между здоровыми женщинами и больными с онкопатологией (РМЖ и РШМ) в этих работах не выявлено [Wang et al., 2012, Quan et al., 2012].

В России G197A полиморфизмы IL-17А (rs2275913) исследованы А.Д.

Еникеевой с соавт. (2012), однако частоты G197/197A аллелей IL-17А у доноров и больных со злокачественными новообразованиями желудочно-кишечного тракта достоверно не различались. G197/197A полиморфизмы IL-17А и H161/161A аллелей IL-17F по другим локализациям ЗНО в РФ не исследованы (HuGEN, Pubmed). В отличие от данных Еникеевой с соавт. (2012), полученных при обследовании жителей Кемеровской области, нами впервые подтверждена ассоциация полиморфизма с верифицированным РМЖ G197 IL-17А преимущественно у русских женщин. По IL-17F также впервые в мире и РФ, в нами экспериментально выявлены достоверные различия в распределении частот His161Arg (A7488G) SNP у здоровых и больных женщин РА: A7488G генотип ILF независимо от этнической принадлежности, повышает риск развития РМЖ, РТМ, РШМ, РЯ. Наши данные не подтверждаются результатаыми других мировых исследований [Wang et al., 2012, Quan et al., 2012]. Противоречивые данные по распределению частот G197A аллелей IL-17А у больных женщин, проживающих в разных регионах мира – России (Республика Адыгея) и в Китае может быть обусловлено этногенетическими особенностями, географической разобщенностью популяций, историческим происхождением народов.

В международных базах HuGEN, Pubmed не упоминаются сведения о возможной ассоциации полиморфных вариантов генов провоспалительных цитокинов IL-17F с гистотипами неоплазий. В проспективном IL-17А, исследовании на репрезентативной группе больных нами подтверждена достоверная связь аллели (р=0,031) с прогностически G197 IL-17A неблагоприятным гистотипом низкодифференцированной аденокарциномы молочной железы.

Пролиферативная активность основного провоспалительного IL-17 определяет исследования сывороточных концентраций, уровней спонтанной и стимулированной ФГА продукции медиатора in vitro в культуре PBMC больных со ЗНО женских репродуктивных органов [Zhu X. et al., 2008; Martin-Orozco et al., 2009; Chen S. et al., 2010]. Участие IL-17 в канцерогенезе по данным международных баз рассматривается на основании анализа сывороточных концентраций медиатора, однако у онкологических больных с РМЖ и доноров Lyon D. et al. (2008) не выявили достоверных различий по содержанию в крови свободного IL-17 (130pg/ml и 165pg/ml соответственно), что позволило им утверждать о неинформативности сывороточных уровней медиатора при онкопатологии у жительниц Канады. В более поздних работах Souza J. et al.

(2013) отмечают достоверное повышение концентраций IL-17 в сыворотке больных РШМ по сравнению с донорами (22,50 и 12,208pg/ml, соответственно).

По данным Zhu X. et al. (2008) прогрессирование ЗНО сопровождается значительным повышением сывороточных уровней IL-17А, что может быть следствием медиаторного дисбаланса.

Согласно нашим данным, у онкологических больных и здоровых жителей РА выявлены чрезвычайно высокие сывороточные концентрации IL-17 (соответственно 2218,2±214,8pg/ml и 2561,6±62,8pg/ml), в несколько десятков раз превышающие физиологические уровни других провоспалительных цитокинов, но достоверно не различающиеся у обследованных групп. Значительные расхождения в полученных нами результатах по сравнению с другими работами могут зависеть от условий проведения и используемых тест-систем в ИФА.

Следует отметить, что в работах Lyon et al. (2008) усредненные значения концентраций IL-17 представлены без статистического анализа, а обсуждаемые Souza J. et al. (2013) различия сывороточных уровней IL-17 у больных (22,50 pg/ml) и доноров (12,208 pg/ml) не превышают физиологических значений, что при отсутствии других работ затрудняет сравнение наших экспериментальных данных с мировыми.

Наиболее информативным показателем участия IL-17A в канцерогенезе, на наш взгляд, является способность PBMC продуцировать IL-17A и отвечать in vitro на стимулирующее влияние ФГА, однако подобные исследования представлены в единичных работах. В диссертационной работе Селиховой Ю.Б. (2008) способность стимулированных ЛПС и ФГА PBMC больных РМЖ продуцировать более высокие концентрации по сравнению с доноров IL-17 PBMC (соответственно 302±51 и 106±6,3) проанализирована на небольших выборках больных (n=13) и доноров (n=13). Кроме этого, не исследовано распределение SNP гена IL-17A в норме, при онкопатологии и их влияние на экспрессию медиатора in vitro PBMC.

В отличие от Селиховой Ю.Б. (2008) экспериментально нами выявлена способность интактных и стимулированных доноров in vitro PBMC продуцировать достоверно более высокие уровни IL-17A (134,5±49,0/ 198,9±51,8) по сравнению с PBMC онкологических больных (15,8±15,4/ 24,1±9,5), которые в 95% случаев не синтезировали IL-17A (Me=0). Полученные нами результаты косвенно подтверждают ареактивность иммунной системы онкологических больных, подавление защитной воспалительной реакции, что в определенной степени может быть характерно для онкопатологии.

Продукция медиаторов иммунной системы обусловлена SNP, расположенными в промоторных регионах соответствующих генов, однако влияние G197A (rs2275913) полиморфизмов на продукцию IL-17А PBMC в норме и при онкопатологии не исследовано и не отражено в международных базах данных. Нами установлено, что G197A аллельные варианты промотора гена ILА у доноров и онкологических больных не влияют на продукцию медиатора.

IL-10. В промоторных регионах гена IL-10 идентифицирован ряд SNP, из которых наиболее изучены G1082A (rs1800896), C819Т (rs1800871) и C592A (rs1800872), воздействующие на транскрипцию мРНК, экспрессию гена и, следовательно, играющие определенную роль в патогенезе и клиническом течении ЗНО женских репродуктивных органов [Turner D. et al., 1997; Gibson A. et al., 2001; Kingo K. et al., 2005]. В немногочисленных исследованиях по распределению SNP IL-10 в норме и при неоплазиях показаны неоднозначные результаты. В европейских популяциях превалирует 592A аллель, А1082А генотип ассоциированные преимущественно с РМЖ [Giordani et al., 2003;

Langsenlehner et al., 2005; Благодатских А.Е. и др., 2011]. У китайских женщин с риском развития РМЖ связывают C819Т генотип IL-10 [He et al., 2012]. В других работах не выявлено достоверных различий у доноров и больных по частотам генотипов и аллелей гена IL-10, их ассоциированности с онкопатологией [Smith et al., 2004; Abdolrahim-Zadeh et al., 2005; Onay et al., 2006; Ivansson et al., 2007; Singh et al., 2009; Kong et al., 2010; Wang et al., 2011; Barbisan et al., 2012].

Типирование SNP трех локусов гена IL-10 в геномной ДНК обследованных женщин Республики Адыгея подтвердило данные европейских и китайских исследований о вовлеченности полиморфных вариантов в канцерогенез. Между донорами и больными установлены достоверные различия по распределению частот аллелей гена IL-10 в зависимости от этнической принадлежности: 592A аллель ассоциирована (р=0,02) с РМЖ, РШМ, РТМ у адыгов, а 819T аллель – у русских женщин (р=0,04).

Распределение генотипов и аллелей гена IL-10 в зависимости от степени дифференцировки аденокарциномы и вовлечения в опухолевый процесс регионарных лимфатических узлов, исследованное для европейцев, жителей Южной Азии, Индии и Китая, нашло подтверждение и для населения РА, но по разным аллельным вариантам [Langsenlehner U. et al., 2005; Singh H. et al., 2009;

Giordani L. et al., 2003; Kong F. et al., 2010; Благодатских А.Е. и др., 2011]. Если по данным Kong F. et al. с высокой вероятностью лимфогенного метастазирования в Китае ассоциирован A1082A генотип, в России (г.Новосибирск) – С592С генотип гена IL-10, то в РА с опухолевой прогрессией ассоциирована 819T аллель; а с низкодифференцированными вариантами аденокарциномы – G1082 полиморфизм гена IL-10. По C592A SNP IL-10 в обследованных популяциях каких-либо закономерностей при опухолевой прогрессии не выявлено.

Гаплотипы по трем локусам гена IL-10 в мире недостаточно исследованы и сочетанное носительство аллельных вариантов промоторного региона гена IL-10 в виде гаплотипов проанализировано только для популяций Китая, Ирана и Турции с весьма противоречивыми результатами [Roh J. et al., 2002; Abdolrahim-Zadeh H.

et al., 2005; Gonullu G. et al., 2007; Kong F. et al.; 2010]. Наши экспериментальные исследования показали, что факторами риска развития РМЖ у жительниц РА по трем сайтам промоторного региона (592, 819, 1082) гена IL-10 являются гаплотипы ATA и GCA. Полученные нами данные согласуются с работами Gonullu G. et al. для больных РМЖ, проживающих в Турции, однако другими авторами не выявлены достоверные различий по частотам гаплотипов rs1800896, rs1800871, rs1800872 гена IL-10 при онкопатологии [Roh J. et al., 2002;

Abdolrahim-Zadeh H. et al., 2005; Kong F. et al., 2010].

Данные по сывороточным концентрациям IL-10 у доноров и больных РМЖ проанализированые в немногочисленных работах, весьма противоречивы, фрагментарны и малоинформативны (HuGEN, Pubmed). В сыворотке жителей РА IL-10 детектируется в следовых количествах (2-5 pg/ml), уровни медиатора в норме и при онкопатологии достоверно не различаются, что согласуется с данными Roh J. et al. (2002) для кореянок, англичан, жительниц Индии и России [Rao V. et al., 2008; Pooja S., 2012; Тугуз А.Р., 2002]. Другими авторами отмечается статистически значимое повышение концентрации IL-10 в сыворотках больных РМЖ по сравнению с донорами [Kozowski et al., 2003; Lyon et al., 2008;



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«Ю. С. Другов, А. А. Родин ПРОБОПОДГОТОВКА В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ Ю. С. Другов, А. А. Родин ПРОБОПОДГОТОВКА В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО 3-е издание, дополненное и переработанное...»

«ЗУЕВА НАДЕЖДА ВИКТОРОВНА ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ МАЛЫХ РЕК СЕВЕРО-ЗАПАДА РОССИИ НА ОСНОВЕ СТРУКТУРНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК СООБЩЕСТВ МАКРОФИТОВ (НА ПРИМЕРЕ ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 25.00.36 – Геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание уч...»

«ООО "БЕЛТЕХАГРОПЛАСТ" ТЕХНИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ. Инструкция по эксплуатации. Очистные сооружения полной биологической очистки "ЧИСТОВОД АЭРО". ООО "Белтехагропласт" 220019, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Лобанка 79, оф. 37 тел/факс.(017) 314...»

«Пні бойынша оыту Нысан бадарламасыны (Syllabus) ПМУ С Н 7.18.4/19 титулды параы азастан Республикасыны білім жне ылым министрлігі С.Торайыров атындаы Павлодар мемлекеттік университеті Химиялы технологиялар жне жаратылыстану факуль...»

«ЕРОХИНА НАТАЛИЯ ИЛЬЯСОВНА ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИЛА СТОЧНЫХ ВОД И ВОЗМОЖНОСТЬ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ...»

«ЗДОРОВЬЕ, СОЦИАЛЬНАЯ ЗАЩИТА И ГЕНДЕРНЫЕ СТЕРЕОТИПЫ Е.А. Баллаева ГЕНДЕРНОЕ к.ф.н., с.н.с. лаборатории гендерных РАВЕНСТВО проблем Института социальноэкономических проблем И РЕФОРМЫ народонаселения РАН ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Понятие "здоровье" является многофакторным. Помимо биологической составляюще...»

«В сб.: Проблемы урбанизации на рубеже веков. Отв. редактор А.Г. Махрова/Смоленск: Ойкумена, 2002 328 с. C. 189-198 В.Р. Битюкова. Принципы и методы комплексной оценки экологического состояния городской среды. Все возрастающее влияние хозяйственной деятельности на окружающую среду приводит к нарушению динам...»

«БИТ-САВА Елена Михайловна МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЛЕЧЕНИЯ BRCA1/СНЕК2/BLM-АССОЦИИРОВАННОГО И СПОРАДИЧЕСКОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 14.01.12 – онкология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ Работа выполнена в ФГБУ "НИИ онколог...»

«УДК 575.11.1:599.323.4 Закеева Ирина Рафаиловна ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ НЕКАНОНИЧЕСКОЙ МОЛЕКУЛЫ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ЧЕЛОВЕКА HLA-E В РЕГУЛЯЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА 03.00.03 – молекулярная биология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА Работа...»

«Опубликовано 00:02 03.07.2011 Документ: http://www.regnum.ru/news/1421377.html Андрей Ганжа: Украина: революционная ситуация и социальное лобби В апреле произошла перепалка. Все н...»

«Муниципальное бюджетное учреждение дополнительного образования "Детский эколого-биологический центр" (МБУ ДО "ДЭБЦ") ул. Сибирская, 19, г. Железногорск, Красноярский край, Россия, 662977 Факс/тел. 8(391...»

«Белякова Ольга Ивановна СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ РАКОВИННЫХ АМЕБ И ГЕТЕРОТРОФНЫХ ЖГУТИКОНОСЦЕВ В ЭПИФИТНЫХ И ЭПИЛИТНЫХ МХАХ И ЛИШАЙНИКАХ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учрежде...»

«АЛФРЕДО ЭЛДЕР ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ВЫЯВЛЕНИЕ НАИБОЛЕЕ ЗНАЧИМЫХ ИЗ НИХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань-2013 Работа выполнена на...»

«Библиотечка П ОГЭ СтатГрад ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ ОГЭ 2017 ЛИТЕРАТУРА Л. В. Новикова ФГОС ХИМИЯ ФИЗИКА ИСТОРИЯ БИОЛОГИЯ ГЕОГРАФИЯ ЛИТЕРАТУРА МАТЕМАТИКА РУССКИЙ ЯЗЫК ИНФОРМАТИКА ОГЭ ОБЩЕСТВОЗНАНИЕ Государственное автономное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования гор...»

«Экосистемы, их оптимизация и охрана. 2014. Вып. 10. С. 68–76. УДК 582.594.2:[581.46+581.5] (477.75) ОСОБЕННОСТИ АНТЭКОЛОГИИ ЯТРЫШНИКА ПРОВАНСКОГО (ORCHIS PROVINCIALIS, ORCHIDACEAE) В КРЫМУ: ФЕНОЛОГИЯ, ПРОСТРАНСТВЕ...»

«Министерство образований и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Институт Природных ресурсов Специальность 130302 Поиски и разведка подземных вод и инженерно-геологические...»

«ПОВОЛЖСКИЙ ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 1. С. 139 – 145 УДК [502.2:330.3](470.43) ОЦЕНКИ ЭКОСИСТЕМНЫХ УСЛУГ ДЛЯ ТЕРРИТОРИИ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ А. Г. Розенберг Институт экологии Волжского бассейна РАН Россия, 445003, Тольятти, Комзина, 10 E-mail: chicadivina@yandex.ru Поступи...»

«Образовательное учреждение высшего образования Тверской институт экологии и права Кафедра общей экологии и природопользования РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ ОСНОВЫ УСТОЙЧИВОГО ЛЕСОПОЛЬЗОВАН...»

«САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ФАКУЛЬТЕТ ПРИКЛАДНОЙ МАТЕМАТИКИ – ПРОЦЕССОВ УПРАВЛЕНИЯ КАФЕДРА УПРАВЛЕНИЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИМИ СИСТЕМАМИ Соснина Мария Борисовна Выпускная квалификационная работа бакалавра Модель эпидемической волны Нап...»

«УДК 681.2:003.13.001.24 Г.В. Шувалов ФГУП СНИИМ, Новосибирск ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ ВСПЫШКИ МОТОРНЫХ МАСЕЛ Температура вспышки является важным показателем, котор...»

«• " "•Экспериментальные и теоретические статьи• •Experimental and theoretical articles• Биолог. журн. Армении, 2 (66), 2014 ПОКАЗАТЕЛИ ФЛУКТУИРУЮЩЕЙ АСИММЕТРИИ ЗУБНОЙ СИСТЕМЫ В ПАЛЕОПОПУЛЯЦИЯХ НА ТЕРРИТОРИИ АРМЕНИИ А.Ю. ХУДАВЕРДЯН1, А.А. ЕНГИБАРЯН2, Ш.А. ВАРДАНЯН2, 3.А. КАРАЛЯН3, Р.Ш. МАТЕВОСЯН2 Институт археолог...»

«Экология это наука о закономерностях формирования, развития и устойчивого функционирования биологических систем разного ранга в их взаимоотношениях с условиями среды.Объектами исследования являются: • организмы, надорганизменные и надвидовые со...»

«Кучуров Илья Владимирович НОВЫЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТЫЕ СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИЙ C–C КРОСС-СОЧЕТАНИЯ И N-НИТРОВАНИЯ В СРЕДЕ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА 02.00.03 – Органическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени канди...»

«ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА о диссертации Актугановой Софьи Андреевны на тему: "Эволюция обращений в английском языке XVI-XXI вв. (лингвоэкологический аспект)", представленной на соискание ученой степени кандидата филологических наук по специальности 10.02.04 германские языки Диссертационное исслед...»

«ПОВОЛЖСКИЙ ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 1. С. 38 – 49 УДК 504.75(282.247.41) КРАСНАЯ КНИГА ВОЛЖСКОГО БАССЕЙНА В РЕАЛИЗАЦИИ ПРИНЦИПОВ УСТОЙЧИВОГО РАЗВИТИЯ С. А. Сенатор, С. В. Саксонов Институт экологии Волжского б...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.