WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

Pages:   || 2 |

«МЕДИЦИНСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ Учебное пособие Составители: Т.Н. Попова Т.И. Рахманова С.С. Попов Издательско-полиграфический центр Воронежского ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

МЕДИЦИНСКАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Учебное пособие

Составители:

Т.Н. Попова Т.И. Рахманова С.С. Попов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета Утверждено научно-методическим советом биологического факультета, 03 сентября 2008 г., протокол № 1 Научный редактор: проф., д-р биол. наук М.А. Наквасина Учебное пособие подготовлено на кафедре медицинской биохимии и микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Рекомендуется для студентов III курса дневного отделения и V курса вечернего отделения биолого-почвенного факультета в качестве основной литературы по дисциплине «Медицинская энзимология», а также для студентов IV курса дневного отделения физического и химического факультетов в качестве дополнительной литературы по дисциплине «Биохимия».

Для специальности: (020201) – Биология

СОДЕРЖАНИЕ

Введение. Задачи и направления медицинской энзимологии.............. 4 Ферментативная активность сыворотки крови



Значение исследования ферментных констелляций.

Учет особенностей биосистем при энзимодиагностике

Общие правила работы с ферментами и некоторые практические рекомендации

Способы выражения активности ферментов

Клинико-диагностическое значение определения отдельных ферментов

Алкогольдегидрогеназа

Альдолаза

Альфа-амилаза

Аминотрансферазы

Гамма-глутамилтрансфераза

Глутаматдегидрогеназа

Глутатионредуктаза

Глутатионпероксидаза

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Изоцитратдегидрогеназа

Каталаза

Креатинкиназа

Лактатдегидрогеназа

Лейцинаминопептидаза

Липаза

5-Нуклеотидаза

Сорбитолдегидрогеназа

Супероксиддисмутаза

Фосфатазы. Щелочная фосфатаза

Кислая фосфатаза

Тартрат-резистентная кислая фосфатаза (TRACP 5B)

Холинэстераза

Эластаза

Ферменты как аналитические реагенты в клинической химии.......... 54 Некоторые аспекты энзимотерапии

Список сокращений

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ. ЗАДАЧИ И НАПРАВЛЕНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ЭНЗИМОЛОГИИ

К настоящему времени получены убедительные доказательства, что современная биология и медицина говорят на языке энзимологии и что возможности применения ферментов в медицине теоретически безграничны. Появилась новая дисциплина – медицинская биохимия, развивающаяся в соответствии с практическими запросами медицины. Медицинской биохимии принадлежит существенная роль в процессе познания патогенетических механизмов. Еще два века назад М.В. Ломоносов писал, что «медик без довольного знания химии совершенно быть не может».

Основная задача медицинской биохимии заключается в выяснении компенсаторных механизмов нарушенных этапов метаболических процессов в клетке и способов управления этой компенсацией. Успешно развивается новое направление энзимологии – медицинская энзимология, которая имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследования. Медицинская энзимология развивается по трем главным направлениям: энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимотерапии.

Область исследований энзимопатологии является теоретической, фундаментальной частью патологии. Она призвана изучать молекулярные основы развития патологического процесса, исходя из данных о нарушениях механизмов регуляции активности или синтеза индивидуального фермента или группы ферментов. По мере углубления наших представлений о механизмах различных ферментативных реакций все более становится ясно, что энзиматические нарушения в той или иной степени сопровождают любой патологический процесс в организме. Наиболее ярким примером этого могут быть молекулярные болезни, называемые также наследственные энзимопатии. Это генетически обусловленные нарушения биосинтеза какого-либо фермента, когда в тканях не продуцируется один из жизненно важных энзимов, и организм утрачивает «ключи» от определенного звена метаболизма, что становится несовместимым с нормальной жизнедеятельностью. В основе таких нарушений (большинство из них встречаются редко) лежит мутация какого-нибудь гена, кодирующего определенный фермент. Под контролем мутантного гена синтезируется дефектный фермент, у которого в том или ином ключевом участке полипептидной цепи может стоять «неправильная» аминокислота; кроме того, какой-нибудь аминокислотный остаток может быть утрачен или, наоборот, включен в полипептидную цепь. В одних случаях такой наследственно измененный фермент неактивен вообще, а в других проявляет лишь часть присущей ему активности, поскольку характерное для него значение Км (или Vmax) не соответствует норме. Большинство наследственных энзимопатий сопровождается накоплением промежуточных продуктов обмена.

При некоторых заболеваниях такого рода нарушается нормальное развитие нервной ткани, что приводит к умственной отсталости. Примером может являться фенилпировиноградная олигофрения (фенилкетонурия). Этот аферментоз по фенилаланингидролазе (называемой также фенилаланин-4монооксигеназой), катализирующей первый этап фенилаланинтирозинового метаболического пути, а именно гидроксилирование фенилаланина до тирозина, встречается у одного ребенка на каждые 15 000– 20 000 обследованных. Нормальное умственное развитие такого ребенка зависит от ранней диагностики и своевременного назначения специальной диеты.

По классификации А.А. Покровского к ферментопатиям относятся:

1) наследственные энзимопатии; 2) токсические энзимопатии; 3) алиментарные энзимопатии, вызванные нарушениями нейрогуморальных регуляций; и 4) группа различных патологических процессов, сопровождающихся нарушением и/или изменением ферментативных реакций.

Энзимопатология успешно решает и проблемы патогенеза соматических болезней. Созданы крупные научные центры и научноисследовательские институты, в которых ведутся работы по выяснению молекулярных основ атеросклероза, злокачественного роста, ревматоидных артритов и др. Нетрудно представить огромную роль ферментных систем или даже отдельных ферментов, нарушение регуляции активности и синтеза которых приводит к формированию или развитию патологического процесса.

Второе направление медицинской энзимологии – энзимодиагностика – развивается по двум путям. Один путь – использование ферментов в качестве избирательных реагентов для открытия и количественного определения нормальных или аномальных химических веществ в сыворотке крови, моче, желудочном соке и др. (например, выявление при помощи ферментов глюкозы, белка или других веществ в моче, в норме не обнаруживаемых). Другой путь – открытие и количественное определение самих ферментов в биологических жидкостях при патологии. Оказалось, что ряд ферментов появляется в сыворотке крови при распаде клеток (отсюда их название «некротические ферменты»).

Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других химических диагностических тестов, используемых в клинике, высокой чувствительностью и специфичностью. Известно около 20 тестов, основанных на количественном определении активности ферментов (и изоферментов), главным образом в крови (реже в моче), а также в биоптатах (кусочки тканей, полученные при биопсии). В практическом плане энзимологические тесты должны помогать в ранней постановке и дифференциации диагноза, информировать о возможном исходе болезни и эффективности применяемой терапии. Теоретические аспекты медицинской энзимологии сводятся, в основном, к выяснению наиболее полной и достоверной картины патогенеза и этиологии заболевания, т.е. в конечном итоге к познанию молекулярных механизмов нарушений метаболических процессов.

Успехи клинической энзимологии позволяют в настоящее время получить ценные и многосторонние показатели для диагностики заболевания.





Однако для правильной интерпретации результатов проведенных исследований обязательным является сопоставление энзимопоказателей с клинической картиной болезни в целом. В большинстве случаев биохимические тесты не определяют, а только подкрепляют и обосновывают поставленный диагноз. При оценке выявленных нарушений необходима определенная осторожность, так как один и тот же энзиматический сдвиг может являться звеном патогенетической причинной цепи или характеризовать вторичные механизмы, сопутствующие данной форме патологии, или, наконец, быть связанным со стереотипной, неспецифической реакцией организма на заболевание, такой, как реакция стресса.

В связи с этим весьма ответственным моментом в энзимодиагностике является правильный выбор ферментативного теста или комплекса того, что и как определять. В большинстве случаев клиницисты используют в энзимодиагностике комплекс прямых и косвенных методов исследования ферментов. Иногда появление в крови фермента, в норме в ней отсутствующего, позволяет сразу обнаружить поврежденный орган. Это возможно в том случае, когда фермент присутствует только в одном органе. Например, орнитинкарбомоилтрансфераза найдена только в печени. Однако таких высокоорганоспецифичных ферментов очень мало. Несколько больше ферментов, обнаруженных в двух органах или тканях. Большинство же ферментов широко распространены в организме, что затрудняет выяснение источника их происхождения.

Следует отметить, что из огромного числа ферментов (более 3500), открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь ограниченный набор ферментов и для весьма небольшого числа болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органические поражения почек, поджелудочной железы, печени и др.). Так, уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина в крови резко увеличен при сахарном диабете, злокачественных поражениях поджелудочной железы, болезнях печени и др. Резко повышается в сыворотке крови уровень двух аминотрансфераз, креатинкиназы (и ее изоферментов) и лактатдегидрогеназы (и ее изоферментов) при инфаркте миокарда; умеренно повышено их содержание при поражениях тканей мозга и печени. Определяют, кроме того, активность кислой фосфатазы (уровень повышен при карциноме предстательной железы), щелочной фосфатазы, холинэстеразы и других органоспецифических ферментов (например, гистидазы, глицинамидинотрансферазы, уроканиназы) в сыворотке крови при патологии костной ткани, печени, метастатических карциномах и т. д. Доказано, что органы и ткани человека характеризуются специфическим ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только индивидуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент концентрации ферментов между внутриклеточными и внеклеточными компартментами. Поэтому любые, даже незначительные, повреждения клеток (иногда функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внеклеточное пространство, откуда они поступают в кровь. Механизм гиперферментации (повышенное содержание ферментов в крови) до конца не расшифрован. Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме крови прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени действия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных структур органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения (топографии) ферментов в индивидуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.

В последнее время стали применять ферменты рестрикции – специфические эндонуклеазы, катализирующие разрывы межнуклеотидных связей ДНК, для диагностики фенилкетонурии, - и -талассемии и других наследственных болезней человека. Метод основан на полиморфизме рестрикционных фрагментов ДНК.

Из представленных данных следует, что диагностическая энзимология может служить основой не только для постановки правильного и своевременного диагноза болезни, но и для проверки эффективности применяемого метода лечения.

Дальнейшее развитие диагностической энзимологии преимущественно идет по двум перспективным направлениям медицинской энзимологии: по пути упрощения и рациональной модификации уже испытанных методов и по пути поиска новых органоспецифических (тканеспецифических) ферментов и изоферментов.

Третье направление медицинской энзимологии – энзимотерапия, т.е. использование ферментов и модуляторов (активаторов и ингибиторов) действия ферментов в качестве лекарственных средств, имеет пока небольшую историю. До сих пор работы в этом направлении почти не выходят за рамки эксперимента за некоторым исключением.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ

Энзимы сыворотки принято делить на 3 группы:

1. Клеточные ферменты поступают в кровь из органов и тканей.

Уровень их сывороточной активности зависит от содержания энзимов в тканях, молекулярной массы, внутриклеточной локализации, прочности связи фермента со своей органеллой, а также от скорости гидролитического расщепления и элиминации. Клеточные ферменты принято делить на неспецифические и органоспецифические. Активность первых обнаруживается во всех органах и тканях, поэтому по увеличению их сывороточной активности трудно судить о локализации первичных патологических изменений; вторые находятся в одном-двух органах – это наиболее информативные энзимы, т.к. увеличение их активности свидетельствует о поражении этих органов.

2. Секреторные ферменты синтезируются клетками, поступают в кровь и выполняют специфические функции в кровяном русле, поэтому их называют собственно ферментами крови. Это ферменты свертывающей системы и фибринолиза, каллекриин-кининовой системы, холинэстераза и др.

3. Экскреторные ферменты образуются пищеварительными железами и из их секретов поступают в кровь (амилаза, липаза и др.).

Процессы синтеза, функционирования и распада ферментов идут непрерывно и одновременно и обеспечивают определенный уровень их активности в тканях. Большинство ферментов сыворотки крови первично синтезируются в клетках, где их концентрация существенно выше, чем в сыворотке. В кровоток ферменты попадают в результате повреждений клеток или их мембран, естественной гибели клеток, часть ферментов активно секретируются в систему циркуляции. При повышенной гибели клеток увеличивается содержание и соответственно активность ферментов в системе циркуляции.

Помимо усиленной гибели клеток повышение активности ферментов в сыворотке крови может быть обусловлено:

– повышенной пролиферацией клеток с ускорением клеточного цикла (опухолевый рост);

– повышенным синтезом ферментов;

– обструкцией путей секреции ферментов в полости;

– снижением клиренса1.

Поскольку ферменты локализуются в различных клеточных компартментах, таких как цитозоль, лизосомы, клеточная мембрана или митохондрии, то появление определенной группы ферментов может свидетельствовать о степени и тяжести повреждения клеток.

Клиренс – скорость очищения плазмы крови, других сред или тканей организма

от какого-либо вещества в процессе его биотрансформации, перераспределения в организме и/или выделения из организма.

Например, такие ферменты, как кислая фосфатаза, 5’-нуклеотидаза, гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ), локализованы в клеточной мембране.

Аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), креатинкиназа (КК) находятся в цитоплазме.

АсАТ и КК обнаружены также и в митохондриях. Здесь же находятся такие ферменты, как уроканиназа, глутаматдегидрогеназа (ГДГ). Щелочная фосфатаза (ЩФ) локализована в лизосомах.

Снижение активности ферментов по сравнению с нормальными значениями может быть при сниженном синтезе, врожденных дефицитах, в присутствии ингибиторов активности фермента, при агрегации молекул ферментов.

О механизмах удаления ферментов из системы циркуляции или ингибирования их активности известно мало. Большинство ферментов, повидимому, катаболизируется плазменными протеазами и удаляется ретикулоэндотелиальной системой. Часть ферментов выделяется со слюной, желчью и другими секреторными жидкостями. Через почечный фильтр небольшие молекулы с молекулярной массой не более 60–70 кДа, поэтому в норме количество экскретируемых ферментов невелико. К ним относятся амилаза, которая фильтруется в клубочках почек. Активность амилазы в сыворотке повышается при острой почечной недостаточности, для других ферментов практически неизвестны ситуации, при которых менялся бы их клиренс, т.е. скорость удаления из крови.

ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ

КОНСТЕЛЛЯЦИЙ. УЧЕТ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОСИСТЕМ

ПРИ ЭНЗИМОДИАГНОСТИКЕ

В последнее время особое внимание уделяется исследованию не отдельных ферментативных реакций, а их сочетаний в комплексах (так называемых констелляционных типов), которые наиболее информативно отражают существо тех или иных патобиохимических нарушений. В настоящее время такие ферментативные констелляции систематизированы для различных видов патологии печени, мышечной ткани, воспалительных процессов, злокачественных новообразований и т. д. В результате комплексных исследований можно говорить об определенных биохимических синдромах, характеризующих отдельные заболевания, и о надежности лабораторных методов, помогающих врачу в объективной оценке патологии.

Для уточнения диагноза желательно определение изоферментного спектра того или иного фермента, выявление изменения функционирования пато- и органоспецифичных изоферментов, а также сопоставление активности обнаруженных в крови ферментов с их активностью в органах и тканях в норме.

При оценке функции печени все ферменты сыворотки можно разделить на универсально распространенные энзимы, органоспецифичные ферменты и экскреторные ферменты. К 1-й группе ферментов относятся трансаминазы и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза. Во 2-ю органоспецифических ферментов может быть отнесен комплекс энзимов: фруктозо-1-фосфатальдолаза, орнитинкарбомоилтрансфераза, сорбитдегидрогеназа, уроканиназа. К 3-й группе экскреторных ферментов можно отнести щелочную фосфатазу, bглюкуронидазу и некоторые др. При различных формах поражения печени могут быть выделены характерные изменения ферментного профиля сыворотки; сочетание различных проб может помочь дифференцировать вирусный гепатит от токсического, разграничить различные виды желтух, уточнить причину, остроту, тяжесть и прогноз болезни. Следует подчеркнуть, что особое значение в трактовке биохимических тестов приобретают сопоставления их с особенностями клиники.

В некоторых случаях при энзимодиагностике для суждения об активности фермента не обязательно непосредственное его исследование, а можно ограничиться определением легко доступных метаболитов в крови и моче, изменение которых может отражать функцию той или иной ферментной системы. При этом необходимо знание механизма действия ферментов, его регуляции и взаимосвязи ферментативных процессов.

Необходимо помнить, что при трактовке данных энзимодиагностики рекомендуется учитывать особенности функционирования биокаталитических систем, среди которых особое значение имеет биологическая индивидуальность. В настоящее время четко показано, что здоровым людям присущ генетически обусловленный полиморфизм белкового спектра, не связанный с развитием каких-либо патологических состояний. Такой полиморфизм обнаружен и в отношении ферментов. Вероятно, в будущем станет возможным объединение людей в группы в зависимости от особенностей генетического полиморфизма, характеризующегося различными ферментными профилями. При оценке результатов энзимодиагностики необходимо учитывать также суточные колебания ферментативной активности и другие биоритмы. Наличие таких колебаний с большим размахом от среднего значения доказано экспериментально. Наконец, следует помнить о важнейшей особенности живого организма – адаптации. Изменение активности фермента может быть вызвано качеством и количеством питания или приемом определенных фармакологических средств, которые могут выступать в качестве индуктора ферментсинтезирующей системы (или, наоборот, ингибировать ее отдельные звенья). Хорошо известно, что почти любое лекарство оказывает влияние на состояние ферментных систем, и это часто является решающим фактором в клиническом эффекте действия лекарственных веществ.

В клинико-диагностических лабораториях (КДЛ) измерения активности ферментов обычно проводят в сыворотке крови, но ферменты можно определять и в других жидкостях организма: моче, соке поджелудочной железы, ликворе, слезной жидкости, где изменение их активности также имеет существенное клинико-диагностическое значение.

Гипоферментемия встречается относительно редко и касается в основном секреторных ферментов. В подавляющем большинстве случаев она связана с генетически детерминированными нарушениями синтеза определенных энзимов, реже – с ингибированием, усиленной деградацией или экскрецией.

Дисферментемия обусловлена в основном появлением в крови органоспецифических ферментов.

Гиперферментемия свидетельствует о некрозе или лизисе клеток, либо о нарушении проницаемости клеточных мембран из-за дефицита кислорода, истощения глюкозы, действия лекарств и других ксенобиотиков, токсинов, бактерий, вирусов и др. Развитию гиперферментемии способствует клеточная пролиферация, усиление синтеза энзимов клетками, повышение концентрации активаторов в кровяном русле.

Основной трудностью использования определения активности ферментов в диагностических целях является отсутствие специфичности повышения ферментативной активности для повреждения определенной ткани или органа. Поскольку многие ферменты присутствуют в разных тканях и органах, то повышение их активности в сыворотке может быть связано с повреждением любого из этих органов.

Задача дифференциальной диагностики может быть решена одним из следующих способов:

– Определение более чем одного фермента. Разные ткани содержат ферменты в разных количествах. Так, АлАТ и АсАТ содержатся в гепатоцитах и кардиомиоцитах, но АлАТ существенно больше в печени, а АсАТ в сердце. Поэтому при повреждении печени относительно больше повышается АлАТ, а при повреждении сердца – АсАТ.

– Определение спектра изоферментов. Данный подход основан на том, что отдельные изоформы характерны для разных тканей.

– Определение активности ферментов в динамике. Скорость изменения активности фермента в сыворотке определяется разницей между скоростью его появления в сыворотке и скоростью удаления из системы циркуляции. При инфаркте органа и некрозе поврежденных клеток в сыворотке крови происходит повышение активности внутриклеточных ферментов, специфичных для данной ткани, затем после выхода всего фермента активность его снижается. Важным является определение динамики изменения фермента и определение его активности в период повышения в сыворотке, т. к. слишком раннее взятие пробы для анализа может предшествовать подъему активности, слишком позднее – также не позволит получить необходимую информацию.

Не всегда активность фермента в сыворотке отражает тяжесть заболевания. Так, острое повреждение клеток при вирусном гепатите может сопровождаться очень высоким подъемом активности ферментов, которая будет падать по мере выздоровления. В то же время при циррозе печень может быть значительно сильнее вовлечена в патологический процесс, но скорость повреждения клеток ниже и активность ферментов в сыворотке будет повышена незначительно или даже находиться в пределах референтных значений. Этот пример еще раз подчеркивает, что любые результаты по исследованию активности ферментов в сыворотке должны быть обязательно сопоставлены с другими лабораторными анализами и с клинической картиной заболевания.

Перед тем как указывать на возможность патологического процесса, необходимо исключить возможность неспецифического повышения активности ферментов в сыворотке. Так, относительно невысокое повышение в плазме активности трансаминаз характерно для многих неспецифических патологических процессов. Тяжелая физическая работа, массивные внутримышечные инъекции могут привести к повышению активности КК в сыворотке. Некоторые лекарственные средства, в частности фенитоин, фенобарбитал могут индуцировать синтез микросомального фермента ГГТ и вызвать его повышение в сыворотке без всякого заболевания. Активность ферментов в сыворотке может меняться в результате агрегации с образованием макромолекул, например, при образовании комплексов с иммуноглобулинами, в которые вступают ЛДГ, ЩФ и КК.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФЕРМЕНТАМИ И НЕКОТОРЫЕ ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Ферменты, как все белки, являются относительно неустойчивыми веществами. Они легко подвергаются денатурации и инактивации. Приступая к работе, надо внимательно изучить и осознанно выполнять прилагаемую к наборам инструкцию. Работая с ферментами (будь то ферментативные наборы для определения субстратов или активности ферментов или контрольные материалы, содержащие ферменты), следует соблюдать простые правила, вытекающие из общих для всех ферментов свойств.

1. Нельзя сильно встряхивать растворы ферментов и допускать образование пены при их перемешивании, т. к. ферменты при этом могут инактивироваться в результате воздействия на них кислорода воздуха.

2. Растворенные, лиофильно высушенные реагенты, контрольные материалы и контрольные сыворотки, содержащие ферменты, перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре в течение времени, указанного в инструкции, чтобы фермент пришел в конформационно активное состояние. Необходимо строго соблюдать условия ферментативной реакции, указанные в инструкции: время и температуру инкубации, соотношение реагент/сыворотка.

3. Время начала и окончания ферментативной реакции следует фиксировать по секундомеру, причем в случае определения активности ферментов и кинетических методов определения аналитов для каждой отдельной пробы, а не для серии целиком, иначе результаты анализа будут неверны. Началом реакции считается момент добавления сыворотки (или стартера) в реакционную смесь, а также окрашивающего реагента, если реакция двухстадийная. Для кинетических методов, когда анализ в нескольких пробах проводят последовательно, время начала реакции и равные промежутки времени между фотометрированиями следует точно фиксировать по секундомеру для каждой отдельной пробы. Так как определение, как правило, проводят в нескольких пробах, сыворотку в реакционную смесь в параллельных пробах следует вносить через четко фиксированные по секундомеру промежутки времени, например через 30 с или 1 мин. Началом реакции считается внесение сыворотки в первую пробу из серии. По истечении времени реакции следует с таким же интервалом останавливать реакцию в параллельных пробах, т. е. вносить реагент, например щелочь, с интервалом 30 с или 1 мин, соответственно. Таким образом, время реакции будет фиксировано для каждой отдельной пробы. Исключением из этого правила может быть только метод Райтмана–Френкеля. Так как время ферментативной реакции в этом методе – 1 ч, то допущенное отклонение во времени между параллельно определяемыми пробами при серийном запуске и остановке реакции будет относительно небольшим и внесет незначительную ошибку в конечный результат по сравнению с ошибкой самого метода.

4. Перед началом ферментативной реакции температуру рабочего реагента необходимо довести до значения, указанного в инструкции, и обеспечить его поддержание в течение всего времени анализа с точностью ±0,1°С. В случае ферментативных методов анализа аналитов желательно, а при определении активности ферментов обязательно использовать водяную баню (водяной термостат). Так как теплопроводность воды значительно выше теплопроводности воздуха, водяной термостат быстрей и надежней обеспечивает установку и поддержание заданной температуры реакционной смеси. Например, чтобы довести температуру 1 мл реакционной смеси до 37 °С, в суховоздушном термостате ее необходимо выдержать 10 мин, а в водяной бане – 5 мин. Если время анализа выдерживают для каждой отдельной пробы, а не для серии целиком, технически с водяной баней работать удобней.

5. Ни в коем случае нельзя изменять соотношение рабочий реагент/сыворотка. Его уменьшение в целях экономии может привести к сужению линейной области определения в случае определения активности фермента и к неполному превращению аналита в случае ферментативных методов анализа, т.е. к получению заниженных результатов. При увеличении соотношения рабочий реагент/сыворотка снижается чувствительность метода.

6. Также нельзя разбавлять рабочий реагент в целях экономии, т. к.

при этом условия реакции (концентрация буфера, активаторов и т. д.) отклонятся от оптимальных, что приведет к занижению результатов анализа как в случае определения активности ферментов, так и в случае определения аналитов ферментативными методами.

7. Если концентрация фермента или другого аналита в биологической жидкости превышает верхнюю границу линейности набора, то исследуемую пробу необходимо разбавить строго в соответствии с рекомендациями, изложенными в инструкции к набору (чем разбавлять и во сколько раз). Несоблюдение указаний может привести к серьезным ошибкам, т. к. в сыворотке присутствует огромное количество соединений, тем или иным образом влияющих на аналит и результат его определения (особенно это касается ферментов). Для получения точных и воспроизводимых результатов пробу вообще лучше не разбавлять, тем более что активность некоторых ферментов, например АлАТ и АсАТ, непропорционально уменьшается при разбавлении. Однако не всегда линейная область определения набора позволяет охватить весь диапазон физиологических концентраций аналита. Надо стремиться разбавлять пробу минимально, желательно, в 2–3 раза (особенно при определении активности ферментов) и не больше, чем указано в инструкции.

Разумеется, для разведения нельзя использовать маленькие аликвоты (10–20 мкл); чтобы уменьшить ошибку разведения, лучше взять хотя бы 100 мкл пробы.

8. Фотометрирование следует проводить в указанном в инструкции диапазоне длин волн, отклонение может существенно снизить чувствительность метода. В случае расчета концентрации аналита или активности фермента по коэффициенту экстинкции длина волны должна точно соответствовать указанной в инструкции. Так как коэффициент экстинкции – это оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 мкМ в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 1 см при данной длине волны, то для другой длины волны значение его будет иным и может значительно отличаться.

9. Длина оптического пути кюветы для фотометрирования должна соответствовать указанной в инструкции. Использование кюветы с меньшей длиной оптического пути снизит чувствительность метода.

10. При построении калибровочных кривых необходимо делать не менее 4–5 параллельных определений холостой пробы и каждого стандартного образца указанной в инструкции концентрации. Строить калибровочную кривую следует для каждой серии набора, а также при смене фотометрического оборудования.

11. Калибровочную пробу, используемую для расчета концентрации аналита или активности фермента, необходимо ставить для каждой серии анализов в четырех параллелях.

12. Следует тщательно мыть посуду, пипетки, наконечники и многократно ополаскивать их дистиллированной водой. Для мытья можно использовать только моющие средства, не содержащие биодобавки, т. к. в их состав входят протеазы, которые даже в следовых количествах могут разрушить ферменты в реакционной смеси. Особенно тщательно следует отмывать перекись водорода, используемую для обеззараживания пробирок и наконечников. Н2О2 является одним из продуктов сопряженных ферментативных реакций при определении глюкозы, холестерина, триглицеридов и т.д. Поэтому наличие экзогенного пероксида водорода завысит результаты анализа.

13. Необходимо следить за качеством дистиллированной воды, используемой в процессе анализа. Избыток некоторых ионов, входящих в ее состав, может ингибировать ферменты.

14. При работе с ферментативными наборами так же, как и при работе с другими наборами реагентов, желательно, а при отборе проб малых объемов (30–10 мкл) обязательно следует пользоваться проверенными автоматическими микродозаторами. Наконечники к ним лучше повторно не использовать, особенно те, которыми проводили отбор сыворотки и затем обеззараживали пероксидом водорода, по указанным выше причинам. При отборе калибратора использовать только новые наконечники.

15. Для получения достоверных результатов очень важен преаналитический этап. По литературным источникам доля ошибок доаналитического этапа в общем числе лабораторных ошибок составляет не менее 50 %. На долю аналитического этапа приходится не более 20 % ошибок, при этом значительная часть их связана с отсутствием стандартов на выполнение операций доаналитического этапа. На долабораторном этапе большое значение имеет процедура взятия крови у пациента, транспортировка в лабораторию, пробоподготовка и хранение пробы до анализа. Неумелое взятие крови может привести к ложным результатам. В качестве примера можно привести следующие факторы доаналитического этапа, которые могут существенно повлиять на результаты определения активности ферментов. Так, продолжительный веностаз может привести к гипоксии и увеличению проницаемости мембран клеток крови, что скажется на активности ряда ферментов. Другой негативный фактор – гемолиз; при длительном стоянии крови появляющиеся активные радикалы кислорода и дефицит субстратов приводят к порозности мембран эритроцитов. Гемолиз, освобождение ферментов из лейкоцитов и тромбоцитов могут привнести заметные изменения в активность ЛДГ, АсАТ, АлАТ, кислой фосфатазы в сыворотке. ЛДГ и кислая фосфатаза присутствуют в высоких концентрациях в тромбоцитах, поэтому активность этих ферментов в сыворотке выше, чем в плазме. При свертывании крови в сыворотке появляются ферменты из тромбоцитов, в частности кислая фосфатаза, поэтому при работе с сывороткой рекомендуется как можно быстрее отделить ее от сгустка.

Механические повреждения клеток крови (например, вследствие выпускания крови из шприца в пробирку с силой или интенсивного встряхивания при перемешивании) также могут сказаться на результатах определения активности ферментов. Хранение сыворотки также неблагоприятно сказывается на результатах определения активности многих ферментов (они занижаются), поэтому следует измерять активность ферментов в сыворотке в день взятия крови у пациента. Длительное хранение крови приводит к активации протеолиза, потери четвертичной структуры вследствие негативного влияния на SH-группы, что сказывается на активности ферментов.

16. Следует строго соблюдать условия хранения ферментативных наборов и их компонентов, указанные в инструкции, т. к. ферменты – термолабильные катализаторы. Хранение их при более высокой температуре, например в комнате вместо холодильника, может привести к быстрой инактивации ферментов. Амилаза, липаза, лейцинаминопептидаза (ЛАП), ГГТ, холинэстераза, кислая фосфатаза устойчивы при хранении, стабильность других ферментов варьирует. Многие ферменты можно хранить в замороженном состоянии и в виде лиофилизатов без потери активности, однако некоторые ферменты чувствительны к процедуре замораживания, их можно замораживать только после добавления стабилизаторов, сохраняющих их структуру. Это связано с тем, что вода при кристаллизации вызывает необратимые изменения в водородных связях белка. Например, уреаза при замораживании частично или полностью инактивируются. Особенно чувствительны к процедуре замораживания ферменты, состоящие из нескольких субъединиц. Не допускается при хранении несколько раз замораживать и размораживать пробы.

17. Следует регулярно проверять правильность и воспроизводимость результатов анализа по контрольным сывороткам, аттестованным соответствующими методами. В случае определения активности ферментов учитывать, каким рекомендациям соответствует используемый метод.

Многие из перечисленных выше правил применимы и просты в выполнении. В то же время их соблюдение гарантирует высокую точность и воспроизводимость результатов.

СПОСОБЫ ВЫРАЖЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Каталитическая активность фермента – это способность фермента превращать большое количество молекул субстрата, в то время как сам он к концу реакции остается неизменным. Ферменты различаются по своей каталитической способности. Например, 1 моль трипсина осуществляет 102 цикла в секунду, глюкозоксидаза – 17 103 циклов в секунду и т. д.

Это называется «числом оборотов фермента». Число оборотов варьирует от 1 до 106 в зависимости от природы фермента. Каталитическую активность ферментов выражают в единицах активности.

Международная единица активности (МE) – это количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 минуту в оптимальных условиях.

Единица активности в системе СИ (катал) – соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата в 1 секунду в оптимальных условиях.

Соотношение между единицами активности:

1 МE = 16,67 нанокатал;

1 катал = 6 107 МE.

В медицине активность ферментов выражают чаще всего в единицах активности на 1 л биологической жидкости.

Удельная активность фермента – это активность, выраженная в единицах активности на 1 мг (или 1 г) белка или 1 мг (1 г) препарата фермента. Используется в биохимической практике.

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

Алкогольдегидрогеназа Алкогольдегидрогеназа (АДГ; КФ 1.1.1.1.) печеночный цитоплазматический фермент, класса оксидоредуктаз. АДГ является цинксодержащем ферментом и преимущественно располагается в центролобулярном регионе печени. Алкогольдегидрогеназа способна нейтрализировать небольшие дозы алкоголя. Содержится в организме южных народов, но почти отсутствует у северных, в том числе у украинцев, русских. Фермент катализируюет в присутствии НАД окисление спиртов и ацеталей до альдегидов и кетонов.

Идентифицированы изоферменты АДГ, специфичные для печени, слизистой желудка и почек. В больших количествах фермент находится лишь в печени, но небольшие его количества содержат почки. Следы фермента также обнаруживаются в сердечной и скелетной мускулатуре человека. В сыворотке крови здорового человека отсутствует. Активность АДГ ответственна за метаболическое превращение метанола и этиленгликоля в токсические соединения. Этот эффект тормозится введением этанола.

Изоферментный спектр алкогольдегидрогеназы печени отражает патологические изменения в организме, что используется для диагностических целей. АДГ – семейство тесно связанных ферментов с выраженным полиморфизмом, что может влиять на скорость выведения этанола. Резкое повышение содержания фермента наблюдается при острых гепатитах (при этом его показатели приходят к норме раньше, чем показатели трансаминаз). При обтурационной желтухе, циррозах печени, инфаркте миокарда, мышечной дистрофии Эрба обычно не наблюдается повышения активности фермента в крови. Цианиды, йодоацетат тормозят действие энзима. Является специфическим для клеток печени. Появление его в сыворотке крови свидетельствует о повреждении клеток печени. Служит критерием выраженности гепатоцеллюлярного некроза и внутрипеченочного холестаза. АДГ рассматривается как высокочувствительный маркер аноксии печени с поражением центров долек. Изоформы алкогольдегидрогеназы имеют большое значение в дифференциальной диагностике заболеваний печени. Так, АДГ1 повышается при вирусных гепатитах, АДГ2 – при алкогольных гепатитах, активности АДГ3 так же, как и АДГ2, чаще увеличиваються при циррозе печени. Референтные пределы: 2,8 МЕ/л · 0,017 [0,05 мккат/л].

Альдолаза Альдолаза (фруктозобисфосфат-(фруктозодифосфат)-альдолаза; КФ 4.1.2.13) – фермент, относящийся к лиазам, катализирующий превращение фруктозо-1,6-дифосфата (бисфосфата) в дигидроксиацетонфосфат и глицеральдегид-3-фосфат в процессе гликолиза. Фермент играет важнейшую роль в энергетическом обмене. Молекулярная масса фермента 147–180 кДа, состоит из двух полипептидных цепей. Альдолаза присутствует во всех тканях организма. Генетически обусловленная неполноценность альдолазы является причиной наследственной непереносимости фруктозы.

В норме в сыворотке крови активность альдолазы составляет от 0,0038 до 0,02 (в среднем 0,012) мкмоль фруктозо-1,6-дифосфата, превращенного ферментом, содержащимся в 1 мл сыворотки крови, за 1 мин при 37 °С.

Активность альдолазы в крови служит дополнительным диагностическим признаком ряда заболеваний. В ткани злокачественных опухолей фермент в несколько раз активнее, чем в неизмененных тканях, в эритроцитах активность фермента в 100 раз выше, чем в сыворотке крови, гемолиз существенно искажает результаты анализа. При ряде заболеваний (прогрессирующая мышечная дистрофия, инфаркт миокарда, активный ревматизм, рак, поражения печени и др.) активность альдолазы в крови повышается, причем тем значительнее, чем тяжелее протекает болезнь.

В качестве унифицированного метода определения альдолазы принят метод Товарницкого–Валуйской, основанный на том, что продукты расщепления фруктозо-1,6-фосфата альдолазой при реакции с 2,4-динитрофенилгидразином образуют гидразоны, окрашенные в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента.

Альфа-амилаза Альфа-амилаза (1,4-a-D-глюкан глюканогидролаза; КФ 3.2.1.1) относится к группе гидролаз, катализирующих гидролиз полисахаридов, содержащих a-D-глюкозу до простых моно- и дисахаридов (мальтоза, глюкоза). Атакуются связи между 1 и 4 атомами углерода, связи в полисахаридах между a-1,6-связями не атакуются ферментом. Существует второй тип амилазы – b-амилаза (выделена из растений и бактерий); она способна расщеплять только терминальные связи на концах углеводов. Высокая активность фермента обнаруживается в печени, скелетных мышцах, в микроворсинках энтероцитов, слезной жидкости, секрете молочных желез. Активность амилазы найдена также в различных опухолях. Наиболее богаты амилазой поджелудочная и слюнные железы. Амилаза секретируется в кровь главным образом из этих органов. Плазма крови человека содержит альфа-амилазы двух изозимных типов: панкреатическую (Р-тип), вырабатываемую поджелудочной железой, и слюнную (S-тип), продуцируемую слюнными железами. В физиологических условиях амилаза сыворотки крови состоит на 40 % из панкреатической амилазы и на 60 % из слюнной амилазы. На электрофореграммах каждый из этих изоферментов выявляется в виде двух основных фракций. Изоферменты слюнных желез имеют более низкую изоэлектрическую точку (ИЭТ) и при электрофорезе мигрируют быстрее. Определение содержания каждого изофермента амилазы возможно произвести с помощью иммунологических методов. При этом используют моноклональные антитела к изоферментам слюнных желез, которые избирательно ингибируют активность слюнной амилазы. Активность, измеренная после ингибирования, соответствует активности панкреатического изофермента. Вычитая из общей активности амилазы активность панкреатической амилазы, можно получить значение активности изофермента слюны.

Оба изофермента амилазы имеют молекулярную массу около 45 кДа, поэтому фильтруются в почках и экскретируются с мочой. Тем не менее, в составе мочи больший удельный вес приходится на панкреатический изофермент.

Уровень активности альфа-амилазы в норме: в сыворотке 25–220 МЕ/л;

в моче 10–490 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002).

Определение активности альфа-амилазы имеет большое значение в диагностике заболеваний поджелудочной железы. Повышение активности альфа-амилазы в сыворотке крови в 2 и более раз должно расцениваться как симптом поражения поджелудочной железы. Небольшая гиперамилаземия дает основание заподозрить патологию поджелудочной железы, но иногда наблюдается при заболеваниях других органов. С мочой выделяется в основном Р-амилаза, что является одной из причин большей информативности о функциональном состоянии поджелудочной железы уроамилазы, чем амилазы сыворотки крови. Полагают, что 65 % амилазной активности мочи обусловлено панкреатической амилазой. Этим объясняется то обстоятельство, что при остром панкреатите именно ее содержание увеличивается в сыворотке (до 89 %) и особенно в моче (до 92 %) без изменения показателей амилазы слюнных желез. При остром панкреатите активность амилазы крови и мочи увеличивается в 10–30 раз. Гиперамилаземия наступает в начале заболевания (уже через 4–6 ч), достигает максимума через 12–24 ч, затем быстро снижается и приходит к норме на 2–6-й день. Уровень повышения сывороточной амилазы не коррелирует с тяжестью панкреатита.

Гиперамилазурия у 75 % больных с острым и обострением хронического панкреатита регистрируется в период до 8 ч от начала заболевания, у 50 % больных – через 8–12 ч, у 25 % – через 12–18 ч, у 66,6 % – через 18– 24 ч, у 75 – через 24–36 ч, у 100 % – через 36–48 ч и у 62,5 % – через 48– 72 ч. Диагностическая чувствительность определения амилазы в сыворотке крови для острого панкреатита составляет 95 %, специфичность – 88 %.

Острые панкреатиты могут протекать без повышения активности амилазы (в частности, при панкреонекрозе). В первые сутки от начала заболевания нормальный уровень амилолитической активности мочи выявляется у 25 % больных абортивным панкреатитом, у 20 % – жировым и у 10 % – геморрагическим. Более точную информацию получают при исследовании активности амилазы в суточном объеме мочи. Важное, а в ряде случаев и решающее значение для распознавания рецидивирующей формы острого панкреатита имеет повторное повышение активности амилазы крови и мочи во время повторяющихся рецидивов болевого синдрома.

Данный признак имеет исключительно большое значение для распознавания легких форм рецидивирующего острого панкреатита. Поэтому следует еще раз подчеркнуть необходимость повторных исследований активности альфа-амилазы мочи на протяжении первых двух суток заболевания.

При различных формах острого панкреатита динамика повышения альфа-амилазы в крови и моче носит различный характер. Так, для абортивного (отечного) панкреатита характерна кратковременная амилаземия в 1-е–3-и сутки заболевания; для жирового панкреонекроза – высокая и длительная амилаземия, а для геморрагического панкреонекроза – кратковременная гиперамилаземия на 3-и сутки заболевания. Патогенетически гиперамилаземия развивается в результате блокады отечной интерстициальной тканью выводных протоков поджелудочной железы и наиболее характерна для жирового панкреонекроза. При геморрагическом панкреонекрозе отмечают резкое повышение активности альфа-амилазы в крови с последующим быстрым ее снижением, что отражает прогрессирование некроза в поджелудочной железе.

Выявление гиперамилаземии и гиперамилазурии является важным, но не специфическим для острого панкреатита; кроме того, повышение активности фермента может быть кратковременным. Для повышения информативности полученных результатов исследования полезно определение активности амилазы крови и мочи сочетать с параллельным определением концентрации креатинина в моче и сыворотке крови. На основании этих данных рассчитывают индекс амилазо-креатининового клиренса по формуле АМ · КРС · 100 / (КРМ · АС), где AM – амилаза мочи; АС – амилаза сыворотки; КРМ – креатинин в моче;

КРС – креатинин в сыворотке.

В норме амилазо-креатининовый индекс не выше 3; превышение считается признаком панкреатита, т. к. при панкреатите возрастает уровень истинно панкреатической амилазы, и ее клиренс осуществляется на 80 % быстрее клиренса амилазы слюны. Однако установлено, что при остром панкреатите значительно увеличивается клиренс Р- и S-амилазы, что объясняется следующим образом. У здоровых людей амилаза сыворотки вначале фильтруется в почечных клубочках, а затем реабсорбируется канальцевым эпителием. При остром панкреатите механизм канальцевои реабсорбции подавляется вследствие избыточной экскреции Р- и S-амилазы.

Поскольку амилазная активность сыворотки при остром панкреатите обусловлена в основном Р-амилазой, то при повышении клиренса общей амилазы повышается клиренс Р-амилазы. При остром панкреатите уровень амилазы сыворотки и показатель амилазо-креатининового клиренса обычно повышены за счет подавления почечного механизма канальцевой реабсорбции амилазы. При заболеваниях, протекающих под маской панкреатита, содержание амилазы сыворотки может увеличиваться, но показатель амилазо-креатининового клиренса остается нормальным, т. к. отсутствует канальцевый дефект. Очень важно для этого исследования брать кровь и мочу в одно и то же время.

При хроническом панкреатите активность амилазы в крови и моче повышается (у 10–88 % и у 21–70 % больных соответственно) в период обострения процесса и при возникновении препятствий к оттоку панкреатического сока (воспаление, отек головки поджелудочной железы и сдавление протоков, рубцовый стеноз сосочка двенадцатиперстной кишки и др.). При склеротической форме панкреатита гиперамилаземия определяется также степенью нарушения проходимости протоков и функциональной способностью оставшейся части железы. Для повышения чувствительности исследования активности амилазы крови и мочи при хроническом панкреатите А.И. Хазанов (1997) рекомендует проводить их анализ в первые сутки пребывания в стационаре, затем не менее 2 раз после инструментальных исследований (фиброгастродуоденоскопия, рентгенологическое исследование желудка и кишечника и др.), а также в момент усиления болей в животе. При этом чувствительность теста повышается от 40 до 75–85 %.

При хронических панкреатитах с фиброзными изменениями поджелудочной железы обострения, нередко выраженные и распространенные, сопровождаются сравнительно небольшим подъемом активности амилазы.

Вследствие нарушения функциональной способности поджелудочной железы гиперамилаземия нередко может отсутствовать при остром гнойном панкреатите (при обширных «тотальных» некрозах поджелудочной железы).

При раке поджелудочной железы иногда повышается уровень амилазы в крови и моче; в других случаях их активность в пределах нормы или даже снижена.

Оценка результатов исследования активности амилазы в крови и моче затруднена тем, что фермент содержится в слюнных железах, толстой кишке, скелетных мышцах, почках, легких, яичниках, маточных трубах, предстательной железе. Поэтому уровень амилазы может быть повышен при целом ряде заболеваний, имеющих сходную картину с острым панкреатитом: остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки, кишечной непроходимости, холецистите, тромбозе брыжеечных сосудов, а также при феохромоцитоме, диабетическом ацидозе, после операций по поводу пороков сердца, после рзекции печени, приеме больших доз этанола, употребления препаратов опия, сульфаниламидов, морфина, тиазовых диуретиков, пероральных контрацептивов. Повышение амилазной активности при этих заболеваниях обусловлено рядом причин и носит в большинстве случаев реактивный характер. Вследствие значительных запасов амилазы в ацинарных клетках любое нарушение их целости или малейшее затруднение оттока секрета поджелудочной железы может привести к значительному попаданию амилазы в кровь. У больных перитонитом увеличение амилазной активности является следствием развития образующих амилазу бактерий. Обычно активность альфа-амилазы при перечисленных заболеваниях повышается в крови в 3–5 раз.

Активность слюнной амилазы увеличивается в сыворотке крови при пневмониях, стоматитах, невралгии лицевого нерва, паркинсонизме, раке легкого, яичника, остром инфаркте миокарда, черепно-мозговой травме, диабетическом кетоацидозе. Однако это увеличение не бывает значительным. Уменьшение слюнной амилазы отмечается при психическом возбуждении или депрессии, при анацидном состоянии желудочной секреции.

Снижение активности альфа-амилазы в крови может быть обнаружено при тиреотоксикозе, инфаркте миокарда, некрозе поджелудочной железы.

У некоторых пациентов может иметь место высокая амилазная активность сыворотки крови из-за низкой экскреции фермента с мочой. Характерно, что при этом почечная фильтрация в норме. Этот симптомокомплекс объясняется связыванием амилазы с сывороточными белками или с агрегацией фермента. Макромолекулярные комплексы, обладающие амилазной активностью, обозначаются как макроамилаза. Это чаще всего результат амилазы с иммуноглобулинами (амилаза – IgA). В связи с присутствием в крови пациента макроамилазы могут возникать проблемы при интерпретации результатов. Дело в том, что эта форма может существовать в крови многие годы и выявляться как у пациентов с нормальной, так и повышенной активностью амилазы. В случаях гиперамилаземии этот комплекс определяется в 3–10 % случаев. Размер молекулы макроамилазы (210 кДа) гораздо больше, чем a-амилазы, в результате она не попадает в мочу и аккумулируется в крови независимо от клинического состояния больного. Имеются данные, что при наличии макроамилазы определение панкреатического изофермента методом иммунопреципитации может дать ложноположительный результат. Это происходит потому, что макроамилазные комплексы не связываются антителами и, следовательно, определяются на втором этапе, как панкреатическая амилаза. Влияние макроамилазы на конечный результат определения активности панкреатического изофермента считается ошибкой метода, возникающей из-за невозможности полного связывания амилазы из слюнных желез соответствующими антителами. Присутствие макроамилазы может проявиться при электрофорезе, что затрудняет интерпретацию результатов.

Самым простым способом выявления присутствия макроамилазы является расчет соотношения комплексов амилазы и эндогенного креатинина по следующей формуле Амилаза (моча) · Креатинин (сыворотка) · 100 % Амилаза (сыворотка) Креатинин (моча) В норме это соотношение составляет 1–4 %. При наличии макроамилазы это значение становится ниже 1 %, при гиперамилаземии другой этилогии (включая острый панкреатит) – значение повышается до 7–10 %.

Каждый случай выявления макроамилазных комплексов у пациента должен быть зафиксирован в истории болезни, и пациент должен быть информирован об этом.

Аминотрансферазы Аспартатаминотрансфераза (КФ 2.6.1.1. L-аспартат: 2-оксоглутаратаминотрансфераза, АСТ или АсАТ или более редкое название глутаматоксалоацетаттрансаминаза (ГОТ).

Аланинаминотрансфераза (КФ 2.6.1.2. L-аланин: 2-оксоглутаратаминотрансфераза, АЛТ или АлАТ или более редкое название глутаматпируваттрансаминаза (ГТП).

Нормальные величины активности ферментов в сыворотке / плазме – АсАТ: 10–30 МЕ/л и АлАТ: 7–40 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002).

Аминотрансферазы катализируют процессы трансаминирования, они распределены по всем органам и тканям. АсАТ имеет изоферменты, локализованные как в цитозоле, так и в митохондриях, АлАТ – энзим преимущественно цитоплазматический, митохондриальная форма его нестабильна, и ее содержание в клетке низкое. Роль кофермента в трансаминазных реакциях играет пиридоксальфосфат (витамин В6).

АсАТ в высоких концентрациях присутствует в клетках сердечной и скелетных мышц, печени, почках, поджелудочной железе и эритроцитах.

Поражение любого из этих органов и тканей может привести к существенному повышению АсАТ в сыворотке крови. Наиболее резкие изменения АсАТ наблюдаются при поражении сердечной мышцы. Так, при инфаркте миокарда активность АсАТ в сыворотке крови может повышаться в 4– 5 раз. При остром инфаркте миокарда ее активность повышается у 93–98 % больных и имеет такую же динамику, как и МВ изофермент креатинкиназы, но степень увеличения активности АсАТ несколько меньшая. Считается, что между размерами очага инфаркта и активностью АсАТ в сыворотке имеется тесная корреляция. Если в течение нескольких дней не происходит нормализация активности фермента, это свидетельствует о расширении зоны инфаркта. У лиц моложе 60 лет активность АсАТ, как правило, выше, чем у лиц более пожилого возраста, поэтому высокая активность АсАТ у пожилых людей может быть расценена как проявление обширного инфаркта миокарда и является плохим прогностическим признаком. Повышение активности АсАТ характерно также для печеночных патологий.

Так, значительное повышение активности фермента имеет место при остром вирусном и токсических гепатитах. Умеренное повышение может иметь место при циррозе печени (в 2–3 раза), механической желтухе, метастазах опухоли в печень. Это может наблюдаться при поражении скелетной мускулатуры, например при прогрессирующей мышечной дистрофии;

при панкреатите; выраженном внутрисосудистом гемолизе. Следует иметь в виду, что у новорожденных активность примерно в 1,5 раза выше, чем у взрослых.

Снижение активности АсАТ имеет место при недостаточности пиридоксина (витамина В6), при почечной недостаточности, при беременности.

АлАТ в высоких концентрациях присутствует в клетках печени и в меньшей степени в скелетных мышцах, почках и сердце. Повышение активности АлАТ наиболее часто отмечается при острых заболеваниях печени и желчных путей. Активность АлАТ резко повышается у больных острыми вирусными гепатитами в ранние сроки болезни: приблизительно у 50 % больных она увеличивается за 5 дней до появления желтухи и гепатомегалии, у 90 % больных – за 2 дня до появления этих симптомов.

Пик ферментативной активности опережает максимальный уровень билирубина в крови на 7–10 дней и совпадает с появлением желтухи, т.е.

периодом максимальной тяжести болезни (превышение нормы в 20– 50 раз). В неосложненных случаях уровень активности как АлАТ, так и АсАТ снижается до нормальных значений к исходу 8 недели болезни примерно у 75–80 % больных. У небольшой части больных после нормализации наблюдается второй пик повышения активности аминотрансфераз, это сопровождается клиническим рецидивом болезни. Длительное повышение активности аминотрансфераз или увеличение ее в поздние сроки болезни может означать развитие печеночного некроза. Длительное незначительное увеличение ферментативной активности в части случаев свидетельствует о хронизации процесса (хронический гепатит, цирроз).

Отношение АсАТ/АлАТ называется коэффициентом де Ритис. В норме он составляет 1,3 ± 0,4 (Назаренко Г.И. и др., 2002), при заболеваниях печени – ниже этой величины, а при заболеваниях сердца – выше. Так, при вирусных гепатитах его значение уменьшается и составляет 0,55–0,65.

В разгар болезни, при высоких значениях активности той или другой трансаминазы, коэффициент де Ритис составляет в среднем 0,83, что отражает более глубокие разрешения гепатоцитов и выход митохондриальной АсАТ в кровяное русло. В дифференциально-диагностическом отношении имеет некоторое значение то, что при алкогольных поражения печени в противоположность вирусным характерно преимущественное повышение активности АсАТ и коэффициента де Ритис более 2. Значение данного коэффициента выше нормы часто наблюдается при обтурационных желтухах, холециститах, циррозах, когда абсолютные значения АлАТ и АсАТ невелики.

Повышение активности трансаминаз возможно при воспалительных заболеваниях различных органов и тканей (например, поджелудочной железы, при мышечных дистрофиях и т.д.). Подобные гиперферментемии не имеют, разумеется, самостоятельного диагностического значения, но должны учитываться при трактовке трансаминазного теста.

Снижение активности АлАТ может иметь место при тех же условиях, что и уменьшение активности АсАТ.

В настоящее время считают, что в рамках концепции повышения активности аминотрансфераз по причине некроза гепатоцитов и мышечных клеток существует ряд противоречий (Якунин Д.Ю. и др., 2002).

Во-первых, при гепатитах зачастую активность АлАТ повышается более чем в 100 раз, что может происходить только при глубокой степени деструкции паренхимы органа, что не согласуется с данными биопсии. Вовторых, для АлАТ обнаружен «феномен разведения» – нелинейное падение активности фермента при разведении сыворотки, то есть, наряду с простой диффузией фермента из разрушенной ткани существует как минимум еще один механизм изменения активности. В-третьих, в ткани печени описано присутствие «митохондриального» изофермента АлАТ, который практически не обнаруживается в сыворотке крови даже при значительном некрозе гепатоцитов. При этом в сыворотке крови наблюдается увеличение количества и «митохондриальной» и «цитозольной» изоформ другой трансаминазы – АсАТ.

Но наиболее сильные противоречия наблюдаются при попытках соотнести концентрацию фермента, его активность и клиническую картину.

Были предприняты попытки создать иммуноферментные системы для определения АсАТ, однако корреляция между активностью и иммунореактивной концентрацией фермента отсутствовала.

Не смотря на очевидные противоречия, теория связи лизиса клеток с увеличением активности трансаминаз до сих пор является господствующей. Основными причинами такой ситуации можно считать простоту банального «объяснения», отсутствие концептуального понимания функциональной роли АлАТ и АсАТ в циркулирующей крови, а также не изученность механизма регуляции сывороточной активности этих ферментов.

Основной внутриклеточной ролью АлАТ принято считать участие в сопряжении метаболизма аминокислот и цикла трикарбоновых кислот. Для более изученного фермента – АсАТ известно несколько функций. При этом основными функциями этого фермента являются участие в цикле мочевины и в малат-аспартатном шунте, через мембрану митохондрий. Все эти метаболические пути локализованы внутри клетки, а соответственно, и ферменты для выполнения своей физиологической роли должны находится в клетке. На данный момент неизвестно ни одного природного ингибитора трансаминаз, который бы мог обеспечивать регуляцию ферментативной активности и объяснить отсутствие корреляции между концентрацией и активностью фермента. Вследствие отсутствия сведений о диапазоне возможной «естественной» регуляции, в большинстве случаев о количественном содержании этих ферментов в органах, тканях и крови судят только на основании измерения их активности.

Какова же возможная физиологическая роль трансаминаз в крови человека? Рядом исследователей была предпринята попытка обнаружения феномена аллостерической регуляции активности ферментов в периферической крови, как одного из условий проявления физиологической роли трансаминаз.

Как уже упоминалось выше, для АсАТ известно участие в процессах трансмембранного переноса. Этот процесс обычно рассматривается как необходимый для переноса восстановительных потенциалов через митохондриальную мембрану и регенерации НАДH, образованного в результате гликолиза. Однако путь утилизации НАДH в митохондрии не всегда возможен. Например, эритроциты не имеют митохондрий и поэтому им необходимо утилизировать НАДH другим способом. Гликолитический путь получения энергии характерен также и для мышцы в условиях недостатка кислорода. В этой ситуации для регенерации НАДH необходим малат-аспартатный шунт, между цитозолем и межклеточной жидкостью, с последующим транспортом восстановительных потенциалов в печень для дальнейшего окисления в дыхательной цепи. Вторым продуктом гликолиза, который необходимо удалять из клетки в случаях невозможности окисления, является пируват. Пируват и лактат имеют крайне низкую скорость трансмембранного переноса, но L-аланин легко переносится через мембрану. И именно АлАТ может обеспечить образование Lаланина из пирувата. Необходимо также учесть, что печень очень активно поглощает L-аланин в качестве субстрата. Это обусловлено высокой интенсивностью цикла мочевины и глюконеогенеза. В то же время показано, что печень в незначительной степени метаболизирует глюкозу до пировиноградной кислоты, т.е. интенсивность гликолиза в ней не высока.

Глюкоза, поступающая в печень, перерабатывается в гликоген, в связи с этим можно считать, что наиболее предпочтительным энергетическим субстратом для печени является пируват, а прохождение через мембрану может быть обеспечено в форме L-аланина. Способность печени поглощать L-аланин, в концентрациях в 20 раз превышающих физиологическую норму, показано в опытах с перфузией печени. Если принять именно такое участие АлАТ и АсАТ в процессах перераспределения энергетических субстратов между органами, то меняется и отношение к повышению активности этих ферментов при патологических процессах. Фактически можно предположить, что повышение активности трансаминаз связано либо с необходимостью отведения продуктов гликолиза от органов, оказавшихся в условиях гипоксии, либо с повышением энергетических затрат печенью. В этом контексте повышение активности трансаминаз вовсе не свидетельствует только о лизисе клеток.

На основании этого можно сделать предположение, что «стертые» формы гепатита, вообще не сопровождаются процессом разрушения печени, и организм успешно справляется с патологическим процессом самостоятельно. Это объясняет также и тот факт, что активность трансаминаз повышается раньше появления в крови других ферментов, специфичных только для внутриклеточного пространства.

Гамма-глутамилтрансфераза Гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ; КФ 2.3.2.2) катализирует перенос гамма-глутамилового остатка с гамма-глутамилового пептида на аминокислоту, другой пептид или иной субстрат. В организме человека фермент участвует в метаболизме глутатиона – пептида, состоящего из остатков глутаминовой кислоты, цистеина, глицина, который играет важную роль во многих обменных процессах. Тест по определению активности ГГТ в последнее время приобретает все большее значение в диагностике заболеваний печени и гепато-билиарного тракта, т. к. отличается большей чувствительностью, чем применяемые с этой целью тесты на АлАТ, АсАТ и ЩФ.

Наиболее высокая активность ГГТ обнаружена в почках – в 7000 раз выше, чем в сыворотке крови. Содержание ГГТ в сыворотке крови здорового человека обычно незначительно и связано с ее экскрецией из клеток печени, где активность фермента в 200–500 раз выше. Кроме того, ГГТ содержится в клетках поджелудочной железы (в 600 раз выше, чем в сыворотке крови). Незначительная активность фермента регистрируется в кишечнике, мозге, сердце, селезенке, простате и скелетных мышцах. В клетке ГГТ локализована в мембране, лизосомах и цитоплазме, причем мембранная локализация фермента характерна для клеток с высокой секреторной, экскреторной или (ре)абсорбционной способностью. Референтные значения активности фермента в сыворотке крови в зависимости от возраста и пола представлены в таблице 1.

Активность ГГТ в сыворотке крови повышается при любых патологиях печени и желчных путей, и, напротив, при нормальной активности фермента вероятность заболевания печени очень мала. В зависимости от механизма повреждения печени степень увеличения активности ГГТ в сыворотке крови, как правило, заметно отличается, что позволяет успешно использовать этот маркер для дифференциальной диагностики заболеваний печени.

–  –  –

Существенное увеличение активности ГГТ наблюдается при холестазе, и лишь незначительное – при повреждении паренхимы печени (некрозе гепатоцитов). Поскольку в последнем случае, как уже указано выше, резко возрастает активность АлАТ, то определение индекса АлАТ/ГГТ позволяет с высокой достоверностью дифференцировать острый вирусный и обструктивный гепатиты. У больных хроническим гепатитом активность ГГТ увеличена в 75 % случаев, в то время как показатели АлАТ могут находиться на уровне нормальных значений.

Поэтому тест на ГГТ с большей достоверностью подтверждает диагноз заболевания.

Гамма-глутамилтрансфераза – более информативный маркер поражения гепатобилиарной системы, чем ЩФ. Активность ГГТ возрастает в более ранние сроки заболеваний и удерживается на повышенных уровнях более длительное время, причем относительное увеличение активности ГГТ выше, чем ЩФ. Кроме того, ГГТ – высокоспецифичный индикатор поражения печени, поскольку в отличие от ЩФ, ее активность у здоровых детей, беременных женщин и пациентов с заболеваниями костной системы находится на уровне нормальных значений.

Определение активности ГГТ имеет большое значение для дифференциации желтух. При паренхиматозной желтухе, свойственной инфекционным и токсическим заболеваниям с поражением паренхимы печени, активность ГГТ повышается обычно лишь в незначительной степени (в 2–3 раза). У всех больных с обтурационной (механической) желтухой, вызванной нарушениями оттока желчи по желчевыводящим путям, такими как закупорка желчных протоков камнем, сдавливание их опухолями, увеличенными лимфоузлами и др., активность ГГТ в сыворотке крови превышает верхнюю границу нормы в 15–140 раз.

Весьма важной сферой применения теста для определения ГГТ является онкология. Показано, что у 100 % больных злокачественными опухолями с метастазами в печень (с наличием желтухи и без нее) активность ГГТ в сыворотке крови значительно (в 12 и более раз) повышена. В то же время у больных без метастазов в печень активность данного фермента превышает норму, в основном, лишь при наличии заболеваний гепатобилиарной системы неопухолевого происхождения.

Определение активности ГГТ используется для диагностики алкогольного поражения печени, а также для контроля лечения алкоголизма.

Алкоголь усиливает продукцию ГГТ в печени и способствует ее выходу из клеточных мембран, что приводит к повышению активности фермента в сыворотке крови даже при отсутствии патологии печени. При прекращении злоупотребления алкоголем уровень активности ГГТ постепенно снижается (через 10 дней на 50 %) и затем приходит в норму. Поэтому тест на ГГТ позволяет проконтролировать добросовестность лечения от алкоголизма. Если прием алкоголя однозначно прекращен, а активность ГГТ у бывшего алкоголика не снижается, то высока вероятность наличия у него алкогольного гепатита или цирроза печени.

Ряд наркотиков и лекарственных препаратов (нестероидные противовоспалительные препараты, диклофенак, парацетамол, барбитураты и др.) также индуцирует активность ГГТ в печени. Поэтому мониторинг ГГТ в сыворотке крови больных используется для выявления гепатотоксического действия препаратов и своевременного изменения лечебного курса.

Кроме основного использования в качестве «печеночной» пробы тест по определению активности ГГТ применяется для диагностики заболеваний поджелудочной железы. Причем в странах Западной Европы в последнее время он используется чаще, чем тест на альфа-амилазу – традиционный маркер патологий поджелудочной железы. Это связано с тем, что у 100 % больных, страдающих острым панкреатитом, активность ГГТ в сыворотке крови, как правило, в 10–20 раз превышает нормальные значения.

Новой областью применения данного теста является лабораторная диагностика заболеваний почек. Показано, что при пиелонефрите, гломерулонефрите, почечнокаменной болезни активность ГГТ в моче больных существенно возрастает. Определение активности фермента в моче позволяет диагностировать начальные стадии патологии почек, сопровождающиеся поражением проксимальных отделов канальцев.

Анализ сводных данных об активности «печеночных» ферментов в сыворотке крови при некоторых заболеваниях и состояниях (табл. 2) показывает, что активность ГГТ является высокочувствительным индикатором заболеваний печени, желчевыводящих путей и поджелудочной железы. Особенно эффективно применение данного маркера в диагностике в комплексе с другими ферментами печеночного профиля.

–  –  –

Определение активности ГГТ основано на измерении скорости ферментативной реакции переноса гамма-глутамиловой группы с субстрата-донора на субстрат-акцептор. В первом методе определения активности фермента был использован его природный субстрат глутатион. Однако этот метод сложен в постановке, поэтому в клинической биохимии широкого распространения не получил. Современные лабораторные способы определения активности ГГТ основаны на применении синтетических хромогенных субстратов-доноров.

Начиная с 1960-х годов в качестве такого субстрата большинство биохимических лабораторий использовало гамма-глутамил-р-нитроанилид, а в качестве субстрата-акцептора гамма-глутамиловой группы – глицилглицин.

Данный колориметрический тест основан на следующей ферментативной реакции:

L-гамма-глутамил-р-нитроанилид + глицилглицин ® ГГТ

L-гамма-глутамилглицилглицин + р-нитроанилин ® ГГТ

Активность ГГТ определяется по скорости расщепления хромогенного субстрата с образованием р-нитроанилина, интенсивность окраски которого (оптическая плотность при длине волны 405 нм) пропорциональна активности фермента в анализируемой пробе. Широкое применение данного метода на практике и в научных исследованиях позволило установить нормальные значения активности ГГТ в сыворотке крови пациентов различного возраста и пола, а также величин, соответствующих различным патологическим состояниям, на которые ориентируются и в настоящее время.

К недостаткам применения гамма-глутамил-р-нитроанилида в качестве хромогенного субстрата относится его низкая растворимость, затрудняющая приготовление его раствора с необходимой концентрацией, а также недостаточная стабильность рабочего раствора, в котором при хранении спонтанно образуется р-нитроанилин. Этих недостатков лишен широко применяемый в настоящее время для анализа ГГТ гамма-глутамил-3карбокси-4-нитроанилид (ГГКНА). Этот субстрат с растворимостью в 50 раз выше, чем гамма-глутамил-р-нитроанилид, образует высокостабильные растворы. Кинетические константы ферментативной реакции для обоих субстратов сходны.

Международная федерация клинической химии (IFCC) рекомендует в качестве референтного метода определения активности ГГТ колориметрический кинетический метод с ГГКНА в концентрации, обеспечивающей максимальную скорость ферментативной реакции (6мМ). Однако для рутинного анализа в лабораториях чаще применяют модифицированный метод Зейца (Szasz), в котором концентрация с ГГКНА ниже (3–4 мМ). Результаты определения активности ГГТ, получаемые при этом, ниже (приблизительно на 7 %), чем по методу IFCC, однако они полностью совпадают со значениями активности фермента, определенными с применением в качестве субстрата гамма-глутамил-р-нитроанилида. Метод Szasz дает возможность использовать установленные ранее привычные нормы активности ГГТ и весь накопленный клинический опыт.

Глутаматдегидрогеназа Глутаматдегидрогеназа (ГДГ; КФ 1.4.1.3) – фермент, катализирующий превращение глутамата в 2-оксоглутарат и аммиак. ГДГ в незначительных количествах обнаружен в нервной ткани, скелетных мышцах, миокарде и молочной железе, в наибольшем количестве содержится в клетках печени. Уровень активности ГДГ в норме 0–0,9 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002). Фермент находится внутри митохондрий гепатоцитов, поэтому увеличение его активности отражает глубину цитолиза клеток; по степени ее повышения можно судить о тяжести патологического процесса.

Увеличение активности фермента происходит при поражении печени различной этиологии и поражении желчевыводящих путей: острые гепатиты с некрозом печени, рак печени, печеночная кома, острая интоксикация, механическая желтуха и т.п. При вирусном гепатите ГДГ повышается в первые сутки желтушного периода. Высокая активность ГДГ отмечается у больных первичным и метастатическим раком печени. При выраженном обострении цирроза печени подъем активности ГДГ бывает значительным, причем высокая активность фермента рассматривается как неблагоприятный признак. Алкогольная интоксикация сопровождается значительным увеличением активности ГДГ в крови.

Повышение активности ГДГ и ГГТ во многом сходно, но есть различия: высокая активность ГДГ наблюдается при острых повреждениях печени, а высокая ГГТ – при длительных патологических процессах в печени.

Одновременное исследование активности ГДГ и сорбитолдегидрогеназы (СДГ) позволяет рассчитать коэффициент СДГ/ГДГ. В первую неделю вирусного гепатита этот коэффициент обычно превышает 0,5, составляя в среднем 1,3. В первую неделю обтурационной желтухи он ниже 0,5.

Глутатионредуктаза Глутатионредуктаза (ГР; КФ 1.6.4.2) – НАДФ-зависимый фермент, катализирующий превращение окисленной формы глутатиона в восстановленную. ГР присутствует практически во всех тканях, но наибольшее его содержание в почках, печени, сердце и эритроцитах. Повышение активности фермента наблюдается при гепатите, механической желтухе, сахарном диабете, при дефиците глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, серповидной и мегалобластной анемиях, после введения никотиновой кислоты, после физической нагрузки. Недостаток ГР отмечается при дефиците рибофлавина.

Глутатионпероксидаза Глутатионпероксидаза (ГП, КФ 1.11.1.9) – один из ключевых ферментов антиоксидантной системы организма, функцией которого является разрушение и инактивация пероксидов водорода и гидропероксидов (пероксидных радикалов) – токсичных соединений кислорода. Содержится практически во всех тканях. В норме активность фермента в эритроцитах составляет 29,6–82,9 МЕ/г Hb (Назаренко Г.И. и др., 2002).

ГП клеток печени состоит из четырех субъединиц, каждая из которых содержит в активном центре атом селена. В клетках печени ГП локализована в цитозоле и матриксе митохондрий. Таким образом, Н2О2, образующаяся при работе пероксисомальных ферментов, удаляется содержащейся в пероксисомах каталазой, а Н2О2, образующаяся в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме, разрушается преимущественно под действием ГП. ГП обладает в 1000 раз бльшим сродством к Н2О2 по сравнению с каталазой, поэтому ГП рассматривают в качестве антиоксидантного фермента, имеющего первостепенное значение в защите клетки от постоянно образуемого пероксида водорода. Наряду с этим, ГП способна восстанавливать гидропероксиды жирных кислот, пероксиды белкового и нуклеиновокислотного происхождения. Помимо селенсодержащей ГП в организме животных обнаружена ГП, не содержащая селена, которая имеет другие физико-химические и каталитические свойства. Активность селенсодержащей ГП напрямую зависит от уровня селена в организме. Снижение активности фермента при недостаточности селена зависит от уменьшения количества мРНК этого белка. Пероксид водорода и активные радикалы образуются в результате пероксидного окисления липидов (ПОЛ), которые приводят к дестабилизации клеточных мембран и, в тяжелых случаях, к их разрушению. Активация ПОЛ наблюдается при различных заболеваниях: ишемия органов и тканей, сахарный диабет, атеросклероз и мн.

др. Определение ГП помогает оценить антиоксидантную способность организма при различных заболеваниях, а также у людей с повышенным риском селенового дефицита (в старческом возрасте, при плохом питании, курении, алкоголизме, стрессе, почечной недостаточности, химиотерапии и др.), рекомендовать назначение препаратов для антиоксидантной терапии и оценивать эффективность терапии.

Желательно использовать нормы значений активности фермента применительно к лабораториям, в которых производилось исследование.

Увеличение активности наблюдается при: дефиците глюкозо-6фосфатдегидрогеназы, остром лимфоцитарном лейкозе, талассемии.

Уменьшение активности ГП сопровождает сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, сахарный диабет, аутоиммунные заболевания (ревматоидный артрит), процессы старения организма, муковисцидоз. Снижение активности ГП выявляется у больных шизофренией и маниакальнодепрессивным психозом, где свободным радикалам отводится ведущая роль в патогенезе их развития.Уменьшение активности ГП значительно повышает риск возникновения раковых заболеваний. Низкая активность ГП и уровень селена могут быть причиной бесплодия. Мониторинг активности ГП через 1–5 лет позволяет эффективно проводить профилактическое лечение антиоксидантами.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ; КФ 1.1.1.49) – фермент, участвующий в процессах окисления глюкозы. Наибольшее содержание фермента обнаружено в селезенке, лимфатических узлах, эритроцитах и молочной железе. Одним из основных поставщиков НАДФН для глутатионовой антиоксидантной системы является пентозофосфатный путь, ключевым ферментом которого является Г6ФДГ. В большом количестве находится в эритроцитах и используется, в основном, для выявления наследственных заболеваний, связанных с дефицитом фермента – наиболее распространенной наследственной гемолитической анемии, обусловленной дефицитом активности Г6ФДГ эритроцитов. Эта наследственная патология встречается в определенных регионах и наиболее широко распространена в странах Средиземноморья, Индии, Африки, Средней Азии. Дефицит трудно выявить у гетерозигот женского пола и непосредственно вслед за гемолитическим эпизодом у лиц с Г6ФДГ-анемией. Гетерозигот с любыми вариантами дефицита Г6ФДГ часто трудно выявить другими методами, за исключением анализа родословной. В последнее время для диагностики вариантов Г6ФДГ вводится анализ ДНК.

В результате нарушений в строении молекулы фермента эритроциты становятся непрочными и разрушаются в кровеносном русле. Клинически дефицит Г6ФДГ может не проявляться вообще или проявляться гемолизом (разрушением эритроцитов) различной интенсивности. В одних случаях гемолиз появляется под влиянием некоторых пищевых продуктов или лекарственных препаратов (противомалярийные средства, сульфаниламиды, нитрофураны, противотуберкулезные препараты и др.), в других случаях хроницеский гемолиз наблюдается независимо от внешних факторов.

При массовых обследованиях используется качественный унифицированный метод — проба Бернштейна, которая в норме отрицательна.

Норма – 3–11 % эритроцитов периферической крови содержат Г6ФДГ;

12,1 ± 2,09 МЕ/г Hb · 0,0645.

Изоцитратдегидрогеназа Изоцитратдегидрогеназа (ИДГ; КФ 1.1.1.42) – фермент, имеющий 2 формы коферментной специфичности (НАД и НАДФ-зависимые) и катализирующий обратимое окисление изоцитрата до 2-оксоглутарата.

НАДФ-зависимая форма присутствует во всех тканях, но наибольшая ее активность обнаружена в печени, скелетной мускулатуре, сердце. Повышение активности ИДГ является чувствительным показателем поражения паренхимы печени. Определяемая в сыворотке активность обусловлена цитоплазматическим НАДФ-зависимым печеночным ферментом. Это может наблюдаться при вирусных и токсических гепатитах, обтурационной желтухе, метастазах в печень и циррозе, гипоксии печени вследствие гемодинамических причин, поражении печени при бактериальных инфекциях, атрезии желчных протоков у новорожденных детей, инфекционном мононуклеозе. Также увеличение активности данного фермента может регистрироваться при тяжелом инфаркте легкого, миелолейкозе, мегалобластной анемии. Несмотря на то, что в миокарде содержится много активности ИДГ, при инфаркте миокарда не обнаруживается ее повышения, и значения в сыворотке находятся в пределах нормы; высвобождаемая активность митохондриальной ИДГ термолабильна и быстро выводится.

Нормальные величины значений активности фермента в сыворотке крови взрослых: 1,2–7,0 МЕ/л · 0,017 [0,02–0,12 мккат/л]; в крови из пуповины: значения в 2 раза выше таковых для взрослых.

Новорожденные: 4кратное повышение по сравнению со значениями для взрослых; 2 нед.:

снижение до верхних пределов значений для взрослых.

Каталаза Каталаза (КФ 1.11.1.6; Н2О2:Н2О2 – оксидоредуктаза) – фермент, катализирующий реакцию разложения пероксида водорода на воду и молекулярный кислород: 2 Н2О2 = О2 + 2Н2О. Каталаза представляет собой гемопротеин, простетической группой которого является гем, содержащий ион трехвалентного железа. Молекула каталазы состоит из четырех, повидимому, идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 кДа и имеет, соответственно, четыре простетические группы. Феррипротопорфириновые группы гема прочно связаны с белковой частью фермента – апоферментом и не отделяются от него при диализе. Оптимальная величина рН для каталазы находится в интервале значений 6,0–8,0. Каталаза широко распространена в тканях животных, в т.ч. человека, растений и в микроорганизмах (однако фермент полностью отсутствует у некоторых анаэробных микроорганизмов). В клетках каталаза локализуется в специальных органеллах — пероксисомах. Биологическая роль каталазы заключается в деградации пероксида водорода, образующейся в клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием пероксида водорода.

Уровень активности каталазы в норме: 22,6 ± 0,52 мкат/л (Мамонтова Н.С.;

Патент РФ RU2050005).

Генетически обусловленная недостаточность каталазы является одной из причин так называемой акаталазии – наследственного заболевания, клинически проявляющегося изъязвлением слизистой оболочки носа и ротовой полости, иногда резко выраженными атрофическими изменениями альвеолярных перегородок и выпадением зубов. Активность каталазы в эритроцитах остается постоянной при ряде заболеваний, однако при злокачественной и других макроцитарных анемиях увеличивается так называемый каталазный индекс (отношение величины каталазной активности определенного объема крови к количеству эритроцитов в этом объеме), имеющий существенное диагностическое значение. При злокачественных новообразованиях отмечается уменьшение активности каталазы в печени и почках, причем существует зависимость между величиной опухоли, скоростью ее роста и степенью уменьшения активности каталазы. Из некоторых опухолей выделены вещества – токсогормоны, которые при введении экспериментальным животным вызывают у них снижение активности каталазы в печени.

Методы определения активности каталазы основаны на регистрации образующегося в процессе реакции О2 (манометрическим или полярографическим методами) или на измерении текущей (спектрофотометрическим) или остаточной (перманганатометрическим, йодометрическим и другими титриметрическими методами) концентрации пероксида водорода.

Креатинкиназа Креатинкиназа или креатинфосфокиназа (КК; КФ 2.7.3.2.) катализирует обратимую реакцию фосфорилирования креатинина с участием АТР в результате чего образуются креатинфосфат и ADP. КК является димером состоящим из двух субъединиц, каждая с молекулярной массой около 40 кДа. Субъединицы В (от brain – мозговая) и М (от muscle – мышечная) закодированы в разных генах. Фермент существует в виде трех изоферментов: КК-ВВ (КК-1) – мозговой, КК–МВ (КК-2) – сердечный и КК-ММ (КК-3) – мышечный. КК-ВВ присутствует в значительных количествах в мозге, простате, желудке, легких, мочевом пузыре, уретре, плаценте, щитовидной железе. КК-МВ в основном находится в сердечной мышце (25–46 % от общей активности КК кардиомиоцита) и в небольшом количестве в скелетных мышцах (менее 5 % общей активности). КК-ММ присутствует в основном в клетках скелетных и сердечной мыщц. Активность КК-ММ в сыворотке составляет 94–96 % от общей активности КК, КК-МВ – 4–6 %, КК-ВВ – следы или активность не определяется.

Все три изофермента обнаружены в цитозоле клеток или связаны с миофибриллами. Обнаружена и четвертая митохондриальная форма креатинкиназы (КК-Mt), которая отличается от других форм иммунологически, а также по электрофоретической подвижности. Она локализована между внутренней и наружной митохондриальной мембранами, в сердце составляет до 15 % общей КК активности.

Активная КК может присутствовать в сыворотке в виде 2 макромолекулярных комплексов: макро КК тип1 и тип 2. Тип 1 – это КК-ВВ, связанная с IgG, или КК-ММ, связанная с IgA; тип 2 – это олигомеры КК-Mt.

Нормальная активность КК (общая) может варьировать в зависимости от метода: 10–195 МЕ/ л (Назаренко Г.И. и др., 2002).

Норма для изоферментов сыворотки крови: КК-ВВ – 0 %; КК-МВ – 0–3 %; КК-ММ – 97–100 %.

Общая КК повышается при многих заболеваниях: травмы, операции, инфаркт миокарда, уменьшение кровоснабжения мышц, миопатии, дерматомиозит, мышечные дистрофии, миокардиты, отравления, сопровождающиеся комой, гипотериоз, инфекционные болезни (например, брюшной тиф). Иногда небольшое увеличение отмечается при артритах, застойной сердечной деятельности, тахикардии, эмболии легочной артерии.

Активность КК в сыворотке, как правило, имеет обратную зависимость с тиреоидной функцией щитовидной железы. Около 60 % больных гипотериозом имеют уровень КК выше нормы с превышением верхней границы в среднем в 5 раз. Основной изофермент при этом КК-ММ, хотя у 13 % больных повышена и КК-МВ, что свидетельствует о вовлеченности в патологический процесс не только скелетных, но и сердечной мышцы.

В то же время у больных с гипертиреозом имеется тенденция к низким значениям активности КК в сыворотке.

При инфаркте миокарда регистрируемое повышение активности КК наблюдается уже в течение 3–6 ч после ангиозного приступа. Однако определение активности ранее 8 ч дает положительные результаты в 31 % случаев. Активность КК является достоверным тестом инфаркта миокарда, начиная с 8–10 ч после начала болевого приступа. Максимальный уровень ее достигается в течение 24 ч, и даже при обширном инфаркте активность КК может возвратиться к норме в течение последующих 48 ч. Относительное повышение активности КК при инфаркте миокарда выше, чем других ферментов. Наиболее информативно исследование активности КК в динамике – каждые 4–6 ч в течение суток.

Хотя активность КК при инфаркте миокарда является очень чувствительным тестом, однако, на него нельзя полагаться при однократном определении и отсутствии других показателей, т. к. повышение может быть вызвано и рядом других причин, отмеченных выше, а также употреблением алкоголя, интенсивной физической нагрузкой, состоянием щитовидной железы, отравлением снотворными средствами, введением некоторых лекарственных препаратов (клофитрат, карбеноксалон). Резкое повышение активности КК (более чем в 10 раз) возникает в 1–2-й день нарушения мозгового кровообращения, достигая максимума на 3-й день.

КК-ММ увеличивается в сыворотке при тех же состояниях, как и общая КК.

КК-МВ значительно увеличивается при инфаркте миокарда, определение изофермента имеет диагностическое значение, если общая активность фермента в сыворотке крови повышается более чем в 1,5 раза по сравнению с верхней границей нормы. Помимо инфаркта миокарда КК-МВ может незначительно возрастать при миокардитах, стенокардии, затяжной аритмии, шоке, тяжелых отравлениях.

КК-ВВ в сыворотке крови незначительно повышается при некоторых формах рака (легкого, кишечника, мочевого пузыря, предстательной железы), травме сердечной мышцы, заболеваниях соединительной ткани. При родах КК-ВВ может увеличиваться в сыворотке до 6 раз (источником являются матка и плацента). У новорожденных при родовой травме мозга активность КК-ВВ в сыворотке повышена.

Макро КК тип 1 обнаруживается в сыворотке взрослых при заболевании желудочно-кишечного тракта, аденоме, карциноме, повреждениях сердечной и скелетной мышц и в состоянии с высокой вероятностью летального исхода. Иногда макро КК тип 1 встречается у женщин старше 50 лет.

Макро КК тип 2 обнаруживается в сыворотке взрослых с тяжелой формой рака или болезни печени, а также у детей с поражением сердечной мышцы. Появление КК-Mt – плохой прогностический признак, среди таких больных высока смертность.

Существует три общепризнанных методических подхода для разделения изоферментов КК: электрофорез, хроматографические и иммунологические методы.

Электрофоретическим методом (на агаре, агарозе или ацетате целлюлозы) можно разделить фракции КК. Визуализация электрофоретических полос изоферментов проводится, как правило, с использованием НАДФН флуоресценции в ультрафиолетовой области спектра (360 нм).

Поэтому эта процедура достаточно трудоемкая и требует оснащения импортной техникой.

Ионообменной или абсорбционной хроматографией разделяют изоферменты КК на несколько фракций. Изоферменты КК как правило абсорбируются на геле, с которого затем элюируются буферами. Выпускаются специальные коммерческие миниколонки: метод простой и быстрый, основная трудность – разделение фракций при большом повышении количества КК-ММ в патологических случаях.

Иммунологические методы основаны на измерении активности КК в присутствии специфической антисыворотки, содержащей моноклональные или поликлональные антитела против М или В субъединиц. Коммерческие наборы, основанные на технике преципитации, позволяют выявлять ККМВ при существенном ее повышении с коэффициентом вариации 10–20 %, тем не менее, эти тесты выполняются быстро, как правило, не требуют специальной аппаратуры и могут использоваться индивидуально, что особенно удобно при экспресс-диагностике. Выпускаются коммерческие наборы для фотометрического определения КК-МВ, основанные на определении активности КК при ингибировании М-субъединицы. Нормы для процентного распределения активности изофермента КК-МВ в общей ККактивности в этом случае существенно отличаются от электрофоретического распределения.

Лактатдегидрогеназа Лактатдегидрогеназа (ЛДГ; КФ 1.1.1.27) катализирует обратимое восстановление пирувата до лактата, в качестве кофермента используется НАДН. ЛДГ имеет молекулярную массу около 134 кДа, это тетрамер, состоящий из двух субъединиц – М (muscle – мышечная) и Н (heart – сердечная). В сыворотке присутствуют 5 изоферментов, различающиеся составом субъединиц. В порядке снижения их электорофоретической подвижности (движения по направлению к аноду) их обозначают как ЛДГ-1 (Н4), ЛДГ – 2 (Н3М), ЛДГ –3 (Н2М2), ЛДГ-4 (Н1М3), ЛДГ-5 (М4). Избыток как пирувата, так и лактата, используемых в качестве субстрата, подавляет активность фермента, при этом эффект пирувата выше. Норма (варьирует в разных методах): 240–480 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002).

ЛДГ присутствует во всех клетках организма, это цитозольный фермент. В печени, сердце, почках, скелетной мышце и эритроцитах активность ЛДГ более чем в 500 раз выше, чем в сыворотке, поэтому повреждение любого из этих органов сопровождается увеличением ЛДГ в сыворотке. Повышение показателя имеет место при некрозе тканей, особенно при остром повреждении сердца, повреждении эритроцитов, почек, скелетных мышц, печени, легких и кожи. Значительное повышение сопровождает гемолитические анемии, связанные с дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты. Медленное повышение в течение 3–4 дней с последующим снижением за 5–7 дней может свидетельствовать об инфаркте миокарда (необходимо, однако, исключить инфаркт легкого, опухоль, мегабластную анемию). Повышение уровня ЛДГ характерно для острой фазы инфекционного гепатита, между тем при хронических заболеваниях печени активность фермента редко оказывается повышенной. Циррозы, обтурационные желтухи, различные заболевания почек и скелетных мышц, застойная сердечная недостаточность дают средние цифры активности. Незначительное повышение активности фермента отмечается при любых повреждениях клеток, сопровождающихся увеличением проницаемости мембран (инфаркт миокарда и легкого), при лейкозах, лимфомах, хронических гепатитах. Таким образом, общая активность ЛДГ в сыворотке крови не является специфическим тестом для определенной патологии. Поэтому необходимо разделять изоферменты ЛДГ и, затем, оценивать вклад каждого в общую активность, т.к. они органоспецифичны.

ЛДГ в моче может повышаться в 3–6 раз при хроническом гломерулонефрите, системной красной волчанке с поражением почек, диабетическом нефросклерозе, опухолях почек и мочевого пузыря. Однако определение ЛДГ в моче не практикуется из-за ингибирующего действия на фермент кислой среды, мочевины и некоторых короткоцепочечных пептидов мочи.

Нормальное соотношение изоферментов ЛДГ в сыворотке составляет: ЛДГ1 – 15–30 %; ЛДГ2 – 22–50 %; ЛДГ3 – 15–30 %; ЛДГ4 – 0–15 %;

ЛДГ5 – 0–15 %. Количество изоферментов можно определить с помощью электрофоретических, иммунологических, кинетических методов или путем хроматографии. Наиболее распространен метод электрофореза на геле агарозы или на ацетатцеллюлозных пленках. Наибольшей разделяющей способностью и чувствительностью обладает метод ионообменной хроматографии, он используется в качестве референтного по отношению к электрофорезу. Предложен также метод иммунопреципитации с использованием антител против всех изоферментов, содержащих М субъединицу (ЛДГ2–ЛДГ5). В этом случае активность этих изоферментов не проявляется, остается активной только ЛДГ1. Результаты определения ЛДГ1 этим методом тесно коррелируют с результатами электрофореза и хроматографии, а диагностическая специфичность метода для инфаркта миокарда составляет 94 %. Другим сравнительно новым метом выявления активности ЛДГ1 является использование смеси, подавляющей активность всех изоферментов, содержащих М субъединицу. Такой смесью является: 1,6 гексанедиол (700мМ), перхлорат натрия (825мМ) и хинидинтиоцианат (190мМ). Результаты также тесно коррелируют с данными электрофореза и иммуноингибирования.

ЛДГ1 наиболее быстро продвигается к аноду при электрофорезе, термостабилен, ингибируется высокими концентрациями пирувата и в меньшей степени мочевиной и оксалоацетатом. Реакция превращения лактата в пируват, катализируемая ЛДГ1, протекает в органах с преимущественно аэробным метаболизмом, где лактат является субстратом окисления.

Из него образуется пируват, который затем через ацетил-СоА окисляется до СО2 и Н2О, при этом энергия аккумулируется в виде молекул АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. ЛДГ1 присутствует в высоких концентрациях в сердце, почках, мозге, много ЛДГ1 в эритроцитах.

Поэтому недопустим гемолиз при определении активности ЛДГ1.

Поскольку ЛДГ может окислять также a-гидроксибутират до aоксибутирата (в этом случае принято говорить об a-гидроксибутиратдегидрогеназной активности (a-ГБДГ)), то в качестве аналога ЛДГ1 часто рекомендуется определение a-ГБДГ, хотя активность a-ГБДГ несколько выше, чем ЛДГ1, это связано с тем, что a-ГБДГ-активностью обладают все без исключения изоферменты ЛДГ.

При диагностике инфаркта миокарда увеличение активности ЛДГ является достоверным тестом в сроки от 12 до 32 часов после болевого приступа. Она остается повышенной в течение 8–14 дней. Однократное исследование ЛДГ1 обладает клинической специфичностью в отношении инфаркта миокарда в 66 % случаев, а определение ее в динамике (через каждые 4–6 часов в течение суток) – в 86 %. Если в сроки от 8 до 24 часов после приступа ангиозных болей нет нарастания активности ЛДГ (а также КК-МВ и АсАТ), то нет и инфаркта. У части больных наблюдается корреляция между уровнем ЛДГ и обширностью инфаркта. В некоторых случаях дополнительную информацию дает коэффициент ЛДГ1/ЛДГ2, который в норме составляет 0,6–0,7. При остром инфаркте миокарда он становится выше 1,0 и возвращается к норме через 2–3 недели.

ГБДГ при инфаркте миокарда повышается в те же временные интервлы, как ЛДГ достигает максимума на 2–3 день, и восстанавливается до нормы на 10–20 день.

Повышение ЛДГ1 отмечается также при опухолях репродуктивных органов: тератома, семинома яичка, дисгерминома яичника.

ЛДГ2, ЛДГ3 и ЛДГ4 обладают промежуточными свойствами. Активность этих изоферментов повышается при массивном разрушении тромбоцитов (эмболия легочной артерии, массивные гемотрансфузии) и вовлечении в патологический процесс лимфатической системы. При нелимфоцитарных лейкозах увеличивается активность ЛДГ3 и ЛДГ4, причем степень увеличения зависит от количества незрелых клеток. Увеличение ЛДГ3 иногда наблюдается при острых панкреатитах. Активность ЛДГ4 возрастает при поражении печени вирусного, токсического или травматического характера и обострении хронических гепатитов, в активную фазу ревматизма, при кардиосклерозе с нарушением гемодинамики, остром нефрите, при поражениях почек, опухолях печени, предстательной железы, шейки матки, молочной железы, кишечника, при тяжелых формах диабета.

ЛДГ 5 при электрофорезе продвигается к аноду медленнее других изоферментов, термолабилен, более чувствителен к ингибирующему влиянию мочевины и оксалоацетата и обладает самым малым сродством к aкетобутирату (в сравнении с другими изоферментами ЛДГ). Наибольшее содержание этого изофермента характерно для скелетных мышц, печени, кожи, слизистых оболочек, а также клеток некоторых злокачественных опухолей. Значительное увеличение содержания ЛДГ5 отмечается при травмах, воспалительных и дегенеративных заболеваниях мышц и многих болезнях печени (гепатиты, циррозы и др.). Онкологические заболевания (например лимфолейкозы) могут также сопровождаться увеличением ЛДГ5. Активность ЛДГ5 повышается в активную фазу ревматизма, глубоких поражениях почек, сопровождающихся их гипоксией, опухолях почек и отторжении пересаженной почки, а также при тяжелых формах диабета.

Лейцинаминопептидаза Лейцинаминопептидаза (ЛАП, КФ 3.4.11.1) лишь одна из нескольких внутриклеточных аминопептидаз, которой особенно богаты желчевыводящая система, поджелудочная железа и слизистая тонкой кишки. Теперь она называется аминопептидаза (цитозольная) там, где присутствует в высокой концентрации. ЛАП относительно специфична для заболеваний гепатобилиарной системы и обычно не повышается при поражении костей. ЛАП – более чувствительный показатель холедохолитиаза и местастазов в печень у больных без желтухи, чем ЩФ. Активность в сыворотке может повышаться под действием лекарств. Исследование фермента пропагандировалось, как показатель плацентофетальной целостности со снижением значений при дистрессе плода, однако недавно было показано, что масса фермента не повышается во время беременности, хотя его активность возрастает. Более того, полагают, что активность при беременности обусловлена иммунохимически отличной аминопептидазой, а не самой ЛАП. Высокий уровень в моче лейцинаминопептидазы свидетельствует о нежизнеспособности донорской почки. Референтные пределы: 15–40 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002).

Липаза Липаза (КФ 3.1.1.3) – фермент, катализирующий расщепление глицеридов на глицерин и высшие жирные кислоты. Уровень активности липазы в норме 0–190 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002).

Этот энзим в организме человека вырабатывается рядом органов и тканей, что позволяет различать липазу желудочного происхождения, поджелудочной железы, липазу легких, кишечного сока, лейкоцитов и др. Наиболее важной с клинической точки зрения является липаза поджелудочной железы. Панкреатическая липаза играет главную роль в переваривании жиров. Поскольку основным источником липазы является поджелудочная железа, при ее заболеваниях происходит значительный выброс фермента в циркулирующую кровь. Определение активности липазы в крови является наиболее информативным критерием диагностики острого панкреатита.

Существует ошибочное представление, что при остром панкреатите содержание липазы в крови увеличивается позже, чем амилазы, но остается повышенным более продолжительное время. На самом деле содержание липазы увеличивается и снижается параллельно повышению и снижению активности амилазы, но нормализация ее уровня происходит позже нормализации амилазы. Иногда уровень липазы в крови повышается раньше, чем увеличивается активность амилазы, и остается повышенным длительное время.

При остром панкреатите активность липазы в крови увеличивается в течение нескольких часов после острого приступа, достигая максимума через 12–24 ч (увеличивается до 200 раз), и остается повышенной в течение 10–12 дней. Прогноз заболевания является плохим, если уровень липазы в крови повышается в 10 раз и более и не снижается до 3-кратного превышения нормы в течение ближайших нескольких дней. Диагностическая чувствительность липазы в сыворотке крови для острого панкреатита составляет 86 %, специфичность – 99 %. Одновременное определение уровня альфа-амилазы (кровь и моча) и липазы – основа диагностики острого панкреатита. Повышение обоих или одного из ферментов выявляется у 98 % больных с острым панкреатитом.

В отличие от амилазы активность липазы не повышается при паротите, внематочной беременности и раке легких. Отечная форма острого панкреатита, как правило, не сопровождается повышением активности липазы; жировой панкреонекроз характеризуется выраженным повышением активности липазы, сохраняемым до 2 недель; геморрагический панкреонекроз сопровождается лишь кратковременным повышением активности липазы в 3,5 раза по сравнению с нормальным уровнем на 3-и–5-е сутки заболевания. При гнойном панкреатите повышения активности липазы в крови обычно не выявляется. Иногда повышение активности липазы отмечается у больных раком поджелудочной железы, хроническим панкреатитом, при наличии кисты в поджелудочной железе.

Активность липазы в крови повышается при инфаркте кишки, перитоните, желчной колике, при разрушении жировой ткани – костных переломах, ранении мягких тканей, после операций, при раке молочной железы. Гиперлипаземия при уремии и острой почечной недостаточности является следствием застоя в поджелудочной железе.

5-Нуклеотидаза 5-Нуклеотидаза (5'-рибонуклеотид – фосфогидролаза; КФ 3.1.3.5) катализирует гидролиз только нуклеотид-5-фосфатов. Фермент распространен во многих тканях организма (печень, мозг, мышцы, почки, легкие, щитовидная железа, аорта). В печени фермент присутствует в желчных канальцах, синусах и клетках Купфера. Уровень активности 5-нуклеотидазы в сыворотке в норме 2-17 МЕ/л (Назаренко Г.И. и др., 2002). Возрастание активности 5-нуклеотидазы происходит параллельно активности щелочной фосфатазы при холестазах любой локализации, но данный фермент более чувствителен по отношению к первичному и вторичному билиарному циррозу, а также к хроническому активному гепатиту. Главное отличие 5нуклеотидазы от щелочной фосфатазы: отсутствие реакции на костные заболевания. Считается, что 5-нуклеотидаза является специфической «желчной» фосфатазой.

Сорбитолдегидрогеназа Сорбитолдегидрогеназа (полиолдегидрогеназа, L-идитол, НАД+оксидоредуктаза, СДГ, КФ 1.1.1.14) катализирует реакцию окисления сорбитола до фруктозы, при этом происходит восстановление НАД.

В норме сыворотка содержит лишь следы фермента (0–0,9 МЕ/л. См. Назаренко Г.И. и др., 2002). Фермент органоспецифичен для печени и почек, в других тканях активность незначительна (в селезенке – 1/10, в сердце – менее 1/50 активности в печени). СДГ содержится преимущественно в цитоплазме гепатоцитов, поэтому повышение активности фермента специфично отражает поражение печени. Активность СДГ увеличивается еще в дожелтушный период вирусного гепатита и достигает максимальных величин в первые 10 суток желтушного периода острого гепатита (5–20 норм).

Нормализуется активность СДГ быстрее, чем АлАТ, но высокая специфичность фермента выдвигает его на первое место при постановке диагноза вирусного гепатита. При хронических гепатитах и циррозе печени активность СДГ возрастает в стадии обострения процесса. В первые 4 дня обтурационной желтухи активность СДГ возрастает незначительно (в 2– 3 раза). Изолированное исследование активности СДГ не проводится, т.к.

нормальные показатели не исключают поражения печени. Однако определение активности данного фермента в сочетании с другими показателями дает ценную информацию.

Супероксиддисмутаза Супероксиддисмутаза (супероксид'супероксид оксидоредуктаза, СОД, КФ 1.15.1.1.) фермент (металлопротеин), катализирующий реакцию превращения двух супероксидных радикалов друг с другом, превращая их в менее токсичный пероксид водорода и кислород. Различают несколько изоформ СОД, отличающихся по наличию кофакторов (металлов – медь, цинк, марганец, железо). Содержание в эритроцитах – 1092–1817 Ед/г Hb (Назаренко Г.И. и др., 2002).

При инфаркте миокарда СОД защищает сердечную мышцу от действия свободных радикалов, образующихся при ишемии, при этом в сыворотке крови при инфаркте миокарда регистрируется высокая активность фермента. Степень повышения СОД обратно пропорциональна деятельности левого желудочка, что используется как маркер для оценки повреждения миокарда и при мышечной дистрофии.

Обнаружение больших концентраций СОД в организме возможно при различных заболеваниях: ишемии органов, нефропатии, заболеваниях, сопровождающихся воспалением (ревматоидный артрит). Высокий уровень СОД у септических больных является ранним маркером развития у них респираторного дистресс-синдрома. Возможно значительное увеличение активности СОД при синдроме Дауна (трисомия по 21 хромосоме), поскольку ген супероксиддисмутазы – Cu/Zn SOD располагается в 21 хромосоме. При данном заболевании и при старении, в том числе раннем, избыток СОД приводит к накоплению пероксида водорода в мозговой ткани. При заболеваниях почек уровень СОД возрастает на усиленное образование свободных радикалов, после гемодиализа активность нормализуется. Уровень активности фермента в сперме связан с подвижностью сперматозоидов; снижение активности СОД приводит к нарушению подвижности данных клеток. Уровень СОД снижен у больных с ослабленной иммунной системой, что делает таких больных чувствительными к респираторным инфекциям с развитием пневмонии.

Уровень эритроцитарной СОД повышен у больных гепатитом, при различных формах лейкемии. Эритроцитарная СОД бывает низкой при ревматоидном артрите; по ее уровню можно судить об эффективности проводимой терапии. Назначение больным с ревматоидном артритом препаратов СОД приводит к ремиссии заболевания.

Фосфатазы. Щелочная фосфатаза Фосфатазы – ферменты, катализирующие разрыв сложноэфирной связи в моноэфирах фосфорной кислоты с образованием свободного ортофосфата (аниона ортофосфорной кислоты); относятся к классу гидролаз.

Щелочная фосфатаза (фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты, ЩФ; КФ 3.1.3.1) широко распространена в тканях человека, особенно в слизистой оболочке кишечника, остеобластах, стенках желчных протоков печени, плаценте и лактирующей молочной железе. Она катализирует отщепление фосфорной кислоты от ее органических соединений;

название получила в связи с тем, что оптимум рН щелочной фосфатазы лежит в щелочной среде (рН 8,6–10,1). Фермент расположен на клеточной мембране и принимает участие в транспорте фосфора. Двухвалентные ионы, такие как Mg2+, Co2+, Mn2+, являются активаторами фермента, Zn2+ входит в структуру активного центра. Фосфаты, бораты, оксалаты подавляют активность всех форм фермента. В сыворотке несколько изоферментов ЩФ, семь из которых имеют наибольшее клинико-диагностическое значение. Уровень активности щелочной фосфатазы в норме представлен в таблице 3. Для диагностических целей чаще всего проводят определение активности костной и печеночной форм фосфатазы.

–  –  –

1. Костная ЩФ. В кости ЩФ секретируется остеобластами, ее роль в формировании кости до конца не установлена. Предполагают, что она участвует в созревании матрикса и его минерализации. Специфичность костной ЩФ, а также такие ее характеристики, как время полужизни в крови, составляющее 1–2 дня, отсутствие процессов с ее участием в печени, выделение из крови с помощью почек, приближают костную ЩФ к идеальным маркерам активности остеобластов. Костная ЩФ наиболее термолабильна, инактивируется при 55 С. Синтез костной ЩФ возрастает в процессе дифференцировки остеобластов при ускоренном формировании кости.

Значительное увеличение ее активности в сыворотке крови наблюдается при повышенной деятельности остеобластов: рост костей (у детей активность выше, чем у взрослых; увеличивается она в последний триместр беременности), возобновлении движений после длительного постельного режима, переломах, деформирующем остите, рахите. Это характерно и для процессов остеомаляции (злокачественные опухоли костей, миелома), а также костного туберкулеза и лейкозов. Повышение активности костной ЩФ при рахите отмечается чаще, чем увеличение содержания неорганического фосфора; при выздоровлении активность ЩФ нормализуется позднее, чем уровень кальция и фосфора, примерно в те же сроки, что и рентгенологические показатели. Первичный и вторичный гиперпаратиреоз может сопровождаться повышением активности ЩФ, что объясняется вовлеченностью метаболизма костной ткани в патологический процесс при тиреотоксикозе.

Интерпретация данных исследований костной ЩФ, однако, бывает затруднена, что связано, с одной стороны, с половыми и возрастными особенностями ее активности, а, с другой стороны, с недостаточной специфичностью методов, используемых для ее определения (имеется в виду тартратрезистентная фракция ЩФ). Наиболее адекватными методами исследования костной ЩФ в настоящее время считаются радиоиммунный и иммуноферментный анализы с использованием моноклональных антител.

2. Печеночная ЩФ. Представлена двумя изоферментами. Первый повышается в сыворотке крови при застое в печени и сниженной элиминации фермента с желчью, его повышение происходит также во второй половине беременности. Это основной фермент при патологии гепатобилиарного тракта. Второй изофермент повышается при гепатоцеллюлярной патологии – вирусные гепатиты, желтая дистрофия печени, циррозы. Это увеличение, однако, значительно уступает повышению активности аминотрансфераз. У 1/3 желтушных больных с циррозом печени выявлено увеличение активности ЩФ. Повышение активности ЩФ наблюдается у 20 % больных первичным раком печени и при метастазах в печень. Резко возрастает ее активность при отравлениях алкоголем на фоне хронического алкоголизма. Она может повышаться при лекарственных назначениях, проявляющих гепатотоксический эффект (тетрациклин, парацетамол, фенацетин, 6-меркаптопурин, салицилаты и др.).

3. ЩФ желчи – фермент холестаза. (cholestasis; греч. chole (желчь), stasis (стояние)) – недостаточность выделения желчи, обусловленная нарушением ее выработки печеночными клетками (внутрипеченочный холестаз) или прекращением тока желчи по желчным протокам (внепеченочный холестаз). Фермент высвобождается из поврежденных желчных протоков. Самые высокие цифры сывороточной активности отмечаются при обтурационных желтухах, когда задержка экскреции фермента с желчью приводит к тому, что он вновь поступает в кровь. Немаловажен и индуктивный синтез изофермента в желчных канальцах. У женщин, принимающих противозачаточные препараты, содержащие эстроген и прогестерон, может развиться холестатическая желтуха и повышается активность ЩФ.

По клинической чувствительности и специфичности в отношении обтурации тест уступает таким маркерам холестаза, как ГГТ и 5’-нуклеотидаза.

4. Кишечная ЩФ. Синтезируется энтероцитами, поступает в просвет тонкого кишечника и частично всасывается в кровь. Вклад ее в общую активность ЩФ невелик. Ее активность может быть увеличена у лиц с I или III группой крови, особенно после приема пищи, при заболеваниях кишечника, сопровождающихся диареей.

5. Почечная ЩФ. Частично всасывается в кровь, но в основном, экскретируется с мочой. Тест используется в диагностике заболеваний почек (гломерулонефрит, пиелонефрит, нефропатии).

6. Плацентарная ЩФ. Появляется в сыворотке крови при беременности. Самое большое ее содержание отмечается в третьем триместре. Это наиболее термостабильный изофермент ЩФ. Очень высокие цифры активности ЩФ наблюдаются у женщин с преэк-лампсией, что является следствием повреждения плаценты. Низкая активность ЩФ у беременных говорит о недостаточности развития плаценты.

7. Неидентифицированные изоферменты ЩФ (так называемые изоферменты Regan или Nagao) опухолевого происхождения (наиболее часто определяются при раке легкого). Термостабильность, электрофоретическая подвижность и иммунологические характеристики близки к таковым для плацентарного изофермента.

Сывороточная активность ЩФ может снижаться из-за генетического блока в синтезе какого-либо из ее изоферментов, а также при гипопаратиреозе, гиповитаминозе С, накоплении радиоактивных веществ в костях.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ И.В. Ставишенко, В.А. Мухин КСИЛОТРОФНЫЕ МАКРОМИUЕТЫ ЮГАИСКОГО ЗАПОВЕДНИКА Екатеринбург УДК 582.287 : 581.524 (571.122) ББК 28.591 · 28.58 с 76 ~BN 5-88464-04...»

«Федеральное агентство научных организаций Геологический институт РАН Министерство образования и науки РФ Липецкий государственный педагогический университет Воронежский государственный университет Ю.А. Лаврушин, А.Н. Бессуднов, Е.А. Спиридонова, Н.П. Кураленко, Р.И. Недумов, Г.В. Холм...»

«1 Содержание 1 Введение.. 3 2 Темы, выносимые на самостоятельное изучение. 5 3 Тема 1.. 5 4 Тема 2.. 8 5 Тема 3.. 10 6 Тема 4.. 12 7 Тема 5.. 14 8 Тема 6.. 15 9 Тема 7.. 19 10 Тема 8.. 21 11 Тема 9.. 23 12 Тема 10.. 25 13 Тема 11.. 27 14 Тема 12.. 30 15 Тема 13.. 32 1 Введение В ходе занятий студенты должны познакомиться...»

«Journal of Siberian Federal University. Biology 4 (2010 3) 351-371 ~~~ УДК 581.93: 630*181(235.222) Флора высокогорных лесов верховий р. Актру (Северо-Чуйский хребет, Центральный Алтай) Е.Е. Тимошок, С.Н. Скор...»

«ФЕДОРОВЫХ Юлия Викторовна ТЕХНОЛОГИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КРУПНОЙ ФОРМЫ ЕВРОАЗИАТСКОГО ОКУНЯ В ИНДУСТРИАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства АВТОРЕФЕРАТ ди...»

«КАТАЛОГ ХРИЗОТИЛЦЕМЕНТНЫЕ ИЗДЕЛИЯ И КОМПЛЕКТУЮЩИЕ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ СООРУЖЕНИИ СТРОИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ апрель 2015 Каталог "Хризотилцементные изделия и комплектующие, применяемые при сооружении строительных объек тов" представляет разнообразные конструктивные решения для проектирова...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ (Росрыболовство) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ КАСПИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЫБНОГО ХОЗЯЙСТВА (ФГУП "КАСПНИРХ") МАТЕРИАЛЫ, ОБОСНОВЫВАЮЩИЕ ОБЪЕМЫ ОБЩИХ ДОПУСТИМЫХ УЛОВОВ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕ...»

«СОКОЛОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕИНАЗ ПОЗДНЕЙ ФАЗЫ РОСТА BACILLUS INTERMEDIUS 3-19 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2006 Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ГОУВПО "Казанский государственный университет...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Данный курс призван помочь осознать учащимся, что с развитием прогресса мир не становится безопаснее, а человечество пока не в силах ликвидировать ни одну из глобальных угроз своему существованию, но в то же время может и должно попытаться предотвратить опасность их возникновения.Ц...»

«УДК 631.5 Содержание тяжелых металлов Pb, Ni, Zn, Cu, Mn, Zr, Cr, Co и Sn в почвах Центральной зоны Республики Беларусь Позняк С.С. Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова...»

«АСТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ № 4 (26) 2013. с. 17-36. МЕТОДОЛОГИЧЕСКАЯ ИНТЕГРАЦИЯ СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ГЕОГРАФИИ, ГЕОЭКОЛОГИИ И ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ В РЕШЕНИИ ПРОБЛЕМ С...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, 2 Экологические проблемы в животноводстве УДК 636:591.5 ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕХНОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВЕДЕНИИ ЖИВОТНОВОДСТВА В ЭКОЛОГИЧЕСКИ НЕБЛАГОПОЛУЧНЫХ РЕГИОНАХ Э.Б. МИРЗОЕВ Рассматривается методология оценки воздействия техногенных факторов н...»

«Скрябина Дария Сергеевна СОСТОЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ЖЕЛЕЗА В МЕРЗЛОТНО-ТАЕЖНЫХ ПОЧВАХ Специальность 03.02.13 почвоведение Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры...»

«2013 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Сер. 3 Вып. 2 БОТАНИКА УДК 579.26 А. Л. Панин, Е. А. Богумильчик, А. Н. Шаров, Д. Ю. Власов, М. С. Зеленская, А. В. Толстиков, Ш. Б. Тешебаев, Г. Я. Ценева, Л. А. Краева, В. Б. Сбойчак...»

«Отчетная конференция по программе фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" ПРОГРАММА 18 – 26 апреля 2012 г. г. Москва Место проведения конференции...»

«"УТВЕРЖДАЮ" Первый проректор по учебной работе ФГБОУ ВПО "Алтайский государственный университет" Е.С. Аничкин "" _ 2014 г. ПРОГРАММА вступительного испытания для поступающих в магистратуру биологического факультета Направление 022000.68 – Экология и природопользование (магистратура, магистерские программы "Агроэко...»

«ЩЕРБИНИН Дмитрий Сергеевич КОНСТРУИРОВАНИЕ АПТАМЕРОВ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ 03.01.09 – математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Мос...»

«Международная Биополитическая Организация Санкт-Петербургский научный центр Российской академии наук Объединенный научный Совет "Экология и природные ресурсы" Комитет по природопользованию, охране окружающей среды и обеспечению экологической безопасности Комитет по науке...»

«УДК 339 (075) ББК 65 247 Фонд оценочных средств по дисциплине "Биология" для направления подготовки 38.02.04 "Коммерция (по отраслям)" под общей редакцией Шаихова А.А. – Махачкала: Типография ДГИНХ, 2014.-29с. Ф...»

«Ержанов Н.Т. Инвентаризация флоры и фауны различных районов Центрального Казахстана и оценка их современного состояния / Н.Т.Ержанов, Х.А.Исенов, Г.Т.Картбаева // Актуальные проблемы экологии = Экологияны зекті мселелері: Ма...»

«16_ 1480041 АРБИТРАЖНЫЙ СУД ГОРОДА МОСКВЫ 115191, г.Москва, у л. Большая Ту льская, д. 17 http://www.msk.arbit r.ru ИМЕНЕМ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РЕШЕНИЕ г. Москва Дело № А40-61468/10-16-507 10.02.2011 г. Резолютивная часть решения объявлена 03.02.2011 г. Полный текст решения изготовлен 10.02.2011 г. Арбитражный суд города М...»

«ПАРАЗИТОЛОГИЯ, 44, 3, 2010 ЮБИЛЕИ И ДА ТЫ К ЮБИЛЕЙНЫМ ДАТАМ НАТАЛИИ АЛЕКСАНДРОВНЫ ФИЛИППОВОЙ В текущем году в биографии Наталии Александровны Филипповой, заместителя главного редактора журнала Паразитология, доктора биологических наук, главного научного сотрудника Зоологического института РАН, пересекаются т...»

«Федеральное агентство по рыболовству Федеральное государственное унитарное предприятие Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ РАЦИОНАЛЬНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВОДНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ РЕСУРСО...»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.