WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ И ФИЗИОЛОГИИ

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ПАШНИНА

Ирина Александровна

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ ПРИ АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

Черешнев Валерий Александрович академик РАН, доктор медицинских наук, профессор Тузанкина Ирина Александровна доктор медицинских наук, профессор Екатеринбург – 2015

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунологические аспекты формирования аутоиммунной патологии соединительной ткани

1.2. Популяционный состав лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии

1.3. Маркеры активации лимфоцитов, их экспрессия при аутоиммунной патологии

1.4. Экспрессия маркеров активации лимфоцитов при стимуляции in vitro....... 47 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ



2.1. Исследованные группы

2.2. Методы исследования, использованные в работе

2.2.1. Методы проточной цитометрии

2.2.2. Методы серологических исследований

2.2.3. Методы статистического анализа данных

ГЛАВА 3. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ У ДЕТЕЙ С

АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

3.1. Гуморальные параметры иммунитета

3.2. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови.................. 92 3.2.1. Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции

3.2.2. В-лимфоциты и их субпопуляции

3.2.3. Натуральные киллеры и их субпопуляции

3.3. Спонтанная экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической крови

3.3.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах

3.3.2. Экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах

3.3.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах

3.3.4. Экспрессия CD95 на Т-лимфоцитах

3.3.5. Экспрессия HLA-DR на Т-лимфоцитах

3.4. Экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической крови при стимуляции in vitro

3.4.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro................ 129 3.4.2. Экспрессии CD25 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro............... 136 3.4.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro................ 144

3.5. Резюме

ГЛАВА 4. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ У БОЛЬНЫХ С

РАЗЛИЧНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ЮВЕНИЛЬНОГО ИДИОПАТИЧЕСКОГО

АРТРИТА

4.1. Гуморальные параметры иммунитета

4.2. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови................ 157 4.2.1. Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, Т-лимфоциты и их субпопуляции

4.2.2. В-лимфоциты и их субпопуляции

4.2.3. Натуральные киллеры и их субпопуляции

4.3. Спонтанная экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической крови

4.3.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах

4.3.2. Экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах

4.3.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах

4.3.4. Экспрессия CD95 на Т-лимфоцитах

3.3.1. Экспрессия HLA-DR на Т-лимфоцитах

4.4. Экспрессия маркеров активации Т-лимфоцитов периферической крови при стимуляции in vitro

4.4.1. Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro................ 176 4.4.2. Экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro................ 181 4.4.3. Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах при стимуляции in vitro................ 186

4.5. Резюме

ГЛАВА 5. МНОГОМЕРНЫЙ СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПАРАМЕТРОВ

ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ

КРОВИ

5.1. Оценка взаимосвязей между параметрами функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией, хроническим гепатитом С и условно здоровых детей методом анализа главных компонент

5.2. Оценка различий между исследованными группами и информативности параметров функционального состояния лимфоцитов периферической крови методом дискриминантного анализа

5.2.1. Дискриминантный анализ результатов исследования больных с аутоиммунной патологией, хроническим гепатитом С и условно здоровых детей

5.2.2. Дискриминантный анализ результатов исследования больных с различной активностью ювенильного идиопатического артрита

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

Аутоиммунная патология является частой причиной нарушения качества жизни пациентов и их инвалидизации. Распространенность аутоиммунных заболеваний соединительной ткани, в медицинской практике часто называемых ревматическими, растет в последние десятилетия, в том числе и среди детского населения Наиболее часто встречающимся аутоиммуноаутовоспалительным заболеванием у детей является ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) – его распространенность по некоторым оценкам может доходить до 1 на 1000 детского населения [152, 185, 309]. Реактивный артрит (РеА) – развивающееся в ответ на внесуставную инфекцию асептическое воспалительное заболевание суставов, по клиническим проявлениям является близким к ЮИА.

Его распространенность в России у детей до 18 лет, по данным А.А. Баранова и Е.И. Алексеевой (2009) составляет 86,9 на 100 тыс. детского населения [1]. РеА так же, как и ЮИА, имеет в своем патогенезе аутоиммунные механизмы воспаления, существует проблема дифференциальной диагностики этих двух заболеваний [1]. Системные аутоиммунные заболевания у детей, как и у взрослых, встречаются намного реже аутоиммунных поражений суставов.

Распространенность системной красной волчанки (СКВ) у детей составляет 9,38случая на 100 тыс. детского населения [188]. Распространенность склеродермии в России колеблется от 0,6 до 19,0 на 1 млн. населения в год, доля детей среди всех больных составляет около 3% [16].

Для дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний чаще всего используется определение аутоантител [32]. Достаточно хорошо изучен спектр аутоантител, характерных для СКВ, менее исследованы антитела, встречающиеся при локализованной форме ювенильной склеродермии.

Аутоантитела - маркеры ЮИА, по сути, отсутствуют, т.к. распространенность ревматоидного фактора и антител к цитруллинированным пептидам, в отличие от ревматоидного артрита взрослых, крайне низка, а антинуклеарные антитела неспецифичны для этого заболевания [1, 183, 253]. Не менее серьезную проблему представляет собой мониторинг состояния больного и оценка эффективности терапии. Чаще всего для этой цели используется определение скорости оседания эритроцитов и концентрации С-реактивного белка, однако, эти лабораторные методы далеко не всегда коррелируют с активностью воспалительного процесса при ревматической патологии [38]. В связи с этим, чрезвычайно актуален поиск информативных лабораторных тестов для дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний соединительной ткани у детей и для контроля за состоянием больных.

Несовершенство лабораторной диагностики аутоиммунной патологии, не в последнюю очередь, связано с тем, что этиология и патогенез аутоиммунных заболеваний в настоящее время не вполне ясны. Обсуждается роль наследственных факторов в их возникновении, участие различных триггерных агентов, экологических и гигиенических факторов Патогенез [296].

аутоиммунных нарушений включает в себя различные изменения в иммунной системе. Большое значение придается балансу провоспалительных факторов иммунной системы и систем регуляции иммунного ответа [357]. Пристальное внимание приковано к лимфоцитам, как центральным клеткам иммунной системы, осуществляющим регуляцию ее функций [57].





Большое число исследований посвящено регуляторным Т-клеткам и другим субпопуляциям лимфоцитов, участвующих в регуляции функций иммунной системы при аутоиммунной патологии [242, 325, 400]. Однако результаты этих работ, зачастую, противоречивы: некоторые авторы сообщают о снижении численности супрессорных популяций, другие, наоборот, - об их повышении при одних и тех же аутоиммунных заболеваниях [48, 128, 325]. Рядом авторов исследована экспрессия различных маркеров активации Т-лимфоцитов как характеристика функционального состояния иммунокомпетентных клеток при аутоиммунной патологии. Тем не менее, в литературных источниках приводятся противоречивые сведения, как о снижении, так и о повышении экспрессии различных активационных маркеров при одном и том же аутоиммунном заболевании Кроме того, большинство исследований [67, 93, 119].

субпопуляционного состава и маркеров активации лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии соединительной ткани, проведено у взрослых больных с СКВ и ревматоидным артритом [68, 99, 135, 157]. Функциональному состоянию лимфоцитов при аутоиммунной патологии у детей посвящены лишь немногочисленные работы, которых недостаточно для полноценного понимания роли этих клеток в патогенезе аутоиммунных нарушений у пациентов детского возраста.

В клинической практике при исследовании активации лимфоцитов, чаще всего ограничиваются оценкой экспрессии CD25 и HLA-DR на Т-клетках [2]. За гранью внимания остаются другие активационные маркеры, кроме того, практически не используются методы стимуляции клеток. Спонтанный уровень экспрессии маркеров активации, зачастую, составляет лишь несколько процентов или даже равен нулю [22, 382], тогда как стимуляция позволяет выявить как повышение, так и снижение экспрессии лимфоцитарных рецепторов в ответ на внешний стимул при патологии. Стимулированная экспрессия активационных маркеров лимфоцитов при аутоиммунной патологии исследована в значительно меньшей степени, чем спонтанная, особенно это касается пациентов детского возраста.

Таким образом, литературные данные о спонтанной и стимулированной экспрессии маркеров активации лимфоцитов при аутоиммунной патологии у детей недостаточны для полноценного понимания роли клеточной активации в развитии аутоиммунных реакций. Исследование функционального состояния лимфоцитов периферической крови при аутоиммунных заболеваниях у пациентов детского возраста должно способствовать как пониманию патогенеза этих состояний, так и разработке новых, более информативных и эффективных методов их диагностики.

Целью исследования явилась комплексная оценка функционального состояния лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии у детей.

Задачи исследования:

Оценить информативность определения количества и соотношения основных 1.

популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови (Т-, В- и NKклеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) для диагностики аутоиммунной патологии у пациентов детского возраста.

Охарактеризовать спонтанный уровень маркеров активации Т-лимфоцитов 2.

CD38, CD95, HLA-DR в периферической крови при CD69, CD25, аутоиммунной патологии у детей.

Проанализировать характер реакции Т-лимфоцитов периферической крови 3.

на стимуляцию in vitro фитогемагглютинином, антителами к CD3, антителами к CD3 в сочетании с антителами к CD28 при аутоиммунной патологии у детей.

Оценить информативность совокупного определения спонтанной и 4.

стимулированной экспрессии маркеров активации CD69, CD25, CD38 в общем пуле Т-лимфоцитов и их отдельного определения на Т-хелперах и цитотоксических Т-клетках.

Провести сравнительный анализ функционального состояния лимфоцитов 5.

периферической крови у детей с аутоиммунной патологией, с хроническим инфекционным процессом (вирусный гепатит С) и условно здоровых детей.

Оценить функциональное состояние лимфоцитов периферической крови при 6.

различной активности аутоиммунного процесса на примере ювенильного идиопатического артрита.

Методология и методы исследования. Проведено исследование функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией соединительной ткани (системная красная волчанка, ювенильная склеродермия, ювенильный идиопатический артрит, реактивный артрит) в активной стадии заболевания по сравнению с условно здоровыми детьми и больными с хроническим вирусным гепатитом С. Оценено функциональное состояние лимфоцитов периферической крови при различной активности аутоиммунного процесса на примере ювенильного идиопатического артрита.

Для оценки функционального состояния лимфоцитов при аутоиммунной патологии у детей применен комплекс иммунологических методов исследования.

Проведена оценка субпопуляционного состава и экспрессии маркеров активации лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии. Экспрессия активационных маркеров Т-лимфоцитов исследована в спонтанном и стимулированном вариантах, стимуляция клеток проводилась in vitro с помощью различных индукторов (фитогемагглютинином, антителами к CD3, антителами CD3 в сочетании с антителами к CD28).

В диссертационном исследовании также использованы серологические методы, включавшие определение титра антинуклеарного фактора для оценки уровня аутоантител и концентрации С-реактивного белка как характеристики интенсивности воспалительного процесса.

Работа проведена в соответствии с принципами доказательной медицины и одобрена Локальным этическим комитетом Государственного Бюджетного учреждения Свердловской области «Областная детская клиническая больница №1».

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.

Достоверность результатов исследования обеспечена обоснованностью исходных теоретических позиций, достаточным количеством пациентов и формированием групп сравнения, использованием адекватных и апробированных лабораторных методов и сертифицированных наборов реагентов, воспроизводимостью результатов, применением современных методов и компьютерных программ статистического анализа полученных данных.

Основные результаты работы доложены и обсуждены на различных научных форумах международного, российского и регионального уровней: I Объединенный научно-практический форум детских врачей, Орел, 2008; II и III Объединенные иммунологические Форумы, СПб, 2008, Н. Новгород, 2013; I, II Конгрессы педиатров Урала с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Екатеринбург, 2008, 2012; III, IV, VI, VII, VIII, IX, X Российские конференции с международным участием «Иммунологические чтения в г.

Челябинске», Челябинск, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015; XIII и XIV Всероссийские научные форумы с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2009, 2011; 14th International Congress of Immunology, Cobe, Japan, 2010; VII, IX, X Российские конференции иммунологов Урала, Архангельск 2009; Челябинск, 2011; Тюмень, 2012; III Московская Международная научнопрактическая конференция «Иммунофизиология. Аутоиммунитет в норме и патологии и вопросы предиктивно-превентивной медицины», Москва, 2012; II International congress on Controversies in rheumatology & autoimmunity, Budapest, Hungary, 2013; Евразийский конгресс с международным участием «Медицина, фармация и общественное здоровье», Екатеринбург, 2013; Научно-практическая школа с международным участием «Иммунология в клинической практике», г.

Красноярск, 2013, 16th Asia Pacific League of Association for Rheumatology Congress «Sustanable Rheumatology in Asia», Cebu, Philippines, 2014; Научнопрактическая конференция «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и цитокинововй регуляции», г. Санкт-Петербург, 2014;

Российский научный форум на Урале с международным участием, г.

Екатеринбург, 2014; Пермский научный форум, Пермь, 2015.

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Автором лично проведен научноинформационный поиск и анализ литературных данных по проблематике диссертационной работы; разработан дизайн исследования, выполнено 97% лабораторных тестов, включая этапы пробоподготовки, проведения исследований и оценки результатов (серологические тесты, составившие 3% от всего объема лабораторных исследований, выполнены совместно с младшим научным сотрудником лаборатории иммунологии воспаления ИИФ УрО РАН Криволаповой И.М.). Статистический анализ первичных данных, интерпретация полученных результатов, написание глав диссертации выполнен лично диссертантом. Публикации по материалам диссертации подготовлены лично автором и в соавторстве.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменения количества и соотношения основных популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови (Т-, В- и NK-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) при аутоиммунной патологии у детей клинически не значимы.

2. Стимуляция лимфоцитов периферической крови различными агентами in vitro позволяет выявить особенности экспрессии маркеров активации, которые не проявляются при исследовании спонтанной экспрессии этих молекул.

3. Изменения функционального состояния Т-лимфоцитов при реактивном артрите аналогичны таковым при аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, ювенильная склеродермия, ювенильный идиопатический артрит), что свидетельствует об общности их патогенетических механизмов.

4. Клиническая ремиссия ювенильного идиопатического артрита не сопровождается восстановлением функционального состояния лимфоцитов периферической крови, что может свидетельствовать о сохраняющейся активности патологического процесса.

Научная новизна исследования Впервые дана комплексная характеристика функционального состояния лимфоцитов периферической крови у детей с аутоиммунной патологией соединительной ткани, включающая определение субпопуляционного состава лимфоцитов и оценку экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов. Доказана малая информативность определения основных популяций и субпопуляций лимфоцитов (Т-, В- и NK-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) как для дифференциации между аутоиммунной патологией и физиологической нормой, так и для оценки восстановления функционирования иммунной системы при ремиссии аутоиммунного заболевания. Выявлено снижение количества субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови, обладающих способностью к негативной регуляции функционирования иммунной системы: регуляторных Тклеток и Т-натуральных киллеров. Снижение численности этих субпопуляций при аутоиммунной патологии было устойчивым и, как показано на примере ювенильного идиопатического артрита, не нивелировалось даже при развитии стойкой длительной ремиссии заболевания.

Впервые у детей с ревматическими заболеваниями проведено исследование экспрессии активационных маркеров Т-лимфоцитов, включающее определение их уровня в периферической крови и уровня при инкубации in vitro – спонтанного и стимулированного различными агентами. Это позволило получить характеристику функционального состояния Т-лимфоцитов с оценкой их реактивности в ответ на стимуляторы различной природы и наличия резервных возможностей клеток. Разработана схема изменения при стимуляции in vitro количества лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры, в зависимости от их исходного функционального состояния. С помощью использованного методического подхода выявлено снижение резервных возможностей Т-лимфоцитов, проявлявшееся в менее интенсивной экспрессии CD69 в ответ на стимуляцию митогеном у детей с аутоиммунной патологией по сравнению с клинически здоровыми детьми, при отсутствии изменений спонтанного уровня экспрессии этого маркера. Более глубокая стадия истощения ресурсов экспрессии активационных маркеров выявлена для CD25 и CD38, что проявлялось в снижении по сравнению с контрольной группой у больных с аутоиммунной патологией спонтанного и стимулированного количества Тлимфоцитов, экспрессировавших эти активационные молекулы.

Установлено, что больные с различными ревматическими заболеваниями (системная красная волчанка, ювенильная склеродермия, ювенильный идиопатический артрит, реактивный артрит) по параметрам функционального состояния лимфоцитов периферической крови были более сходны между собой, чем с условно здоровыми детьми и больными с хроническим инфекционным заболеванием – вирусным гепатитом С. Это подтверждено с помощью дискриминантного анализа: группы больных с ревматическими заболеваниями были в меньшей степени удалены друг от друга в пространстве канонических дискриминантных функций, чем от клинически здоровых детей и больных с хроническим гепатитом С. Для групп с ювенильным идиопатическим артритом и реактивным артритом по результатам дискриминантного анализа выявлена наименьшая удаленность в пространстве канонических дискриминантных функций, подтверждающая общность патогенеза данных заболеваний.

Впервые представлены данные комплексной оценки параметров субпопуляционного состава лимфоцитов, спонтанной и стимулированной экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов у детей с различной активностью аутоиммунного заболевания на примере ювенильного идиопатического артрита.

Доказано, что при клинической ремиссии функциональное состояние лимфоцитов периферической крови не восстанавливается в полной мере. Это подтверждено результатами дискриминантного анализа, согласно которому группы больных с медикаментозной и со стойкой ремиссией по параметрам популяционного состава и экспрессии маркеров активации лимфоцитов в пространстве канонических дискриминантных функций были ближе к группе больных в активной стадии ЮИА, чем к здоровым детям.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили расширить представление о функциональном состоянии лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии у детей.

Выявленное снижение численности субпопуляций Т-лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы, с учетом анализа литературных данных, свидетельствующих о возможной роли этих клеток в негативной регуляции функционирования иммунной системы, формируют новый взгляд на роль указанных лимфоцитарных субпопуляций в развитии аутоиммунной патологии.

Установлены закономерности изменения субпопуляционного состава и спонтанной и стимулированной экспрессии маркеров активации лимфоцитов при различной активности аутоиммунного заболевания на примере ювенильного идиопатического артрита. Выявлено, что при клинической ремиссии аутоиммунной патологии не наступает полного восстановления функционального состояния лимфоцитов периферической крови. Полученные данные необходимы для понимания функционирования иммунокомпетентных клеток при хроническом воспалительном процессе, для оценки их резервных возможностей. Результаты работы могут быть использованы в процессе постдипломной подготовки врачей аллергологов-иммунологов, ревматологов и врачей клинической лабораторной диагностики.

Использованный в диссертационной работе комплексный подход к оценке экспрессии маркеров активации лимфоцитов, включающий определение их спонтанного и стимулированного уровня, открывает новые возможности для научных исследований, как при аутоиммунных нарушениях, так и при другой иммунозависимой патологии. Разработанная схема изменения при стимуляции in vitro количества лимфоцитов, экспрессировавших активационные маркеры, в зависимости от их исходного функционального состояния, позволяет интерпретировать результаты исследований и оценивать степень истощения резервов иммунокомпетентных клеток.

Выделенный в работе комплекс параметров функционального состояния лимфоцитов периферической крови, подверженных наибольшим изменениям при аутоиммунной патологии соединительной ткани у детей, может быть использован как основа для разработки диагностических алгоритмов в детской ревматологии.

Полученные данные могут применяться в работе клинико-диагностических лабораторий лечебных учреждений для дифференциальной диагностики аутоиммунной патологии и других состояний. Предложенный в работе подход к оценке функционального состояния лимфоцитов периферической крови применим для оценки полноты восстановления иммунной системы при клинической ремиссии аутоиммунных заболеваний.

Внедрение результатов исследования в практику:

Результаты диссертационного исследования включены в методические материалы для врачей, утвержденные Министерством здравоохранения Свердловской области.

Результаты исследования используются при проведении научных исследований ФБГУН Института иммунологии и физиологии УрО РАН, г.

Екатеринбург; внедрены в работу ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница №1», г. Екатеринбург; в работу МАУ «Клинико-диагностический центр», г. Екатеринбург.

Результаты работы включены в педагогический процесс кафедры терапии факультета постдипломного образования ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет», г. Екатеринбург; кафедры клинической лабораторной диагностики и кафедры клинической иммунологии частного учреждения дополнительного профессионального образования медицинских работников «Новый уровень», г. Тюмень; Международной школы «Проточная цитометрия в клинической лабораторной диагностике», г. Челябинск.

Публикации. Соискатель имеет более 100 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 39 научных работ общим объемом 12,2 печатных листов, в том числе 35 публикаций в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 4 работы в зарубежных научных изданиях. Соискателем опубликованы 2 работы в материалах международных конференций; 1 методические рекомендации для врачей, утвержденные Министерством Здравоохранения Свердловской области; 1 статья в сборнике научных трудов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 319 страницах, содержит 78 таблиц и 27 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 427 источников (60 отечественных и 367 – зарубежных публикаций), приложения.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунологические аспекты формирования аутоиммунной патологии соединительной ткани Аутоиммунные заболевания соединительной ткани (ревматические) являются обширной группой, включающей разнообразные нозологические формы, и, зачастую, характеризующиеся поражением многих органов и систем [36, 38]. Это определяется тем, что соединительная ткань присутствует во всех органах и системах организма и, таким образом, в патологический процесс может быть вовлечено значительное количество разнообразных структур. Симптомы аутоиммунных заболеваний, зачастую, неспецифичны, и могут перекрываться как между различными нозологическими формами аутоиммунной патологии соединительной ткани, так и с болезнями неаутоиммунной природы [12, 15, 38, 58]. Все это обуславливает потребность в адекватных и информативных методах диагностики, в том числе лабораторной, для своевременной постановки диагноза и назначения адекватной терапии.

Несмотря на обширный фактический материал и обилие гипотез, объясняющих механизмы аутоагрессии, понимание этиологии и патогенеза аутоиммунных заболеваний в настоящее время далеко от оптимального. В качестве причин этих болезней называют генетические и средовые факторы, обсуждается роль инфекций в качестве триггеров [320]. Не вызывает сомнения участие наследственной предрасположенности в развитии аутоиммунных заболеваний. Известно, что частота возникновения системных аутоиммунных заболеваний, таких как СКВ, склеродермия, дерматомиозит, у девочек и женщин в несколько раз выше, чем у мальчиков и мужчин [8, 16]. В пользу генетической обусловленности аутоиммунной патологии свидетельствует повышение вероятности ее развития у пациентов с отягощенным семейным анамнезом [38].

Выявлено множество ассоциаций между наличием различных аутоиммунных заболеваний и аллелей генов системы HLA, а также различных полиморфизмов генов [7, 24, 34, 50]. Однако диагностическое значение имеют лишь немногие из них в силу плохой воспроизводимости результатов исследований в рамках «генетики предрасположенностей» [56]. Кроме того, большое значение придается эпигенетическим механизмам реализации патологии [23].

Роль средовых факторов, таких как курение и промышленные загрязнители в развитии аутоиммунных заболеваний также имеет свои доказательства [118].

Различные инфекционные возбудители, как вирусные, так и бактериальные рассматриваются в качестве триггеров СКВ [37, 127, 194]. Считается, что вирусы могут способствовать презентации аутоантигенов, а также запускать воспалительные реакции, что в дальнейшем может стать основой аутоагрессии [27, 105, 245]. Молекулярная мимикрия, то есть, сходство антигенных детерминант некоторых микроорганизмов и аутоантигенов, также называется в качестве одной из причин развития аутоагрессии [17]. Однако, существует точка зрения, согласно которой распространение аутоиммунной патологии в последние десятилетия связано со снижением заболеваемости инфекционными болезнями [296]. В рамках этой гипотезы высказывается предположение, что инфекционные агенты, в том числе стимулируя систему Toll-подобных рецепторов, запускают естественные регуляторные механизмы и «тренируют» иммунную систему.

Какова бы ни была этиология аутоиммунных заболеваний, в настоящее время не вызывает сомнений, что ключевую роль в их патогенезе играют потеря иммунологической толерантности к собственным органам и тканям и развитие воспаления [35, 224, 357]. В качестве маркеров развития аутоиммунного процесса чаще всего используют аутоантитела [32, 356]. Для некоторых аутоиммунных заболеваний, таких как СКВ и ревматоидный артрит, разработаны эффективные алгоритмы диагностики с помощью определения аутоантител [32, 164, 260, 399].

Однако, маркеры ювенильного идиопатического артрита в настоящее время не определены, поскольку ревматоидный фактор и антитела к цитруллинированным пептидам, значимые для ревматоидного артрита у взрослых, редко встречаются у детей [1, 40, 253]. Не разработаны эффективные критерии дифференциальной диагностики реактивного артрита и ювенильного идиопатического артрита, не ясно, насколько значимо участие аутоиммунных механизмов в патогенезе реактивного артрита [1].

Поскольку потеря иммунологической толерантности при аутоиммунной патологии предполагает неэффективность негативной регуляции в иммунной системе, большое внимание уделяется исследованию регуляторных Т-клеток и других субпопуляций, участвующих в такой регуляции [65, 237, 242, 267, 325, 400]. В связи с этим, исследование лимфоидных клеток, потенциально имеющих супрессорные свойства, должно способствовать пониманию патогенеза аутоиммунных заболеваний.

У детей аутоиммунные заболевания зачастую протекают в более тяжелой форме, чем у взрослых и характеризуются быстрой генерализацией патологического процесса [12, 37]. Оценка тяжести состояния у детей с аутоиммунной патологией представляет определенную трудность. Различные индексы активности, используемые в ревматологии, созданы для оценки состояния взрослых пациентов и могут быть применены к детям лишь ограниченно. В связи с этим, предпринимаются попытки создания новых индексов, более подходящих для педиатрической практики. Например, для оценки состояния детей с СКВ был предложен индекс SMILEY (Simple Measure of the Impact of Lupus Erythematosus in Youngsters) [277], величина которого коррелировала с оценкой качества жизни пациента, но с традиционно применяемым при СКВ индексом SLEDAI (systemic lupus erythematosus disease activity index).

Для оценки общей активности воспалительного процесса при ревматических заболеваниях наиболее часто используются определение Среактивного белка (СРБ) и скорости оседания эритроцитов (СОЭ) [38]. При ревматоидном артрите концентрация СРБ является чувствительным индикатором активности воспалительного процесса в синовии и системных воспалительных изменений в целом [12]. Однако, у детей с ювенильным идиопатическим артритом величина СОЭ и концентрация СРБ не всегда коррелируют с активностью заболевания [1]. Увеличение СОЭ часто наблюдается при СКВ, однако оно плохо соотносится с активностью патологического процесса, [38, 148].

Увеличение СРБ не коррелирует с клинической активностью СКВ и склеродермии и может быть следствием вторичной инфекции [38, 80, 210]. Таким образом, актуален поиск лабораторных тестов для оценки интенсивности воспаления и общей активации иммунной системы при аутоиммунных заболеваниях.

Большое значение для патогенеза аутоиммунных заболеваний соединительной ткани имеет нарушение баланса про- и противовоспалительных цитокинов [3, 5, 125, 228, 357]. В частности, в регуляции аутоиммунного воспаления значительную роль играет IL-6, который совместно с TGFиндуцирует образование из наивных Т-клеток и подавляет Th17 дифференцировку Treg, вызванную действием TGF- [92, 392]. У пациентов с ревматоидным артритом выявлено увеличение уровня ряда цитокинов в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами, включая IL-1, IL-6, ILи IL-17 [59, 361]. Принято считать, что при этом заболевании основную роль играют цитокины Т-хелперов первого типа [38]. В патогенезе ЮИА с системным началом значительную роль играет гиперпродукция IL-1, IL-6, и IL-18 [133, 342].

При СКВ цитокиновый профиль характеризуется активацией продукции цитокинов Т-хелперов как первого, так и второго типа [37, 130, 205].

Измерение концентрации интерлейкинов потенциально является перспективным подходом для оценки активности воспалительного процесса любой этиологии, поскольку эти вещества являются активными медиаторами воспаления. Однако интерлейкины являются короткоживущими молекулами, что снижает информативность их определения в сыворотке крови [19]. Для преодоления данного ограничения используется оценка стимулированной продукции цитокинов [21], либо вычисление различных интегральных коэффициентов, отражающих продукцию нескольких цитокинов в совокупности [5, 6].

Таким образом, поиск информативных тестов для оценки воспалительного процесса при аутоиммунных заболеваниях, для мониторинга состояния пациента и контроля эффективности терапии продолжается. Перспективным подходом для решения этой задачи представляется оценка экспрессии активационных маркеров лимфоцитов. Лимфоциты являются центральными клетками иммунной системы, осуществляющими регуляцию ее функций [57]. Экспрессия маркеров активации лимфоцитов отражает их функциональный статус и может служить индикатором состояния всей иммунной системы в целом [33]. Различные активационные молекулы экспрессируются на поверхности лимфоцитов на стадиях их ранней и поздней активации, сопровождают развитие процессов пролиферации и апоптоза клеток [343]. Экспрессия некоторых активационных молекул может усиливаться на поверхности лимфоцитов уже через несколько часов после индукции, в то же время, повышение экспрессии может продолжаться в течение длительного времени [33]. Можно заключить, что экспрессия маркеров активации лимфоцитов является, с одной стороны, чувствительным, с другой – достаточно стабильным показателем состояния иммунного ответа.

1.2. Популяционный состав лимфоцитов периферической крови при аутоиммунной патологии Общее количество лейкоцитов и лимфоцитов, а также пропорция различных популяций лимфоцитов у детей значительно меняется по мере взросления, однако для возрастной категории старше 6-7 лет и до наступления взрослого возраста обычно приводятся единые значения нормативных показатей [14, 22, 51].

Изменение численности общего пула лейкоцитов и лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях соединительной ткани не являются специфическими и зависят от активности воспалительного процесса [16]. В частности, для системного варианта ЮИА в стадии активности характерен лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом влево [1, 16]. Лейкопения (чаще лимфопения) может наблюдаться при СКВ, она ассоциируется с активностью заболевания и, в основном, развивается в дебюте или при обострении [38]. В таких случаях чаще происходит снижение абсолютного количества всех популяций лимфоцитов: Т-, В- и NK-клеток, без изменения пропорций между ними [775, 293].

Т-клетки являются разнородной популяцией лимфоцитов и включают в себя несколько субпопуляций, значительно отличающихся по своему фенотипу, свойствам и функциям [57]. Основное различие базируется на экспрессии CD8, которая присуща цитотоксическим Т-клеткам, и на экспрессии СD4, характерной для Т-хелперов, выполняющих функции регуляции иммунного ответа [225].

В некоторых случаях при аутоиммунных заболеваниях соединительной ткани может наблюдаться парциальное изменение численности Т-клеток или их субпопуляций. Например, у больных с активной формой СКВ выявлено снижение абсолютного количества CD3+CD4+ по сравнению с неактивной формой заболевания и здоровыми донорами [273]. При активном дерматомиозите количество CD3+ и CD3+CD8+лимфоцитов было ниже, чем у здоровых лиц [67].

Т-хелперы также можно разделить на эффекторные и регуляторные клетки (выполняющие супрессорные функции), литературные данные относительно роли последних в развитии аутоиммунных заболеваний представлены ниже (глава 1, параграф 1.3). Эффекторные Т-клетки способны пролиферировать в ответ на антигенный стимул, продуцировать цитокины и способствовать цитотоксическим Т-клеткам и В-лимфоцитам в выполнении их функций [225]. Наиболее изученными субпопуляциями среди эффекторных Т-хелперов являются Th1, Th2 и Th17, разделяемые по спектру цитокинов, которые они преимущественно продуцируют [54, 225].

Ключевыми цитокинами Th1 являются IL-2 и IFN-, которые способствуют элиминации внутриклеточных патогенов и ассоциированы с развитием ряда аутоиммунных заболеваний, Th2 продуцируют IL-4 и IL-13 (которые связывают с ответом на внеклеточные патогены, а также с развитием аллергических реакций) [18, 423]. При развитии аутоиммунных заболеваний могут преимущественно активироваться как Т-хелперы 1 типа, так и Т-хелперы 1 и 2 типов одновременно [225, 384, 402, 423].

Th17 вырабатывают мощный провоспалительный цитокин IL-17 [374]. В настоящее время большее значение придается соотношению Т-хелперов 17 типа (Th17) и регуляторных Т-клеток (Treg), которое считается критическим для развития, либо подавления аутоиммунных реакций [214]. Th17 и вырабатываемые ими цитокины играют решающую роль в индукции таких аутоиммунных заболеваний как ревматоидный артрит, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, системная красная волчанка [220, 226, 288, 402]. IL17дефицитные мыши, напротив, резистентны к развитию этих заболеваний [221, 287].

Т-клетки также отличаются друг от друга по степени зрелости, оценку которой проводят с использованием целого ряда маркеров: CD45RA, CD45R0, CD31, CD62L и других [54, 225, 252]. При аутоиммунных заболеваниях (СКВ, ЮИА и др.) часто повышается количество зрелых эффекторных клеток и клеток памяти и снижается число наивных Т-лимфоцитов [95, 283, 363, 369].

Таким образом, в силу того, что Т-лимфоциты представляют собой крайне разнородную популяцию, оценка их общего количества является крайне неспецифичным тестом. Для понимания патогенеза аутоиммунных заболеваний обычно исследуются отдельные популяции и субпопуляции Т-лимфоцитов, в той, или иной степени однородные по своему фенотипу, степени зрелости и функциональному статусу [225].

Одной из фенотипически четко очерченных субпопуляций Т-лимфоцитов являются -Т-клетки. Эти лимфоциты представляют немногочисленную субпопуляцию и в норме не превышают 10% Т-клеток [10, 171]. -Т-клетки экспрессируют особый -Т-клеточный рецептор, в отличие от большинства Тлимфоцитов, экспрессирующих Т-клеточный рецептор -типа [10]. -Т-клетки в основном представляют собой дубль-негативные Т-лимфоциты с фенотипом CD3+CD4-CD8- [10]. Они занимают промежуточное место между -Тлимфоцитами, принадлежащими к системе адаптивного иммунитета, и клетками врожденного иммунитета [57]. Функциональная роль -Т-клеток заключается в защите от патогенов, в противоопухолевом ответе, они также могут быть вовлечены в патогенез аутоиммунных заболеваний, таких как диабет, СКВ и другие [10].

По данным разных авторов, при реактивном артрите и ЮИА количество Т-клеток в периферической крови укладывалось в пределы нормы [84, 88, 90, 197, 389]. При этом, число -Т-клеток в синовиальной жидкости больных с ЮИА было выше, чем в крови [88, 90, 204197], причем данный факт наблюдался при различных вариантах ЮИА (системный, полиартикулярный, олигоартикулярный варианты, псориатический артрит, артриты, связанные с энтезитами) [90]. В последней работе также показано, что количество V1+ в синовиальной жидкости обратно коррелировало с величиной СОЭ и возрастом дебюта заболевания и было выше у АНА-позитивных пациентов, чем у АНА-негативных. Bendersky A. и соавт. (2012) установили, что -Т-клетки больных с ЮИА из периферической крови и синовиальной жидкости активно продуцировали TNF- и IFN-, свидетельствует о вовлечении данной субпопуляции в патогенез ювенильного артрита [88].

При диффузной форме системной склеродермии также не было выявлено различий со здоровыми донорами по количеству периферических -Т-клеток Однако в этой работе продемонстрировано, что -Т-клетки [389].

периферической крови пациентов со склеродермией имели активированный фенотип (повышенную экспрессию CD69 и пониженную экспрессию CD62L), более того, наблюдалась инфильтрация пораженной кожи этими клетками.

Кроме дубль-негативных -Т-клеток среди периферических Т-лимфоцитов также встречаются дубль-позитивные Т-клетки с фенотипом CD3+CD4+CD8+. Это немногочисленная субпопуляция, которая обычно составляет не более 2% от Тлимфоцитов [96]. Ранее считалось, что существование дубль-позитивных Тлимфоцитов в периферической крови обусловлено выходом незрелых тимических клеток в периферический кровоток [100]. Однако, затем было показано, что CD3+CD4+CD8+ периферические отличаются от аналогичной тимической субпопуляции и представляют собой зрелые антиген-специфические эффекторные клетки памяти [289].

Физиологическая роль дубль-позитивных Т-лимфоцитов недостаточно изучена. Известно, что эти лимфоциты способны секретировать цитокины, характерные для Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток 1 типа и лизировать клетки-мишени [289, 299]. У лиц пожилого возраста число дубль-позитивных Тлимфоцитов больше, чем в среднем возрасте [114]. Количество CD3+CD4+CD8+ повышается при инфекционных и паразитарных заболеваниях, а также при опухолевых процессах [165, 192]. Кроме того, известно, что число этих клеток растет при некоторых аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, системный склероз (склеродермия) и аутоиммунный тиреоидит [28, 77, 303]. Динамика численности дубль-позитивных Т-лимфоцитов при другой аутоиммунной патологии, в том числе у детей, практически не изучена.

Еще одной субпопуляцией Т-лимфоцитов, имеющей четко очерченный фенотип, являются Т-натуральные киллеры (NKT), экспрессирующие CDрецепторы Т- и NK-клеток: CD3 и CD16/56 [44, 87]. Особенностью NKT является экспрессия инвариантного ТКР, который распознает гликолипидный антиген в комплексе с неклассической молекулой MHC I класса - CD1d [46, 433]. Тнатуральные киллеры могут экспрессировать CD4 или CD8, а также быть дубльпозитивными и дубль-негативными по этим маркерам [10, 271].

NKT являются малочисленной субпопуляцией Т-лимфоцитов, у здоровых людей их количество в периферической крови обычно не превышает 5-6% [10, 73]. NKT участвуют в регуляции функций иммунной системы, поскольку способны к активной продукции цитокинов [44, Несмотря на 420].

малочисленность этой субпопуляцци, внутри нее выделяются отдельные разновидности клеток, отличающиеся своим фенотипом и способностью вырабатывать различные цитокины [44]. В ходе исследований выявлены NKT, способные секретировать цитокины преимущественно Th1 или Th2-типа, обоих типов одновременно, цитокины Th17, а также регуляторных Т-клеток [87, 143, 332]. Физиологическая роль NKT активно изучается и, хотя многое на настоящий момент остается неясным, известно, что эти клетки занимают промежуточное положение между врожденным и адаптивным иммунитетом [57, 421]. NKT принимают активное участие в иммунном ответе на патогены различной природы [87, 388, 421].

На модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей была показана протективная роль NKT, которые были способны подавлять развитие заболевания [255, 302]. Однако, в другой работе, посвященной исследованию экспериментального аутоиммунного васкулита у крыс, была обнаружена аутореактивная субпопуляция NKT, вовлеченная в патогенез заболевания [199]. При аутоиммунных заболеваниях печени NKT могут индуцировать как противовоспалительные, так и провоспалительные реакции [332].

Тем не менее, в литературных источниках представлены данные, свидетельствующие о способности Т-натуральных киллеров к супрессии иммунного ответа у человека и их роли в контроле различных аутоиммунных заболеваний [166, 237, 267, 366]. В частности, продемонстрировано, что NKT способны с помощью контактных механизмов подавлять активность аутореактивных В-лимфоцитов при СКВ и ревматоидном артрите in vitro, что приводило к снижению продукции аутоантител и ревматоидного фактора [408].

При этом, NKT могут стимулировать путем продукции цитокинов нормальные Влимфоциты, не проявлявшие аутореактивности [408], в связи с этим обсуждается роль в качестве потенциального терапевтического средства при NKT аутоиммунной патологии [203, 408]. Показано, что NKT могут непосредственно вырабатывать TGF и IL-10, а также индуцировать выработку этих цитокинов другими клетками [203]. Снижение количества NKT может наблюдаться при различных аутоиммунных заболеваниях, таких как СКВ, аутоиммунный диабет, рассеянный склероз, ревматоидный артрит [73, 115, 219, 231, 419].

В-лимфоциты являются продуцентами антител, в том числе имеющих специфичность к аутоантигенам, поэтому их роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний не вызывает сомнения [379]. Это подтверждается тем, что использование анти-В-клеточной терапии (ритуксимаба, - антител к CD20) приводило к стойкому клиническому эффекту у пациентов с ревматоидным артритом и СКВ [211, 387]. Кроме того, в В-лимфоцитах пациентов с ревматоидным артритом найдены изменения экспрессии генов, регулирующих клеточный цикл, пролиферацию, апоптоз, аутоиммунные реакции и цитокиновую регуляцию [361]. В В-лимфоцитах больных с олигоартикулярным ювенильным артритом зафиксирована повышенная по сравнению со здоровыми детьми экспрессия генов RAG2, что может указывать на реарранжировку генов Влимфоцитов в процессе продукции аутоантител [154].

Однако данные о численности В-клеток при различной аутоиммунной патологии у детей противоречивы. Например, у больных с дебютом ювенильного дерматомиозита количество В-клеток было повышено по сравнению со здоровыми детьми (30±3 против 19±1 соответственно), при этом по экспрессии маркеров активации В-лимфоцитами (CD23, CD25, CD54, CD69) различий не обнаружено [295]. У детей с олигоартикулярным ЮИА общее содержание Влимфоцитов, а также их субпопуляционный состав не отличалось от контрольного уровня, однако в синовиальной жидкости детей с ЮИА содержалось повышенное по сравнению с периферической кровью количество активированных В-клеток памяти и IgG-продуцирующих плазмобластов [121]. Не выявлено различий по количеству В-лимфоцитов между больными с серонегативным и серопозитивным (по ревматоидному фактору и антителам к циклическому цитруллинированному пептиду) ревматоидным артритом, а также больными с неревматоидным поражением суставов [268]. При СКВ было выявлено снижение абсолютного (но не относительного) количества Влимфоцитов по сравнению со здоровым контролем на фоне общей лейкопении [139]. Однако Zhao L. с соавт. (2012) сообщает об увеличении популяции Влимфоцитов при СКВ [420]. Ряд авторов приводит данные об увеличении пропорции этих клеток, экспрессирующих молекулы костимуляции, у больных с СКВ [139, 273].

Таким образом, изменение относительного содержания общего пула Влимфоцитов не является характерным для аутоиммунной патологии, возможно как снижение, так и увеличение числа этих клеток при различных заболеваниях и при их различной активности. Тем не менее, представляет интерес исследование субпопуляций В-лимфоцитов, экспрессирующих различные маркеры, задействованные в клеточной активации, костимуляции и адгезии.

Одной из перспективных для исследования является субпопуляция Вклеток, экспрессирующая CD5. Оценка числа лимфоцитов с фенотипом CD19+CD5+ признано диагностически значимым при многих аутоиммунных заболеваниях: СКВ, синдроме Шегрена, ревматоидном артрите, инсулинозависимом диабете, миастении и т.д. [52]. Считается, что число CD19+CD5+ при аутоиммунной патологии увеличивается, а при успешном лечении – снижается [10].

Молекула является трансмембранным гликопротеином и CD5 экспрессируется в ассоциации с антиген-распознающим рецептором на всех Тлимфоцитах и на части В-клеток [10, 350]. Этот рецептор задействован в регуляции ответа В-лимфоцитов на антигенную стимуляцию, в пролиферации и выживании В-клеток [249]. В последнее время стало известно о роли этого рецептора в регуляции программируемой клеточной смерти, распознавании патоген-ассоциированных молекулярных паттернов и ингибировании функций иммунокомпетентных клеток [350].

Ранее было высказано предположение о том, что рецептор CD5 является маркером В1-лимфоцитов, фенотип которых определен как CD19+CD5+ [207].

В1а-лимфоциты способны в отсутствие антигена трансформироваться в плазмобласты и секретировать низкоаффинные полиреактивные антитела класса IgM, B1b реагируют пролиферацией и выработкой антител на Т-независимые антигены [57]. Однако в настоящее время считается, что рецептор CD5 может служить для характеристики В1-лимфоцитов у мышей, но не у человека, у которого CD19+CD5+лимфоциты представляют собой незрелые и переходные Вклетки [136]. Типичными свойствами В1-лимфоцитов у человека обладают Влимфоциты с фенотипом CD20+CD27+CD43+CD70-, как было описано Griffin и соавторами [172]. Этим клеткам была свойственна спонтанная секреция IgM, конститутивный сигналинг через В-клеточный рецептор и способность индуцировать аллогенную Т-клеточную пролиферацию. Описана роль этих лимфоцитов в стимуляции Т-клеток и патогенезе СКВ [173].

На модели трансгенных мышей также было показано, что аутореактивные В-лимфоциты, вырабатывавшие антитела к десмоглеину 3, не имели фенотипа CD5+, в свою очередь В-клетки, экспрессировавшие данный антиген, не проявляли аутореактивности [298]. Было также выявлено, что разные субпопуляции CD19+CD5+лимфоцитов человека экспрессируют разные изоформы CD5: поверхностная изоформа этой молекулы, кодируемая экзоном Е1А, экспрессируется B1-a-клетками, а внутриклеточная изоформа, кодируемая экзоном Е1В, представлена на B1-b-клетках [162]. В этой же работе было продемонстрировано, что В-клетки человека, экспрессирующие CD5 и Е1В, способны к выработке высоких уровней IL-10.

Таким образом, В-лимфоциты с фенотипом CD19+CD5+ могут являться супрессорными клетками. Наличие супрессорной популяции В-лимфоцитов обсуждается в литературе в последнее десятилетие. В результате обобщения литературных данных по этому поводу C. Mauri и P.A. Blair (2010) сделали вывод о том, что супрессорные В-клетки обладают свойством вырабатывать IL10 и подавлять дифференцировку Th1, тем самым ингибируя патогенез аутоиммунных заболеваний и подавляя противоопухолевый иммунный ответ [261].

Точный фенотип супрессорных В-клеток неизвестен, молекула CD5 может быть маркером части из них, однако ее экспрессия не является обязательной для этой субпопуляции [91, 261]. Существует мнение о том, что супрессорные В-клетки, как и регуляторные Т-клетки могут экспрессировать Foxp3, действовать через непосредственный клеточный контакт и иметь различные субпопуляции, преимущественно продуцирующие IL10 или TGF, однако наибольшая роль отводится IL10 [91, 101, 395].

У больных со спондилоартритом было выявлено увеличение числа CD19+CD5+лимфоцитов в периферической крови по сравнению со здоровыми донорами, у больных с ревматоидным артритом такого эффекта не наблюдалось [102]. В этой же работе показано, что при спондилоартрите CD19+CD5+ экспрессировали высокий уровень HLA-DR и вырабатывали большое количество IL6 и IL10 в ответ на стимуляцию различными индукторами in vitro. У больных с синдромом Шегрена также было зафиксировано увеличение числа IL10продуцирующих CD19+CD5+лимфоцитов [159].

Представляет интерес дальнейшее исследование количества и функциональной активности CD19+CD5+лимфоцитов при аутоагрессии, которое будет способствовать пониманию роли этих клеток в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Кроме того, в литературе практически отсутствуют данные о количестве CD19+CD5+лимфоцитов у детей с аутоиммунными заболеваниями.

Известно, что в норме количество CD19+CD5+ с возрастом снижается, у детей от 6 до 16 лет число этих клеток приближается к уровню взрослых лиц и составляет 15-45% от В-лимфоцитов [47, 310]. Большинство CD19+CD5+лимфоцитов у детей младше 5 лет имеют незрелый фенотип, в дальнейшем происходит переход этих клеток к более зрелым формам [310].

Натуральные киллерные клетки (NK) обладают фенотипом CD3-CD16/56+, являются компонентом врожденного иммунитета и играют большую роль в противоопухолевой защите и иммунном ответе на различные патогены [138, 149].

Функциональная активность может проявляться в виде клеточной NK цитотоксичности, выработка цитокинов и костимуляции при непосредственном клеточном контакте. Считается, что в развитии аутоиммунных реакций основное значение имеет продукция натуральными киллерами различных цитокинов, однако не исключено влияние и цитотоксических механизмов [138]. NK-клетки делятся на две основные субпопуляции: CD3-CD16+/brightCD56dim и CD3-CD16dim/CD56bright. Первая обладает высокой цитолитической активностью, но слабо продуцирует цитокины, а вторая, в меньшей степени, проявляет цитотоксическую способность, но способна секретировать IFN-, IL-10, IL-13, TNF- и другие цитокины [138, 149]. Часть натуральных киллеров экспрессирует на своей поверхности CD8, хотя и в меньшей плотности, чем цитотоксические Тлимфоциты [10]. Гомодимеры CD8-цепей на поверхности натуральных киллеров играют роль в регуляции поступления Са2+ в клетку, тем самым защищая NKклетки от апоптоза и способствуя их многократному участию в лизисе клетокмишеней [62].

Дисфункция и изменение численности NK-клеток наблюдается при различных аутоиммунных заболеваниях, особое значение придается этим явлениям при системном варианте ЮИА. При этом заболевании обнаружено снижение числа этих клеток по сравнению со здоровыми детьми и больными с полиартикулярным ЮИА [133]. Экспрессия перфорина была значительно снижена в NK-клетках у больных с системным ювенильным артритом [405].

Кроме того, отмечено снижение цитокиновой продукции и цитотоксичности натуральных киллеров при этом заболевании, что в настоящее время считается причиной развития гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза [394]. Возможным механизмом снижения функциональной активности NK у больных с системным ювенильным артритом может служить дефект фосфорилирования IL-18R [133].

При других аутоиммунных заболеваниях также зафиксированы различные изменения количества и функциональных особенностей натуральных киллеров.

Так, у больных с ревматоидным артритом выявлена аккумуляция NK в поврежденной ткани суставов, причем большинство из них составляли клетки с CD3-CD16+56bright фенотипом У детей с дебютом ювенильного [129].

дерматомиозита было выявлено снижение общего количества NK-клеток по сравнению со здоровыми детьми [295]. Относительное и абсолютное количество натуральных киллеров и их лимфокин-активированная киллерная способность в отношении клеток-мишеней K562 были снижены у больных с СКВ и ревматоидным артритом, у пациентов с болезнью Бехчета и со спондилоартритом таких эффектов не обнаружено [304].

У больных с активной формой СКВ выявлено снижение абсолютного количества натуральных киллеров по сравнению с неактивной формой заболевания и здоровыми донорами [273]. Другими авторами также было выявлено снижение числа NK-клеток, особенно CD226+, по сравнению со здоровыми донорами у пациентов с активной СКВ [196]. Кроме того, в этой же работе продемонстрировано, что плазмоцитоидные дендритные клетки больных с СКВ характеризуются повышенной продукцией IFN-, который может вызывать активационно-индуцированный апоптоз натуральных киллеров, что может быть одним из механизмов снижения численности NK. Согласно другим данным натуральные киллеры больных с СКВ могут усиливать продукцию IFNплазмоцитоидными дендритными клетками, индуцированную иммунными комплексами, содержащими нуклеиновые кислоты [175]. На экспериментальной модели показано, что натуральные киллерные клетки, содержащие большое количество цитотоксических гранул, могут инфильтрировать почки мышей, спонтанно развивающих СКВ, в стадии предзаболевания [196].

Низкая функциональная активность натуральных киллеров была характерна для пациентов с СКВ на разных стадиях заболевания [170]. Однако в других работах, напротив, было выявлено увеличение количества 56brightнатуральных киллеров и их функциональной активности, в том числе способности продуцировать высокий уровень IFN и TNF [61, 334]. При синдроме Шегрена также выявляли и повышение, и понижение числа и функциональной активности NK [204, 362].

Таким образом, изменение количества и функциональной активности натуральных киллеров при различных аутоиммунных заболеваниях соединительной ткани остается малоизученным, а результаты работ – противоречивыми. Практически отсутствуют публикации, посвященные исследованию этих клеток при аутоиммунной патологии у детей, исключение может составить лишь системный вариант ЮИА.

1.3. Маркеры активации лимфоцитов, их экспрессия при аутоиммунной патологии Исследование экспрессии различных поверхностных молекул лимфоцитов, относящихся к так называемым маркерам активации, используется для оценки функционального состояния отдельных популяций клеток и иммунной системы в целом [10]. В настоящее время для характеристики различных аспектов функционирования иммунокомпетентных клеток определяется экспрессия широкого спектра активационных маркеров [10, 33, 57].

Ранний активационный антиген, CD69 (Leu-23), член семейства генов NKклеток лектиноподобных сигнальных рецепторов С-типа, является фосфорилированным дисульфидно-связанным гомодимером с молекулярной массой 28-32 кДа [176, 243, 372, 425]. Перекрестное связывание CD69 антителами приводит к повышению уровня внутриклеточного Ca2+, в основном - за счет притока извне. Хотя изолированная стимуляция этого рецептора недостаточна для эффективной стимуляции протеинкиназы С, но, при одновременной стимуляции форболмиристилацетатом, повышается экспрессия генов IL-2 и IFN-, и происходит запуск IL-2-зависимой пролиферации как периферических Тлимфоцитов, так и тимоцитов [372]. И CD4+, и CD8+ периферические Т-клетки отвечают на CD69-опосредованную активацию [там же]. Помимо Т-лимфоцитов, CD69 также экспрессируется активированными натуральными киллерами, всеми моноцитами, полиморфноядерными лейкоцитами и тромбоцитами [134, 163, 246, 259, 372].

Функции этого рецептора до сих пор четко не определены, но известно, что он может принимать участие в процессах выхода тимоцитов из тимуса и перемещениях периферических Т-клеток [156], в индукции клеточной цитотоксичности натуральных киллеров [311, 426].

Спонтанный уровень экспрессии CD69 на Т-клетках не превышает 10%, несмотря на различия в данных разных авторов, наиболее часто в литературе указан диапазон от 1 до 5% [25, 67, 355]. Результаты, приведенные в разных литературных источниках для CD4 и CD8-положительных Т-лимфоцитов, также укладываются в эти пределы, хотя число клеток, экспрессирующих CD69, в этих субпопуляциях может различаться. Например, Green S. с соавт. (1999) приводят следующие значения для здоровых доноров: 1,1±0,1% позитивных по CD69 клеток среди CD3+CD4+; 3,3±1,9% среди CD3+CD8+ [171]. В публикации других авторов экспрессия CD69 на CD3+CD4+ составила 3,3±2,7% [213]. Взаимосвязь уровня экспрессии CD69 на Т-клетках и возраста у здоровых лиц не установлена [322].

У больных с аутоиммунными заболеваниями выявлены различные изменения уровня экспрессии CD69 на Т-клетках. Так, у больных с СКВ количество CD3+CD69+ было более чем в три раза выше, чем у здоровых доноров и было прямо взаимосвязано с индексом SLEDAI и концентрацией антител к двуспиральной ДНК [355]. У больных со склеродермией экспрессия CD69 также была значительно повышена по сравнению со здоровыми донорами [316]. В другом исследовании у больных этим заболеванием выявлена экспрессия CD69 мононуклеарными клетками пораженной кожи [206].

В исследовании, посвященном эффектам ритуксимаба при лечении больных с СКВ, обнаружено снижение изначально повышенного количества Т-хелперов, экспрессировавших CD69, через три месяца после введения препарата, и хотя к сроку 12 месяцев их число вновь увеличилось, оно не достигло исходной величины [363]. Следует отметить, что CD69 был единственным маркером Тклеток, который отреагировал на лечение, хотя помимо этого определялся целый спектр рецепторов на CD3+CD4+ и CD3+CD8+лимфоцитах: CD25, CD28, CD45RA, CD45R0, HLA-DR. В другой публикации также сообщается, что в ходе успешного лечения пациентов с СКВ ритуксимабом снижение SLEDAI сопровождалось снижением CD69 и CD40L на Т-лимфоцитах [381]. У больных с активным увеитом аутоиммунной природы, не получавших или получавших минимальное лечение, количество CD4+лимфоцитов, экспрессировавших CD69, также исходно было в три раза больше, чем у здоровых доноров, а в процессе лечения – снизилось [213].

Можно предположить, что при аутоиммунной патологии экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах повышена в активной стадии заболевания, а уменьшение числа таких клеток свидетельствует об эффективности проводимого лечения. Однако, у пациентов с таким системным аутоиммунным заболеванием, как дерматомиозит (и активная, и неактивная формы) количество CD3+CD69+ значимо не отличалось от контрольных значений [67]. Более того, у больных с ювенильным CD3+CD8+CD69+ дерматомиозитом, количество увеличивалось по мере улучшения клинической активности заболевания и прямо коррелировало с общей оценкой состояния пациента по визуальной аналоговой шкале [151]. То есть повышение экспрессии CD69 на Т-клетках характерно не для всех аутоиммунных заболеваний, а ее снижение в ходе лечения не во всех случаях может свидетельствовать об эффективности терапии. У больных с ювенильным идиопатическим артритом, с ревматоидным артритом и другими хроническими синовиитами число Т-клеток периферической крови, экспрессировавших CD69, также не отличалось от такового у здоровых лиц [63, 88, 95].

Таким образом, изменение экспрессии CD69 при различных аутоиммунных заболеваниях может иметь разную направленность, что затрудняет интерпретацию роли этого антигена в развитии аутореактивности. Изменение уровня экспрессии CD69 в ходе лечения подтверждает его вовлеченность в процессы реализации аутоиммунитета. В литературе практически отсутствуют данные о количестве Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD69, при аутоиммунных заболеваниях у детей.

Молекула является -цепью гетеродимерного компонента CD25 высокоаффинного рецептора IL-2, формирующегося в процессе активации Тлимфоцитов из низкоаффинного димерного рецептора [160]. IL-2 и его рецептор играют ключевую роль в запуске пролиферативного ответа лимфоцитов [238].

Формирование гетеромерного рецептора IL-2, включающего CD25, в процессе активации Т-лимфоцитов является одним из важнейших моментов, обеспечивающих вступление этих клеток в пролиферацию в ответ на антигенный стимул [86].

Определение количества CD3+CD25+лимфоцитов широко используется в клинической практике для оценки ранней активации Т-лимфоцитов [22, 51].

Однако, популяция CD3+CD25+клеток весьма разнородна, поскольку CD25 может экспрессироваться на Т-хелперах (CD3+CD4+), цитотоксических лимфоцитах (CD3+CD8+), дубль-негативных Т-клетках (CD3+CD4-CD8-), CD4+NKT-клетках [33, 51]. Причем уровень экспрессии в различных популяциях может значительно различаться как в норме, так и при патологии. Например, у здоровых доноров количество CD25-позитивных клеток среди CD3+CD4+ составило 12,3±0,03%, а среди CD3+CD8+ - 1,1±0,06% [171]. У пациентов с СКВ количество клеток, экспрессировавших CD25, среди Т-хелперов достигало 25,5±17,0%, среди Тцитотоксических оно было значительно ниже: 3,0±1,4% [374]. Следует отметить, что границы нормы для общего количества CD3+CD25+клеток значительно варьируют: от 0,5-6% [10] до 11,5-13,4% [321].

Среди CD25-позитивных Т-лимфоцитов наибольшее внимание в настоящее время уделяется регуляторным Т-клеткам (Treg). Этой субпопуляции и продуцируемым ею цитокинам отводится ключевая роль в негативной регуляции адаптивного иммунного ответа [233, 325]. Treg элиминируют аутореактивные Тлимфоциты, индуцируют иммунологическую толерантность и подавляют воспаление [308, 409]. Способность регуляторных Т-лимфоцитов к супрессии иммунного ответа позволяет некоторым авторам рассматривать их как потенциальное терапевтическое средство при аутоиммунной патологии [11, 244, 386]. Различают образующиеся в тимусе естественные и дифференцирующиеся на периферии индуцибельные регуляторные Т-клетки лимфоцитов [193, 325]. Свои функции регуляторные Т-клетки осуществляют с помощью выработки супрессорных цитокинов IL-10 и TGF-, экспрессии различных рецепторов, таких как CTLA4, и перфорин-гранзим-индуцированного апоптоза эффекторных Тлимфоцитов [201, 308, 325, 422]. Кроме того, эти клетки могут экспрессировать различные молекула активации, костимуляции, а также хемокиновые рецепторы, определяющие их способность проникать в различные органы и ткани [189, 286].

На ранних этапах исследовании Treg было установлено, что это Т-клетки с CD3+CD4+CD25+, фенотипом обладающие супрессорной активностью и участвующие в механизмах аутотолерантности [326, 327]. Мутация гена Foxp3 была идентифицирована в 2001 году как причина развития тяжелого спонтанного аутоиммунного процесса у Scurfy-мышей [215]. Вслед за этим было выявлено, что ядерный фактор Foxp3 является ключевой молекулой для развития и функционирования Treg у человека [89]. С тех пор использование этого маркера для идентификации Treg является общепризнанным и весьма распространенным [424].

Было высказано мнение, что только CD4+CD25high лимфоциты человека обладают супрессорной активностью in vitro [81]. Однако, стандартизованное выделение субпопуляции CD4+CD25highлимфоцитов чрезвычайно затруднительно, что может приводить к значительной вариабельности получаемых разными исследователями данных [286]. Позднее было установлено, что CD25intermediate и CD25low/negative также могут нести Foxp3 и обладать супрессорной активностью, и что еще одним маркером Treg является низкая экспрессия CD127 или отсутствие этого рецептора [182, 241].

Кроме того, существуют данные о том, что Foxp3 может экспрессироваться не только Treg, но и другими активированными лимфоцитами, и что экспрессия Foxp3 регуляторными Т-клетками может прекращаться, а специализация клетки при этом меняться [120 190, 217, 279]. В частности, при обследовании больных с ревматоидным артритом и с ювенильным идиопатическим артритом было выявлено, что не все CD4+CD25highлимфоциты экспрессируют Foxp3+, в то же время CD4+Foxp3+клетки могли быть CD25low и CD25neg [177, 292]. В обзоре литературы, посвященном исследованию регуляторных Т-клеток при СКВ, сообщается, что при этом заболевании различными исследователями обнаружены субпопуляции Т-хелперов с фенотипами Foxp3+CD4+CD25dim и Foxp3+CD4+CD25-, не обладавшие супрессорной активностью [191]. Однако, существуют работы, в которых показано, что у пациентов с СКВ и ревматоидным артритом CD4+CD25Foxp3+лимфоциты способны к супрессии аутологичных клеток-эффекторов [99, 135, 358].

Одним из результатов этих работ явилось то, что для идентификации Трег в настоящее время все чаще используется комбинация моноклональных антител CD4+CD25+CD127low/neg. По мнению Fazekas de StGroth B. с соавт. (2011), использование поверхностных маркеров для типирования Treg предпочтительнее, чем определение Foxp3 на CD4+лимфоцитах, поскольку позволяет избежать этапов фиксации и пермеабилизации клеток, которые могут снижать интенсивность сигнала от других антител при цитометрическом анализе [155].

Предположение об участии Treg в патогенезе различных аутоиммунных заболеваний высказывалось многими авторами [242, 325, 400] однако данные литературы относительно числа этих лимфоцитов при аутоиммунной патологии зачастую противоречивы [48, 128, 325]. Часть литературных источников свидетельствует о снижении числа Treg при системной красной волчанке (СКВ), склеродермии, ревматоидном артрите и ювенильном идиопатическом артрите [157, 212, 230, 232, 272, 337, 3521]. Согласно другим авторам, количество регуляторных Т-клеток при ревматоидном артрите, прогрессирующем системном склерозе и СКВ, напротив, увеличено [26, 99, 177, 316]. Существуют также данные, свидетельствующие об отсутствии изменений числа при Treg перечисленных аутоиммунных заболеваниях и синдроме Шегрена [68, 70, 147, 281, 348, 391].

Для патогенеза аутоиммунных заболеваний может быть значимо не только изменение количества регуляторных Т-клеток, но и снижение их функциональной активности [242, 400]. Например, при системной склеродермии показано, что супрессивная функция Treg (в отношении подавления пролиферации CD4+CD25+ при сокультивировании) была снижена, что прямо коррелировало с пониженной экспрессией CD69 и CD62L этими клетками [316]. Согласно результатам метаанализа литературных источников [376] при сахарном диабете I типа количество регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ в большинстве случаев не изменяется, однако их способность подавлять пролиферацию CD4+CD25- in vitro снижена.

Кроме того, аутореактивные лимфоциты могут обладать повышенной устойчивостью к супрессорному воздействию Treg, что способно вносить существенный вклад в потерю аутотолерантности. Например, при ювенильном идиопатическом артрите чувствительность синовиальных эффекторных CD4+CD25-лимфоцитов к супрессорному воздействию аутологичных регуляторных Т-клеток CD4+CD25high была снижена и обратно коррелировала с количеством эффекторных клеток, несущих активационные маркеры: CD4+CD25CD69+ и CD4+CD25-HLA-DR+ [184]. Косвенным свидетельством значимости Treg в супрессии иммунного ответа являются данные, согласно которым, при деплеции регуляторных Т-клеток in vitro у пациентов с СКВ, в отличие от здоровых доноров, возрастало количество аутореактивных CD4+лимфоцитов [150]. Кроме того, в условиях in vitro были получены свидетельства того, что при СКВ регуляторные Т-клетки способны супрессировать функциональную активность Влимфоцитов, включая выработку аутоантител [198].

Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует о значительной роли регуляторных Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD25, в развитии аутоиммунной патологии. Однако остается открытым вопрос, при всех ли аутоиммунных заболеваниях снижается численность этой субпопуляции, поскольку в литературе имеются различные данные по этому поводу.

Недостаточна информация о взаимосвязи между стадией аутоиммунного процесса и количеством Treg. Крайне скудны литературные данные об изменениях количества регуляторных Т-клеток при аутоиммунной патологии у детей.

Цитотоксические CD8-позитивные Т-лимфоциты так же, как и Т-хелперы, могут экспрессировать CD25. Тимические Т-лимфоциты с фенотипом CD8+CD25+ способны к супрессии пролиферативной активности аутологичных CD4 +CD25лимфоцитов и экспрессируют типичные маркеры регуляторных клеток: Foxp3, GITR и CTLA-4 [122]. Цитотоксические Т-лимфоциты, экспрессирующие CD25, из периферической крови и неиммунных органов также могут проявлять супрессорные свойства и нести маркеры Treg [112]. CD4+CD25+, также как и CD8+CD25+лимфоциты способны экспрессировать Foxp3 после стимуляции антителами к CD3 и CD28 in vitro, однако его экспрессия цитотоксическими Тлимфоцитами менее стабильна [216]. В литературе имеются данные о том, что периферические цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD25, проявляют свойства клеток памяти, имеют поликлональный Т-клеточный рецептор и способны пролиферировать в ответ на стимуляцию IL-2 [186]. Возможно, физиологическая роль CD8+CD25+лимфоцитов схожа с ролью регуляторных Тклеток с фенотипом CD4+CD25+, однако, не исключено, что цитотоксические Тклетки, экспрессирующие CD25, содержат несколько функционально различных субпопуляций.

CD38 – мембранный гликопротеин, являющийся ферментом с целым рядом функций: участвует в регуляции концентрации внутриклеточного кальция, проявляет эктонуклеотидазную, аденозиндифосфат-рибозил-циклазную, циклический аденозиндифосфат-рибозил-гидролазную и другие активности [32 82, 168]. CD38 принимает участие в регуляции выработки инсулина, у больных с диабетом I и II типа выявлены антитела к этому рецептору, имеющие преимущественно агонистический характер [254]. Эта молекула участвует в активации Т-лимфоцитов и в процессах их селекции в тимусе [33, 168, 370]. Тлимфоциты экспрессируют после стимуляции антителами против CD38 специфических антигенных рецепторов, взаимодействие CD38 с экто-моно-АДФрибозилтрансферазами является одним из механизмов, определяющих баланс между выживанием и программируемой клеточной гибелью активированных клеток [178]. Стимуляция через CD3 и CD38 приводит к интенсивной выработке цитотоксическими Т-клетками различных цитокинов: GM-CSF, IFN-, TNF- и TNF- [111].

Экспрессия СD38 на натуральных киллерах повышается при вирусных инфекциях, соединение этого рецептора с соответствующим лигандом на NKклетках приводит к усилению их цитотоксических и секреторных функций [234, Большое значение придается рецептору в созревании и 336]. CD38 дифференцировке В-лимфоцитов [106, 131]. При В-клеточном лимфолейкозе считается маркером тяжести лимфопролиферативного процесса и CD38 неблагоприятного исхода заболевания [145].

В отношении нормального уровня экспрессии CD38 на Т-лимфоцитах у здоровых лиц данные литературы значительно разнятся. В некоторых литературных источниках спонтанный уровень CD38-позитивных лимфоцитов среди цитотоксических Т-клеток и Т-хелперов у здоровых доноров составил менее 10% [70, 141]. В других работах указаны более высокие цифры: CD38позитивными у здоровых доноров оказались 22,6% от CD3+CD4+лимфоцитов и 12,1% от всех Т-лимфоцитов [333]; 20% от CD3+CD4+лимфоцитов [337]. Xing Y. и соавторы указывают на еще более высокие цифры: спонтанный уровень CD38позитивных лимфоцитов среди цитотоксических Т-клеток у здоровых доноров составил 43±12% [406]. У детей от 9 до 14 лет также наблюдался высокий уровень экспрессии CD38 на Т-клетках: 61,3±17,4 на Т-хелперах и 54,7±8,2 на цитотоксических Т-лимфоцитах [396].

Противоречивость результатов при оценке экспрессии CD38 и других активационных маркеров может объясняться методическими особенностями. Для уточнения методики определения CD8+CD38+ проведено исследование на ВИЧинфицированных пациентах, в котором параллельно использовались FITC- и PEконъюгированные моноклональные антитела к В случае CD38 [297].

использования анти-CD38-PE количество CD8+CD38+лимфоцитов было в 2-3 раза больше, чем при использовании анти-CD38-FITC. В другой работе, посвященной цитометрическому анализу, также продемонстрировано, что антитела к CD38, даже меченые одним и тем же флюорохромом (аллофикоцианном), но принадлежащие к различным клонам, приводят к получению различных результатов определения клеток [248]. То есть при CD38-позитивных цитометрическом анализе результаты существенно зависят от качества моноклональных антител и использованного флюорохрома. Хотя, согласно Schmitz J.L. c соавт. (2000), при использовании для цитометрического анализа антител к CD38, меченых FITC, PE и PerCP, не выявлено существенной разницы между различными реагентами [335]. Поскольку в настоящее время не разработаны четкие международные рекомендации по фенотипированию CD38позитивных лимфоцитов, сравнение результатов различных авторов между собой затруднительно. Возможно ориентироваться лишь на различия между исследуемой и контрольной группами.

Наибольшее число публикаций, в которых приведена оценка экспрессии CD38 на Т-лимфоцитах, посвящено ВИЧ-инфекции и СПИД, при которых CD4+CD38+ наблюдается экстремальное увеличение и, особенно, CD8+CD38+лимфоцитов, причем число этих клеток позитивно коррелирует с тяжестью заболевания и с неблагоприятным прогнозом [208, 263, 375, 410]. При других инфекционных заболеваниях, например, при герпетической и ВЭБинфекции, также может увеличиваться число Т-клеток, несущих данный рецептор [340, 406].

Встречаются лишь единичные публикации, посвященные исследованию уровня экспрессии CD38 при аутоиммунной патологии. Например, у больных с активной формой СКВ выявлено увеличение количества CD3+CD8+CD38+ по сравнению с неактивной формой заболевания и здоровыми донорами [273]. С результатами этой научной работы согласуются данные других авторов, согласно которым экспрессия CD38 на Т-хелперах и цитотоксических Т-клетках у больных с СКВ была увеличена по сравнению со здоровым контролем [305]. В-лимфоциты больных с активной формой СКВ также характеризовались повышенной экспрессией CD38 по сравнению с контрольной группой [93]. У больных с ревматоидным артритом, напротив, число CD4+CD38+ было снижено по сравнению со здоровыми донорами, причем их количество отрицательно коррелировало с активностью заболевания [337].

Дальнейшее исследование изменения экспрессии CD38 при аутоиммунной патологии представляется весьма перспективным, так как этот рецептор вовлечен в реализацию большого числа различных иммунологических функций. Было высказано предположение, что ген CD38 является кандидатным геном восприимчивости к СКВ, поскольку он находится в регионе 4р15, определяющем риск развития этого заболевания [168]. Для проверки этого предположения проведено исследование ассоциации аллельных вариантов интронов 1 (C/G) и 418 (C/T) гена CD38 с развитием СКВ, прямых параллелей не выявлено [168]. Однако, в этом же исследовании обнаружено увеличение частоты аллельного варианта СС у пациентов с дискоидной волчанкой. Эти результаты определяют актуальность дальнейшего исследования молекулы CD38 и кодирующего ее гена при аутоиммунной патологии.

Еще одним аргументом, подтверждающим значимость CD38-позитивных Тлимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях является их возможное участие в негативной регуляции иммунной системы. На нокаутных по CD38 мышах было показано, что отсутствие этого рецептора утяжеляет течение люпус-подобного заболевания животных, высказано соответствующее предположение, что CD38 способен подавлять гиперреактивность иммунной системы [393]. При экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите мышей CD4+CD38highлимфоциты in vivo смягчали течение заболевания, in vitro они были способны подавлять пролиферацию CD4-позитивных эффекторных Т-клеток мышей за счет выработки IFN- [82]. Причем супрессорная активность этих клеток при клеточном контакте была независима от выработки TGF- и гранзима CD4+CD38highлимфоциты В. человека также подавляли пролиферацию эффекторных Т-хелперов in vitro [82]. CD38-позитивные В-лимфоциты также могут принимать участие в супрессии иммунного ответа. Так, было установлено, В-лимфоциты человека с фенотипом CD19+IgDlowCD38+CD24lowCD27что способны ограничивать развитие моноцитов в дендритные клетки и дальнейшую дифференцировку последних [280].

CD95, или Fas-рецептор (FasR, АРО-1) относится к поверхностным рецепторам лимфоцитов, способным запускать процесс апоптоза, его экспрессия резко возрастает при активации клеток [339, 401]. CD95 принадлежит к семейству TNF-рецепторов, члены которого имеют от одного до пяти экстрацеллюлярных доменов и один внутрицитоплазматический домен (death domain), участвующий в трансдукции апоптотического сигнала [266]. FasR является трансмембранным рецептором I типа, но, в результате альтернативного сплайсинга, может существовать в растворимой форме [222].

FasR может экспрессироваться практически на всех клетках организма [32].

Лиганд Fas рецептора, специфический белок FasL, относящийся к семейству TNFподобных цитокинов, представлен преимущественно на активированных лимфоцитах и клетках некоторых «забарьерных» органов (клетки Сертоли, эпителий роговицы, сетчатка) [222]. Активированные Т-хелперы экспрессируют как FasR, так и FasL и, тем самым, способны к автономному апоптозу, то есть к самоуничтожению [222].

Данные разных авторов относительно уровня экспрессии CD95 на Тлимфоцитах у здоровых доноров чрезвычайно сильно варьируют: от 5% до 50% [94, 107, 275, 301]. Причем, некоторые авторы указывают на несколько более высокую экспрессию CD95 на Т-хелперах, чем на цитотоксических Т-клетках [239], тогда как другие приводят противоположные данные [94]. Очевидно, что столь значительные различия в результатах разных авторов обусловлены отсутствием стандартизации процедур проточной цитометрии при определении экспрессии CD95 на лимфоцитах. У здоровых детей FasR экспрессировался на 16,2% CD3+CD4+лимфоцитах и 12,3% CD3+CD8+лимфоцитах [239].

Отмечено, что между интенсивностью экспрессии FasR и степенью апоптоза зачастую неправомерно ставится знак равенства, тогда как экспрессия этого рецептора является лишь отражением потенциальной готовности клеток к восприятию апоптогенного сигнала [45]. В последнее время было показано, что CD95 способен проводить неапоптогенные сигналы, способствующие воспалению, канцерогенезу и регенерации клеток печени и периферических нервов [368] и обеспечивать миграцию в ткани устойчивых к апоптозу клеток [351]. В зависимости от других факторов, воздействующих на клетку, взаимодействие FasR с соответствующим лигандом может приводить как к апоптотической гибели клетки, так и к активации ядерного транскрипционного фактора NF-B [290].

Тем не менее, как один из рецепторов, опосредующих апоптотическую гибель клеток, CD95, вовлечен в патогенез многих заболеваний. Усиление апоптоза лимфоцитов, а также повышение экспрессии FasR, наблюдается при острых и хронических вирусных инфекциях, сепсисе [33, 45, 60].

Дефицит CD95 и/или CD95L приводит к развитию лимфопролиферативной и аутоиммунной патологии [265]. Снижение экспрессии CD95 на активированных лимфоцитах является важным звеном патогенеза многих аутоиммунных заболеваний: системной красной волчанки, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, синдрома Шегрена, инсулинзависимого сахарного диабета, псориаза и др. [33, 46, 72, 349]. У мышей с генетическим дефектом FasR или FasL развивается тяжелое аутоиммунное заболевание, схожее с СКВ [314]. Наличие дефектного гена FasR у человека проявляется как первичный иммунодефицит аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS) [417]. У пациентов с ревматоидным артритом обнаружено повышение частоты ряда полиморфизмов в генах FasR и FasL, по сравнению со здоровыми донорами [274], что также подтверждает вовлеченность системы FasR – FasL в патогенез данного заболевания. Однако при ювенильном идиопатическом артрите таких ассоциаций не выявлено [140].

Одним из самых изученных маркеров активации Т-лимфоцитов является молекула гистосовместимости II класса HLA-DR [57]. Помимо Т-лимфоцитов, это рецептор может присутствовать на моноцитах, макрофагах, В-лимфоцитах [33].

HLA-DR является маркером поздней активации зрелых Т-лимфоцитов, начинает экспрессироваться на мембране клеток примерно с третьих суток после активации [57]. HLA-DR-позитивные Т-лимфоциты циркулируют в периферической крови в течение продолжительного времени [33].

Различные авторы приводят весьма разнящиеся величины нормального уровня экспрессии HLA-DR на Т-лимфоцитах ив их субпопуляциях. Например, для общего пула Т-лимфоцитов у взрослых приводятся следующие пределы: 0,5менее 12% [22], 7,4-9,0% [321]. В литературе имеются свидетельства о том, что экспрессия HLA-DR на Т-клетках с возрастом несколько повышается [321]. Однако другие авторы в качестве нормативных значений для детей 9-12 лет приводят пределы 3-14%, а для взрослых (16-80 лет) эти рамки смещены в меньшую сторону: 0-12% [51].

Экспрессия HLA-DR на Т-хелперах и цитотоксических Т-лимфоцитах также может различаться. Например Vitelli-Avelar D.M. c соавт. в качестве нормативных значений HLA-DR-позитивных клеток у здоровых детей в возрасте от 9 до 14 лет приводят 3,4 ± 0,9 на Т-хелперах и 5,3 ± 2,6 на цитотоксических Т-лимфоцитах [396]. В некоторых работах встречаются довольно высокие значения спонтанной экспрессии HLA-DR, например, по данным Xing Y. c соавт., количество CD8+HLA-DR+ у здоровых доноров составило 17±6% [406].

Количество Т-клеток увеличивается при HLA-DR-позитивных инфекционных, аллергических и некоторых аутоиммунных процессах [33, 71, 251]. Например, у пациентов с системным склерозом число HLA-DR+лимфоцитов было увеличено по сравнению с контролем [301, 353]. Y. Tamimoto c соавт. (2008) в своей работе, посвященной исследованию пациентов с СКВ, указывают на чрезвычайно высокие цифры экспрессии HLA-DR на Т-лимфоцитах: 32,1±15,5% на CD4+ и 57,4±23,1% на CD8+ [363]. У пациентов с кожной красной волчанкой CD4+ также выявлено увеличение числа HLA-DR-позитивных и CD8+лимфоцитов, причем число этих клеток прямо коррелировало с индексом активности заболевания [398]. Выявлено повышение по сравнению со здоровыми донорами экспрессии HLA-DR клетками пораженной кожи при СКВ [404]. У пациентов с СКВ с нейропсихическим поражением число HLA-DR-позитивных цитотоксических Т-лимфоцитов было увеличено по сравнению с контролем [119].

Однако, в другой работе не было выявлено различий по экспрессии HLADR на цитотоксических Т-лимфоцитах между больными с активной и неактивной формами СКВ и здоровыми донорами [93]. При первичном синдромоме Шегрена, как до терапии этанерцептом, так и после нее не были выявлены изменения уровня экспрессии HLA-DR мононуклеарами периферической крови по сравнению со здоровыми донорами [282].

У больных с ревматоидным артритом и со спондилоартропатиями также не было обнаружено статистически значимых изменений экспрессии HLA-DR на Тлимфоцитах [383]. В другом исследовании было выявлено повышение экспрессии HLA-DR на CD4+ и CD8+лимфоцитах из синовиальной жидкости больных с ювенильным идиопатическим артритом (19,3 и 26,7% соответственно), хотя в периферической крови экспрессия этого маркера была невысока (2,7 и 3,5% CD4+ и CD8+ соответственно) [95]. При реактивном артрите у взрослых пациентов наблюдалось повышение уровня Т-лимфоцитов в HLA-DR-позитивных периферической крови и, особенно, в синовиальной жидкости [84]. При ревматоидном артрите большинство (более 70%) CD4-позитивных Т-лимфоцитов в синовиальной жидкости и синовиальной мембране экспрессировали HLA-DR [407].

Таким образом, повышение уровня экспрессии HLA-DR Т-лимфоцитами периферической крови часто встречается при системных аутоиммунных заболеваниях соединительной ткани, таких как системная склеродермия и СКВ.

Для аутоиммунных заболеваний суставов у детей и взрослых увеличение количества клеток в периферической крови менее HLA-DR-позитивных характерно, однако в пораженных суставах наблюдается экспансия Тлимфоцитов, несущих данный маркер.

1.4. Экспрессия маркеров активации лимфоцитов при стимуляции in vitro

Оценка активации лимфоцитов in vitro является инструментом изучения иммунной реактивности в рамках различных экспериментальных моделей.

Стимуляция поликлональными активаторами, например, фитогемагглютинином или конкавалонином А, позволяет исследовать общую реактивность той или иной популяции клеток, и может быть использована как универсальный метод для исследования различных патологических процессов, независимо от их этиологии и патогенетических особенностей. Стимуляция специфическими активаторами потенциально несет информацию о реагировании антигенспецифических клеток, и применима для исследования конкретной патологии.

При определении активационных маркеров воздействие стимуляторов может быть использовано для повышения экспрессии исследуемого рецептора, поскольку в норме большинство активационных рецепторов представлены лишь на небольшом числе клеток. При исследовании интактных клеток, в большинстве случаев может быть зафиксировано лишь повышение экспрессии маркера при патологии, так как нижняя граница присутствия активационного рецептора часто равна нулю [51]. Стимуляция позволяет выявить и повышение, и снижение экспрессии исследуемой молекулы в ответ на стимулирующий сигнал. Например, Lisowska A. с соавт. (2012) в условиях ex vivo не выявили различия между больными с хронической почечной патологией и здоровыми донорами по экспрессии CD25, CD28, CD69, CD95 и HLA-DR на Т-хелперах периферической крови, а при стимуляции антителами к CD3 у больных обнаружено снижение экспрессии CD25 и CD69 относительно контрольного уровня [240].

Методики оценки стимулированной экспрессии поверхностных рецепторов лимфоцитов развиваются с 80-х годов века как альтернатива XX использовавшимся ранее методам оценки пролиферативной активности клеток в ответ на активирующие агенты. Исследование экспрессии рецепторов лимфоцитов после стимуляции с помощью проточной цитометрии является боле простым методом и не требует специально оборудованных помещений по сравнению с методикой оценки включения [3Н]-тимидина, наиболее часто применявшейся для оценки пролиферации. Кроме того, с помощью проточной цитометрии можно исследовать конкретные маркеры на конкретных популяциях клеток, что предоставляет широкие возможности для исследователя. Еще в 90-е годы были проведены работы, в которых сравнивалась информативность различных лабораторных методов. Например, в работе Simms P.E. и Ellis T.M.

(1996) сопоставлены результаты определения экспрессии CD69 на лимфоцитах и оценки пролиферации лимфоцитов с помощью включения [3Н]-тимидина [347].

Было установлено, что данные методы давали аналогичную информацию в условиях стимуляции антителами к CD3 и стафиллококковым энтеротоксином В, оценка уровня CD69 была даже более чувствительной в случае использования анти-CD3. Поскольку число CD69-позитивных клеток превышало число лимфоцитов с тимидиновой меткой, было предположено, что не все CD69экспрессирующие клетки потенциально готовы к пролиферации, для чего они нуждаются в дополнительных сигналах [347]. В работе Zella D. с соавт. (1998) также было отмечено увеличение количество CD25 и HLA-DR-позитивных Тклеток при стимуляции IL-2, и сделан вывод, что оценка экспрессии этих активационных молекул является чувствительным методом оценки активации и пролиферативной способности лимфоцитов [416].

Однако в другой работе, посвященной сравнению разных методов оценки клеточной стимуляции, не было выявлено корреляции между результатами включения [3Н]-тимидина и числом Т-лимфоцитов, несущих активационные маркеры: Хотя, что касалось CD69, CD25, CD71, HLA-DR [108].

дифференцировки клеточной стимуляции как позитивной или негативной, - все методы были согласованы между собой. Было также отмечено, что не все сигналы, приводящие к клеточной активации, способны индуцировать пролиферативную активность. В более поздней работе проведено сравнение методов включения [3Н]-тимидина, окраски карбоксифлюоресцеин диацетат сукцинимидил эфиром (CFSE) и экспрессии различных активационных маркеров [227]. Авторами выявлена корреляция между первыми двумя методами и экспрессией CD25, CD27, CD38, CD152, CD71 в образцах мононуклеаров периферической крови с высокой пролиферативной активностью (при стимуляции ФГА), но не с экспрессией CD134, CD195, HLA-DR и CD69. То есть, прямые методы исследования пролиферации, такие как включение [3Н]-тимидина и окраска CFSE, лишь ограниченно согласуются с экспрессией активационных маркеров.

Выбор агента для стимуляции зависит от конкретной задачи эксперимента, в частности, - исследуемой клеточной популяции. Существуют стимуляторы, преимущественно активирующие определенные популяции клеток, например, фитогемагглютинин (ФГА) в большей степени индуцирует пролиферацию Тлимфоцитов [13]. Однако следует учитывать, что даже при применении «высокоспециализированных» стимуляторов, таких как антитела к CD3, возможна опосредованная стимуляция других клеточных популяций, в данном случае – не-Т-лимфоцитов [347].

Кроме митогенов и других неспецифических стимуляторов возможно использование специфических агентов в рамках исследования конкретной нозологии. Например, применение туберкулина для стимуляции экспрессии CD69 позволило дифференцировать здоровых лиц, получивших in vitro противотуберкулезную прививку, и больных туберкулезом в активной и неактивной форме [79]. Использование стафилококкового энтеротоксина В как стимулятора экспрессии CD69 было предложено в качестве модели для изучения стафилококковой инфекции, атопического дерматита, синдрома Кавасаки [236], заболеваний среднего уха [180].

Выбор поверхностного или внутриклеточного маркера, экспрессия которого будет исследована при стимуляции, определяется задачей научной работы, а также некоторыми методическими нюансами. Как уже говорилось выше, для оценки общей активации лимфоцитов определяется экспрессия широкого ряда рецепторов Т-лимфоцитов (CD69, CD25, CD38, HLA-DR и других) при воздействии различных стимуляторов [284, 328, 347]. Для исследования готовности клеток к апоптозу возможно определение CD95, однако, данный рецептор может участвовать как в процессах программируемой клеточной гибели, так и в пролиферации лимфоцитов [46].

Что касается методической стороны клеточной стимуляции, то наиболее удобными объектами исследования являются рецепторы, экспрессия которых увеличивается за короткий промежуток времени, что облегчает выполнение лабораторных исследований. CD69 начинает экспрессироваться на мембране клетки спустя полчаса после взаимодействия с индуцирующим агентом, его детекцию с помощью проточной цитометрии, по мнению Simms P.E. с соавт.

(1996), можно проводить уже через 4 часа, через 18-48 часов после стимуляции антителами к CD3 экспрессия CD69 максимальна, к 72 часам она значительно снижается [347]. Такие короткие сроки реагирования чрезвычайно удобны для использования в научной и клинической практике, поскольку всю реакцию можно провести в течение одного рабочего дня. Кроме того, не требуются стерильные условия, так как за столь непродолжительное время в культуре клеток не успевают размножиться микроорганизмы, чтобы как-либо заметно повлиять на результаты исследований.

Молекула CD69 является удобным модельным объектом исследования стимуляции клеток еще и потому, что после воздействия различных индукторов ее экспрессия увеличивается в разы или даже десятки раз, причем изменение дозы стимулятора приводит к дозозависимому изменению экспрессии CD69 [235].

Зависимость экспрессии маркера от дозы стимулятора предполагает выбор оптимальных условий эксперимента для оценки процессов активации лимфоцитов при той или иной патологии. Например, в работе Fernandez-Gutierrez B. с соавт. [158] стимуляция с помощью форболмиристилацетата в течение 18 часов приводила к чрезвычайно интенсивному повышению экспрессии CD69 на Т-лимфоцитах: 97% у пациентов с СКВ и 99% в контрольной группе. Очевидно, выравнивание экспрессии CD69 в обеих обследованных группах на почти стопроцентном уровне, обусловлено неудачным выбором режима стимуляции.

Возможно, различия между больными с СКВ и здоровыми донорами проявились бы при использовании меньшего срока инкубации или меньшей дозы форболмиристилацетата. В этом же исследовании выявлено, что после 18-часовой стимуляции антителами к CD3 у пациентов с СКВ количество Т-клеток, экспрессировавших CD69, было существенно ниже (61%), чем в контроле (71%) [158]. То есть, в данном случае были выбраны приемлемые условия стимуляции.

Обращает на себя внимание, что в вышеприведенном примере экспрессия CD69 после стимуляции у больных с СКВ была значительно ниже, чем у здоровых людей. В других работах также прослеживается подобная закономерность. Разными авторами показано, что спонтанная экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах, Т-хелперах и цитотоксических Т-клетках, выделенных из периферической крови, у больных с активной и неактивной формой СКВ была выше, чем в контрольной группе, а при стимуляции различными агентами (ФГА, форболмиристилацетатом, IL15 и т.д.), напротив, - значительно ниже, чем у здоровых доноров [83, 124, 312]. Соответственно, при СКВ изменения спонтанной и стимулированной экспрессии CD69 в сравнении со здоровыми лицами носят разнонаправленный характер.

Если в случае повышения экспрессии какого-либо активационного маркера лимфоцитов у больных обычно говорят об «активации» иммунной системы, то при сниженном ответе данного маркера на стимуляцию, вероятно, нужно говорить о «дефиците активации». Подобная разнонаправленность изменений спонтанной и стимулированной экспрессии различных молекул затрудняет интерпретацию их роли в развитии патологии, в частности аутоиммунной. В данном случае непонятно, являются ли эти закономерности проявлением гипоили гиперреактивности иммунной системы, и какая ситуация более благоприятна при аутоиммунном заболевании: снижение или повышение экспрессии данного маркера. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования не только при СКВ, но и при других аутоиммунных заболеваниях, при которых данные о спонтанной и стимулированной экспрессии CD69 крайне недостаточны.

В качестве объяснения вышеприведенных противоречий могут служить результаты, полученные рядом исследователей в последние 10-15 лет и формирующие новый взгляд на физиологическую роль CD69. В ранних работах, посвященных изучению функций этого рецептора, указывалось на его провоспалительное действие и участие в процессах пролиферации Т-лимфоцитов [110, 373]. Однако в последнее время показано, что CD69-дефицитные мыши характеризуются нормальным гемопоэзом и составом Т-клеточных субпопуляций в тимусе и на периферии, а также нормальным пролиферативным ответом на Т- и В-клеточные стимуляторы [229]. Кроме того, эта линия мышей характеризуется более тяжелым, чем у животных дикого типа, течением коллагениндуцированного артрита, что сопровождается повышенной продукцией провоспалительных цитокинов и сниженной [330]. При

- TGF-1 экспериментальном аутоиммунном миокардите и при овальбумининдуцированной астме у CD69-дефицитных мышей развивается мощный воспалительный ответ [126]. Развитие экспериментального атеросклероза у CD69дефицитных мышей сопровождается более интенсивными признаками воспаления, чем у контрольных животных, хотя отсутствие CD69 и не влияет на величину и количество атеросклеротических бляшек [169]. На аналогичных экспериментальных животных было показано, что CD69 способен ограничивать развитие астмы и контактной гиперчувствительности [257].

Iмыши после прививки опухоли MHC class CD69-дефицитные демострировали меньший опухолевый рост, большую выживаемость, высокую активность натуральных киллеров и сниженную продукцию TGF-1 по сравнению с мышами дикого типа [153]. В свою очередь, количество CD4+CD69+CD25- клеток может значительно повышаться у пораженных опухолями нормальных мышей (до 40%), эти клетки подавляют пролиферацию CD4+лимфоцитов и экспрессируют мембраносвязанный TGF и высокий уровень CD122 [179]. На экспериментальной модели новозеландских мышей, которые CD4+CD69-, спонтанно развивают СКВ, было продемонстрировано, что выделенные из селезенки, продуцировали значительные количества IL2, IL3, IL4, тогда как CD4+CD69+лимфоциты не были способны к такой продукции, однако, при сокультивировании, могли подавлять синтез IL2 CD4+CD69-клетками [202].

То есть, могли осуществлять негативную регуляцию CD69+лимфоциты иммунного ответа, по крайней мере, in vitro.

При исследовании молекулярных механизмов влияния CD69 на иммунный ответ выявлено, что CD4+лимфоциты CD69-дефицитных мышей в условиях антигенной стимуляции индуцировали экспансию in vitro Th17, сопровождавшуюся выраженной экспрессией матричной РНК интерлейкина 17 (IL17), рецептора интерлейкина 23 (IL23-R) и ядерного орфанного рецептора ретиноевой кислоты t (RORt) [256]. Было показано, что цитоплазматическая часть CD69 ассоциирована с Jak3/Stat5-сигнальным путем, который регулирует транскрипцию RORt и ингибирует дифференцировку Th17 [258]. Был сделан вывод о том, что молекула CD69 принимает непосредственное участие в дифференцировке провоспалительной хелперной популяции.

Результаты вышеприведенных работ указывают на значительную роль Тлимфоцитов, экспрессирующих CD69, в негативной регуляции иммунного ответа.

Однако есть и противоположные данные, полученные также на CD69дефицитных мышах. Индуцированное в эксперименте аллергическое воспаление дыхательных путей и коллаген-индуцированный артрит протекали у этих животных значительно мягче, чем у мышей дикого типа [269, 285]. Введение антител к CD69 уменьшало степень проявления воспалительного процесса у животных дикого типа [269].

Последний факт может быть объяснен результатами еще одной работы, выполненной на мышах с коллаген-индуцированным артритом [330]. Было показано, что при введении антител к CD69 IgG1 anti-CD69 mAb 2.2 течение заболевания ухудшалось, что коррелировало со снижением экспрессии CD69. При введении других антител IgG2a anti-CD69 mAb 2.3 в ранней стадии развития артрита была достигнута только парциальная деплеция CD69 in vivo, а течение заболевания становилось более мягким.

В другой работе было выявлено, что введение мышам дикого типа антител к CD69 вызывало подавление экспрессии данного рецептора и значительную интенсификацию иммунного ответа (в данной модели – противоопухолевого) [153]. Обработка антителами к CD69 (anti-CD69 2.2) зрелых Т-лимфоцитов с фенотипом клеток памяти приводила к их пролиферации в отсутствие антигенного стимула [65]. То есть ингибирование CD69 антителами к нему приводит к повышению активности иммунной системы и, в случае аутоиммунных заболеваний, может иметь патогенетическое, а в случае онкопатологии – терапевтическое значение.

С этим согласуются данные о присутствии аутоантител к CD69 у больных с аутоиммунными заболеваниями. Антитела IgG-класса к CD69 были обнаружены у 38,3% пациентов с ревматоидным артритом, у 14,5% пациентов с СКВ и у 4,0% - с болезнью Бехчета [415]. При этом больные с ревматоидным артритом, позитивные по данным антителам, характеризовались более высокими уровнями ревматоидного фактора и СОЭ.

Таким образом, большинство литературных данных указывает на наличие супрессорных функций Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD69, по крайней мере, у мышей. Данные об уровне экспрессии данного маркера при различных аутоиммунных заболеваниях могут служить косвенным подтверждением наличия аналогичной супрессорной популяции у человека. Увеличение спонтанного количества CD69-позитивных Т-клеток может быть проявлением компенсаторной реакции иммунной системы на развитие аутовоспаления. Низкий уровень экспрессии CD69 после стимуляции у больных с различной патологией, указывает на истощение резервных возможностей этой субпопуляции Т-лимфоцитов. В целом можно заключить, что изучение роли CD69-позитивных Т-клеток в патогенезе аутоиммунных заболеваний необходимо для понимания природы и механизмов развития этой патологии, а использование методов клеточной стимуляции позволяет получить больше информации при исследовании экспрессии активационных маркеров.

Еще одним рецептором лимфоцитов, определяемым в условиях стимуляции в качестве маркера общей активации различных популяций лимфоцитов, прежде всего Т-клеток, является CD25 [108, 227]. Для индукции экспрессии этой молекулы используется широкий спектр стимуляторов: ФГА, форболмиристилацетат, антитела к CD3 и т.д. [240, 251, 306, 412].

Однако, поскольку CD25 является маркером регуляторных Т-клеток, в ряде работ проведена оценка количества и функциональной активности Treg после стимуляции in vitro. Стимуляция экспрессии CD25 и индукция трансформации наивных Т-хелперов в регуляторные Т-лимфоциты используются и как модели оценки реактивности Т-лимфоцитов, и для получения обогащенной регуляторными Т-клетками суспензии лимфоцитов в качестве in vitro потенциального терапевтического средства при различных видах гиперреактивности [11, 244, 386]. В последнем случае, согласно обзору литературы, выполненному Р. Trzonkowski и соавторами (2009), наиболее часто для индукции регуляторных Т-лимфоцитов in vitro используется сочетание моноклональных антител к CD3 и CD28, иногда к ним добавляется IL-2 [386].

Сочетание антител к CD3 и CD28 также часто применяется с целью исследования реактивности регуляторных Т-лимфоцитов [386]. В одной из работ, где использованы эти стимуляторы, количество клеток с фенотипом CD4+CD25+CD127low значительно возрастало (более чем в три раза), однако только около одной трети этих клеток экспрессировали Foxp3 и были функционально активны (подавляли пролиферацию активированных эффекторных Т-лимфоцитов при сокультивировании) [360]. Было сделано предположение о том, что рост числа CD4+CD25+CD127low лимфоцитов после стимуляции не отражал истинную динамику количества Treg, хотя при отсутствии стимуляции клетки с фенотипами CD4+CD25+Foxp3+ и CD4+CD25+CD127low совпадали примерно на 80% и проявляли соответствующую супрессорную активность [360]. Возможно, зафиксированное в данной работе отсутствие супрессорной активности Treg, индуцированных in vitro, объясняется малым временем стимуляции (двое суток), недостаточным для полноценного проявления функциональных характеристик данных клеток. В исследовании Mahic М. с соавт.

(2008) выявлена рансформация наивных Т-хелперов в регуляторные Т-клетки, как при воздействии антител к CD3 и CD28, так и стафиллококкового энтеротоксина В. Причем, «регуляторный» фенотип CD4+CD25+Foxp3+ у них формировался на вторые сутки, а «регуляторные» свойства (подавление выработки IFNактивированными эффекторными Т-лимфоцитами при сокультивировании) – проявлялись только на 7 сутки активации [250].

В других исследованиях, в которых для индукции Treg из наивных Тхелперов in vitro использовано сочетание антител к CD3 и CD28 и сроки стимуляции более 2 суток, выявлено увеличение численности регуляторных Тклеток, проявлявших полноценную супрессорную активность и подавлявших пролиферацию эффекторных клеток [97, 123]. Стимуляция наивных Т-хелперов in vitro антителами к CD3 и CD28 в сочетании с IL-2 или IFN- также приводила к увеличению числа функционально активных (способных подавлять пролиферацию клеток-мишеней при сокультивировании) регуляторных Т-клеток [146, 195]. При стимуляции через Т-клеточный рецептор посредством бычьего лактоглобулина наблюдалось увеличение количества с фенотипом Treg CD4+CD25+CD127low [262]. Использование фитогемагглютинина в качестве стимулятора индуцировало общее повышение экспрессии CD25, коррелировавшее с количеством CD4+CD25highFoxp3+ [371]. Полученные в последних двух работах индуцибельные Treg также были функционально полноценны и подавляли пролиферацию CD4+CD25- при сокультивировании.

Таким образом, довольно широкий спектр различных стимуляторов может быть использован для индукции регуляторных Т-клеток in vitro. Использование стимуляции различными агентами является перспективным для углубленного исследования закономерностей экспрессии CD25 на Т-лимфоцитах в целом и для исследования реактивности регуляторных Т-клеток при различной патологии. К сожалению, в литературе крайне скудны сведения об экспрессии CD25 и количестве Treg в условиях стимуляции при аутоиммунных заболеваниях.

Единичные исследования, опубликованные в этой области, посвящены проблеме получения индуцибельных регуляторных Т-клеток в качестве потенциального терапевтического средства. Например, при индукции in vitro регуляторных Тклеток антителами к CD3 и CD28 и одновременном воздействии IL-2, удалось получить функционально полноценные в культуре Т-хелперов Treg периферической крови детей с сахарным диабетом I типа [244]. Эти клетки, как и Тreg здоровых детей были способны подавлять пролиферацию аутологичных эффекторных Т-лимфоцитов при сокультивировании. В другом исследовании также сообщается об успешной индукции функционально активных Тreg антителами к CD3 и CD28 и IFN- при синдроме Гийена-Барре [195]. Данные об изменении экспрессии CD25 и количестве Treg после стимуляции при ревматических заболеваниях в литературных источниках отсутствуют.

Маркеры активации лимфоцитов CD69 и CD25 являются наиболее изученными при стимуляции in vitro. Число исследований, посвященных экспрессии в условиях стимуляции других активационных молекул, таких как CD38, CD95, CD71 и т.д., – намного меньше. В литературе имеются лишь единичные публикации, в которых исследована индукция экспрессии CD38 при воздействии различных агентов. Согласно последним исследованиям CD4+CD38+лимфоциты слабо отвечают на воздействие IL-2 и характеризуются гипопролиферацией в ответ на стимуляцию in vitro [333]. У мышей CD3+лимфоциты, экспрессировавшие также обладали сниженной CD38, пролиферативной способностью в ответ на воздействие митогена, но могли продуцировать IL-2 и IFN- [331]. Стимулированная in vitro экспрессия CD38 на Т-клетках экспериментальных животных возрастала слабее, чем экспрессия CD25 и CD69 [331]. В этой же работе показано, что увеличение (хоть и слабое) количества Т-лимфоцитов при воздействии ФГА, CD38-позитивных форболмиристилацетата, конковаланина А и антител к CD3 происходило довольно быстро – через 1-4 часа после начала стимуляции и достигало максимума через сутки. Однако в другой работе отмечено, что экспрессия CD38 после воздействия ФГА на лимфоциты здоровых доноров увеличивалась в несколько раз [69].

Изменение экспрессии CD38 изучалось на различных культурах клеток.

Например, Drach и соавторы установили, что инкубация миелоидных клеток человека HL-60 с трансретиноевой кислотой значительно усиливала экспрессию CD38 [142]. Стимуляция форболовым эфиром тонзиллярных В-лимфоцитов человека также способствовала увеличению количества CD38-позитивных клеток [427]. Воздействие IL-4 на клеточную линию лимфомы человека Farage, напротив, снижало экспрессию CD38 [345].

Исследование экспрессии CD38 лимфоцитами человека при различных заболеваниях в условиях стимуляции in vitro упоминается в немногочисленных литературных источниках. Проводились исследования количества CD38позитивных при ВИЧ-инфекции. Воздействие липополисахарида приводило к усилению экспрессии CD38 на цитотоксических Т-клетках, но не на Т-хелперах у больных с ВИЧ [378]. После инкубации с антагонистом хемокинового рецептора 5 маравираком количество Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессировавших CD38, у ВИЧ-инфицированных пациентов имело тенденцию к снижению [74]. Исследована экспрессия при воздействии CD38 фитогемагглютинина и антигена Brucella melitensis у больных с бруцеллезом, у которых она была выше, чем у здоровых доноров Данные о [69].

стимулированной экспрессии CD38 при аутоиммунной патологии в литературе отсутствуют.

Таким образом, определение стимулированной in vitro экспрессии маркеров активации является перспективным подходом для оценки функционального статуса лимфоцитов в норме и при патологии. Стимуляция позволяет выявить особенности экспрессии этих рецепторов, не проявляющиеся при определении их спонтанного уровня. В условиях стимуляции исследовалась экспрессия различных активационных молекул, однако число таких работ намного меньше, чем исследование спонтанной экспрессии этих же рецепторов. При аутоиммунной патологии данная проблематика изучена недостаточно, существуют лишь немногочисленные работы на эту тему, не позволяющие получить полноценную характеристику функционального состояния лимфоцитов периферической крови при аутоагрессии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованы дети и подростки от 6 до 17 лет. В исследование включены дети с ревматическими заболеваниями аутоиммунной природы: с ювенильным идиопатическим артритом (ЮИА, n=100), с ювенильной склеродермией (ЮСД, локализованная форма, n=16), с системной красной волчанкой (СКВ, n=15) и дети с инфекционно-аутоиммунным заболеванием – реактивным артритом (РеА, n=22). Диагнозы установлены врачами Козловой Е.С. и Скоробогатовой О.В. областной детской поликлиники (заведующая поликлиникой Подоляк Е.В.) ГБУЗ СО Областной детской клинической больницы №1 (ОДКБ№1).

Диагноз ювенильного артрита был установлен согласно критериям Международной лиги обществ ревматологии (ILAR, Durban, 1997); диагноз реактивного артрита – в соответствии с критериями Международного совещания по реактивным артритам (Berlin, 1997); диагноз ювенильной склеродермии - согласно предварительным классификационным критериям, принятым Международной согласительной конференцией детских ревматологов (2004); диагноз системной красной волчанки - в соответствии с критериями Американского колледжа ревматологов (ACR, 1997). В группу с ЮИА было включено 45 больных с олигоартикулярным ювенильным артритом (30 детей – с персистирующим артритом, 15 – с распространившимся), 22 - с полиартикулярным ювенильным артритом, 20 с артритами, ассоциированными с энтезитом, 12 - с системным вариантом ювенильного артрита. Все дети с ЮИА были серонегативны по ревматоидному фактору.

В качестве первой группы сравнения (контрольной) обследовано 32 условно здоровых ребенка (УЗД) без признаков наличия аутоиммунных заболеваний, в группу включены дети, не имевшие острых заболеваний и травм на момент обследования и за месяц до него. Критерием исключения являлось наличие хронических воспалительных заболеваний. В качестве второй группы сравнения обследовано 24 больных с хроническим вирусным гепатитом С (ХГС), госпитализированных в гастроэнтерологическое отделение ГБУЗ СО ОДКБ№1 (заведующая отделением Новожилова Е.П.). Исследованные группы были сопоставимы по половому составу и возрасту обследованных детей (таблица 1). Длительность заболевания варьировала, она была наименьшей в группе с РеА, и наибольшей – у больных с ХГС.

Обобщенные данные об исследованных группах представлены в таблице

2. Большинство больных с ЮИА (74 ребенка) находились в стадии активности заболевания (активность 1-3, ЮИА-а). Все они получали болезньмодифицирующую терапию (метотрексат и/или сульфасалазин и/или циклоспорин А), в единичных случаях они принимали глюкокортикостероиды (3 человека с системным ЮИА) и лефлуномид (1 человек с полиартикулярным ЮИА), все дети в группе получали нестероидные противовоспалительные средства по потребности. 14 пациентов в стадии ремиссии также получали аналогичную болезнь-модифицирующую терапию и нестероидные противовоспалительные средства по потребности (медикаментозная ремиссия, ЮИА-мр). Пациенты со стойкой ремиссией (12 детей) не получали лекарственную терапию (ЮИА-р).

Дети с реактивным артритом (16 человек) находились в активной стадии заболевания (активность 1-2), лечение проводилось с помощью нестероидных противовоспалительных средств в качестве монотерапии или в комбинации с антибиотиками. Большинство больных с ЮСД (13 человек) имели подострую форму заболевания, три ребенка – острую форму, все дети получали болезньмодифицирующую терапию (купренил и/или плаквенил, средства местного применения), помимо этого, 7 детей (3 с острой формой и 4 с подострой) принимали глюкокортикостероиды.

Дети с СКВ были в стадии активности заболевания (активность 1-3), получали болезнь-модифицирующую терапию:

во всех случаях использовались глюкокортикостероиды (преднизолон, метилпреднизолон) и препараты, имеющие цитостатическое и иммунодепрессивное действие (гидроксихлорин, азатиоприн, микофенолат натрия, циклофосфан). Все дети с аутоиммунными заболеваниями и реактивным артритом планово посещали прием ревматолога в Областной детской поликлинике ГБУЗ СО ОДКБ№1.

Больные с ХГС на момент обследования находились на госпитализации в гастроэнтерологическом отделении ГБУЗ СО ОДКБ№1, получали терапию препаратами интерферона-альфа. На момент обследования пациенты характеризовались умеренной биохимической активностью заболевания или находились вне активности.

Средняя концентрация аланинаминотрансферазы составила 21,7±10,82 МЕ/мл; концентрация аспартатаминотрансферазы:

31,9±17,80 МЕ/мл; вирусная нагрузка (медиана и квартили) составила: 0,1 (0,1мл (по данным амбулаторных карт пациентов).

Все пациенты или их законные представители давали добровольное информированное согласие на лабораторное обследование, что зафиксировано в их амбулаторных картах или историях болезни. Проведение исследовательской работы было одобрено этическим комитетом ГБУЗ СО ОДКБ№1.

2.2. Методы исследования, использованные в работе Все исследования методом проточной цитометрии осуществляли на проточном цитофлюориметре FC-500 (Beckman Coulter, США), оснащенном диодным лазером 488 нм. Математическую обработку цитофлюориметрических данных проводили с помощью программного обеспечения CXP-Analysis (Beckman Coulter, США). Получение образцов крови, пробоподготовка и настройка проточного цитофлюориметра проводилась согласно рекомендациям стандартизованной технологии исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови [53].

Забор крови для исследований методом проточной цитометрии проводился путем пункции локтевой вены в утренние часы строго натощак.

Кровь забиралась в вакуумные пробирки, содержащие литиевую соль гепарина в качестве антикоагулянта. После забора и до начала лабораторных исследований кровь транспортировалась и хранилась при комнатной температуре, в защищенном от солнечного света месте. С момента взятия крови до начала исследований проходило от 30 минут до одного часа.

Окрашивание клеток и лизис эритроцитов. Экспрессию поверхностных маркеров лимфоцитов оценивали с помощью прямого пятипараметрического иммунофлюоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием моноклональных антител согласно инструкции производителя. Для этого моноклональные антитела вносили в образец крови с помощью автоматических дозаторов в объеме, рекомендованном производителем, образец крови после внесения антител инкубировали в защищенном от света месте не менее 15 мин, затем проводилась процедура лизиса.

Использованы следующие коньюгаты моноклональных антител и флюорохромов: CD3-FITC (IgG1), CD3-ECD (IgG1), CD3-PC7 (IgG1), CD4-PE (IgG1), CD4-PC5 (IgG1), CD5-ECD (IgG2a), CD8-PC7 (IgG1), CD16-FITC (IgG1), CD16-PE (IgG1), CD25-PC5 (IgG2a), CD38-PC5 (IgG1), CD45-ECD (IgG1), CD45-PC5 (IgG1), CD56-PE (IgG1), CD69-PC5 (IgG2b), HLA-DR-PE (IgG1), TCR-PE (IgG2b), TCR-FITC (IgG1) (Beckman Coulter, США); CD95-FITC (IgG1), CD127-FITC (IgG1) (eBiosciense, США). Для корректной настройки проточного цитофлюориметра при выполнении исследований использовались изотипические контроли: IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-ECD, IgG1-PC5, IgG1-PC7, IgG2a-ECD, IgG2a-PC5, IgG2b-PE, IgG2b-PC5 (Beckman Coulter, США); IgG1FITC (eBiosciense, США).

Лизис эритроцитов проводили по безотмывочной технологии с использованием лизирующего/фиксирующего реагента Optilyze C (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя: в образец крови добавляли пятикратное количество Optilyze C, инкубировали в защищенном от света месте 15 мин, затем добавляли фосфатно-солевой буфер для остановки реакции в объеме, равном объему использованного Optilyze C, после этого инкубировали в защищенном от света месте не менее 15 мин. Процедуры окраски, лизиса и цитометрического анализа проводили в полипропиленовых пробирках размером 12х75 мм (Sarstedt, Германия).

Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводился с использованием частиц для абсолютного счета Flow Count (Beckman Coulter, США) и моноклональных антител к CD45 (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя.

Относительное содержание лимфоцитов от общего количества лимфоцитов определяли с использованием моноклональных антител к CD45 США). Для выделения популяции лимфоцитов (Beckman Coulter, (гейтирования) вводили логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию и по экспрессии CD45, лимфоциты определялись как клетки наименьшего размера и гранулярности с наиболее высокой экспрессией CD45 (рисунок 1).

Рисунок 1 – Гейтирование общего пула лейкоцитов и лимфоцитов

Абсолютное количество лимфоцитов и абсолютное количество клеток в их популяциях и субпопуляциях определяли путем математического пересчета, исходя из абсолютного количества лейкоцитов.

Для оценки численности популяций и субпопуляций лимфоцитов клетки окрашивали с помощью моноклональных антител в различных сочетаниях.

При проведении цитофлюориметрического анализа регистрировали не менее 10000 лимфоцитов. При оценке экспрессии маркеров активации (CD25, CD38, CD69, CD95, HLA-DR) на Т-лимфоцитах и в их субпопуляциях регистрировали не менее 10000 лимфоцитов в оцениваемой субпопуляции (Т-лимфоциты, Тхелперы, цитотоксические Т-клетки). Оценивали как относительное, так и абсолютное количество клеток (путем пересчета, исходя из абсолютного количества лимфоцитов).

Использованы следующие сочетания моноклональных антител и флюорохромов:

1) CD3-FITC, CD16/56-PE, CD5-ECD, CD45-PC5, CD19-PC7;

2) CD3-FITC, CD16/56-PE, CD45-ECD, CD8-PC7;

3) TCR-FITC, TCR-PE, CD3-ECD, CD4-PC5, CD8-PC7;

4) CD3-FITC, CD4-PE, CD45-ECD, CD69-PC5, CD8-PC7;

5) CD95-FITC, HLA-DR-PE, CD3-ECD, CD4-PC5, CD8-PC7;

6) CD3-FITC, CD4-PE, CD45-ECD, CD38-PC5, CD8-PC7;

7) CD127-FITC, CD4-PE, CD3-ECD, CD25-PC5, CD8-PC7.

Использование вышеперечисленных панелей реактивов позволило выделить лимфоциты со следующими фенотипами:

СD3+ – Т-лимфоциты (рисунок 2, а) СD19+ – В-лимфоциты (рисунок 2, а) СD19+СD5+– В-лимфоциты, экспрессирующие CD5 (рисунок 2, б) СD3+СD4+ – Т-хелперы (рисунок 3, а) СD3+СD8+ – цитотоксические Т-клетки (рисунок 3, а) СD3+СD4-СD8- – дубль-негативные Т-клетки (рисунок 3, а) СD3+СD4+СD8+ – дубль-позитивные Т-клетки (рисунок 3, а) СD3+СD4-СD8-TCR+ – -ТКР-дубль-негативные Т-клетки (рисунок 3, б) СD3+СD4-СD8-TCR+ – -ТКР-дубль-негативные Т-клетки (рисунок 3, б) СD3-СD16/56+ – натуральные киллеры (NK) (рисунок 4, а) СD3+СD16/56+ – Т-натуральные киллеры (NKT) (рисунок 4, а) СD3-СD16/56+ СD8+ – натуральные киллеры, экспрессирующие CD8 (рисунок 4, б) СD3+СD69+– Т-лимфоциты, экспрессирующие CD69 (рисунок 5, а) СD3+СD4+СD69+ – Т-хелперы, экспрессирующие CD69 (рисунок 5, б) СD3+СD8+СD69+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD69 (рисунок 5, в) СD3+СD25+– Т-лимфоциты, экспрессирующие CD25 (рисунок 6, а) СD3+СD4+СD25+ – Т-хелперы, экспрессирующие CD25 (рисунок 6, б) СD3+СD8+СD25+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD25 (рисунок 6, в) СD3+СD4+СD25+СD127low/neg – регуляторные Т-клетки (рисунок 7) СD3+СD4+СD25+СD127+– активированные Т-хелперы (рисунок 7) СD3+СD38+– Т-лимфоциты, экспрессирующие CD38 (рисунок 8, а) СD3+СD4+СD38+ – Т-хелперы, экспрессирующие CD38 (рисунок 8, б) СD3+СD8+СD38+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD38 (рисунок 8, в) СD3+СD95+– Т-лимфоциты, экспрессирующие CD95 (рисунок 9, а) СD3+СD4+СD95+ – Т-хелперы, экспрессирующие CD95 (рисунок 9, б) СD3+СD8+СD95+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD95 (рисунок 9, в) СD3+HLA-DR+ – Т-лимфоциты, экспрессирующие HLA-DR (рисунок 10, а) СD3+СD4+HLA-DR + – Т-хелперы, экспрессирующие HLA-DR(рисунок 10, б) СD3+СD8+HLA-DR+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие HLADR (рисунок 10, в).

а) б) Рисунок 2 - Гейтирование CD3+ (Т-лимфоцитов) и CD19+ (В-лимфоцитов) (а);

гейтирование и CD19+CD5+ (б). Примечание: на цитограммах показаны только лимфоциты.

Рисунок 10 - Количество CD3+HLA-DR+ (а), CD3+CD4+HLA-DR+ (б) и CD3+CD8+HLA-DR+лимфоцитов (в) у здорового ребенка. Примечание: на цитограммах показаны только Т-лимфоциты.

Оценка уровня экспрессии активационных маркеров лимфоцитов при стимуляции in vitro. Забор, хранение и транспортировку образцов крови проводили так же, как для исследования субпопуляций лимфоцитов без стимуляции. Стимуляция клеток периферической крови выполнена согласно рекомендациям Национального руководства по клинической лабораторной диагностике [21] в нашей модификации. Периферическую кровь разводили глутаминсодержащей средой RPMI-1640 (Пан-Эко, Россия) в соотношении 1:9.

Для исследования экспрессии каждого активационного маркера в полипропиленовых пробирках объемом 5 мл (Sarstedt, Германия) готовилась серия из 4 образцов с конечным объемом 500 мкл:

1) Контрольный образец без стимулятора.

2) Образец, стимулированный фитогемагглютинином (ФГА, Sigma) в конечной концентрации 20 мкг/мл.

3) Образец, стимулированный агонистическими антителами к CD3, не конъюгированными с флюорохромом (аCD3, Биокон, Россия), в конечной концентрации 2 мкг/мл.

4) Образец, стимулированный агонистическими антителами к CD3, не конъюгированными с флюорохромом (Биокон, Россия), в конечной концентрации 2 мкг/мл и агонистическими антителами к CD28 в конечной концентрации 0,8 мкг/мл (аCD28, Beckman Coulter, США).

Подготовка стимуляторов для исследования, внесение в образцы крови:

1) Лиофилизированный стерильный ФГА (25 мкг) разводили в 1 мл дистиллированной воды согласно инструкции производителя. Затем матричный раствор разводили фосфатно-солевым буфером до концентрации 1 мМоль/л. Готовый рабочий раствор ФГА вносили в количестве 10 мкл в 490 мкл разведенной крови.

2) Готовый фабричный раствор аCD3 с концентрацией 1 мг/мл разводили фосфатно-солевым буфером до концентрации 0,1 мг/мл. Готовый рабочий раствор аCD3 вносили в количестве 10 мкл в 490 мкл разведенной крови.

3) Лиофилизированные стерильные антитела к CD28 (25 мкг) разводили в 1 мл дистиллированной воды согласно инструкции производителя.

Затем матричный раствор разводили фосфатно-солевым буфером до концентрации 1 мМоль/л. Готовый рабочий раствор ФГА вносили в количестве 10 мкл в 490 мкл разведенной крови После добавления стимуляторов образцы разведенной крови инкубировали по 500 мкл в полипропиленовых пробирках (Sarstedt, Германия) объемом 5 мл при 37°С, в условиях присутствия 5% СО2. Для оценки уровня экспрессии на Т-лимфоцитах периферической крови и в их CD69 субпопуляциях образцы крови инкубировали в течение 4-х часов в спонтанном и стимулированном вариантах. Для оценки уровня экспрессии CD25 и CD38 на Т-лимфоцитах образцы инкубировали в течении 24-х часов в спонтанном и стимулированном вариантах.

После инкубации разведенную кровь центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин. Супернатанты удаляли с помощью автоматического дозатора. Клетки ресуспензировали в оставшемся объеме жидкости (100 мкл), затем окрашивали с помощью моноклональных антител согласно инструкции производителя, как описано выше. Для оценки уровня экспрессии CD69 на Т-лимфоцитах, Тхелперах и цитотоксических Т-клетках применяли следующую панель моноклональных антител, коньюгированных с флюорохромами: CD3-FITC, CD4-PE, CD45-ECD, CD69-PC5, CD8-PC7.

Это позволило выделить клетки с фенотипами:

СD3+СD69+– Т-лимфоциты, экспрессирующие CD69 (рисунок 5, а);

СD3+СD4+СD69+ – Т-хелперы, экспрессирующие CD69 (рисунок 5, б);

СD3+СD4+СD69+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD69 (рисунок 5, в).

Для подсчета количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессирующих CD25, использовали следующую панель: CD3FITC, CD4-PE, CD45-ECD, CD25-PC5, CD8-PC7.

Выделены клетки с фенотипами:

СD3+СD25+– Т-лимфоциты, экспрессирующие CD25 (рисунок 6, а);

СD3+СD4+СD25+ – Т-хелперы, экспрессирующие CD25 (рисунок 6, б);

СD3+СD4+СD25+СD127low/neg – регуляторные Т-клетки (рисунок 7) СD3+СD4+СD25+СD127+– активированные Т-хелперы (рисунок 7) СD3+СD4+СD25+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD25 (рисунок 6, в).

Для оценки уровня экспрессии CD69 на Т-лимфоцитах и в их субпопуляциях использовали следующую панель: CD3-FITC, CD4-PE, CD45Проанализировано количество клеток с ECD, CD38-PC5, CD8-PC7.

фенотипами:

СD3+СD38+– Т-лимфоциты, экспрессирующие CD38 (рисунок 8, а);

СD3+СD4+СD38+ – Т-хелперы, экспрессирующие CD38 (рисунок 8, б);

СD3+СD4+СD38+ – цитотоксические Т-клетки, экспрессирующие CD38 (рисунок 8, в).

После окрашивания в течение 15 минут в защищенном от света месте проводили процедуру лизиса. Эритроциты лизировали по безотмывочной технологии с использованием лизирующего/фиксирующего реагента Optilyze C (Beckman Coulter, США) согласно инструкции производителя, как описано выше. При цитометрическом анализе экспрессии маркеров активации (CD25, CD38, CD69) на Т-лимфоцитах и в их субпопуляциях регистрировали не менее 10000 лимфоцитов в оцениваемой субпопуляции (Т-лимфоциты, Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки). После инкубации подсчитывалось только относительное количество клеток в различных субпопуляциях, без подсчета абсолютных величин.

CD3+лимфоцитов, Интенсивность сигнала при фенотипировании предварительно инкубированных с ФГА в течении 24-х часов, несколько снижалась по сравнению с нестимулированными клетками (рисунок 11, а).

Количество клеток Рисунок 11 - Экспрессия CD3 на лимфоцитах периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только лимфоциты.

Инкубация клеток периферической крови со всеми использованными стимуляторами не приводила к изменению интенсивности экспрессии CD4 (рисунок 12) и CD8 (рисунок 13) на Т-лимфоцитах после инкубации.

Количество клеток Рисунок 12 - Экспрессия CD4 на лимфоцитах периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только лимфоциты.

Количество клеток цитотоксических Т-клеток, экспрессировавших на поверхности CD69 (рисунки 14, 15, 16).

Были вычислены индексы стимуляции количества СD3+СD69+, СD3+СD4+СD69+ и СD3+СD8+СD69+лимфоцитов при различных вариантах инкубации:

1) ФГА/спонтанный: отношение количества CD69-позитивных клеток в соответствующей субпопуляции (Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) после стимуляции ФГА к количеству CD69-позитивных клеток в этой субпопуляции после инкубации без стимулятора.

2) aCD3/спонтанный: отношение количества CD69-позитивных клеток в соответствующей субпопуляции (Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) после стимуляции антителами против CD3 к количеству CD69-позитивных клеток в этой субпопуляции после инкубации без стимулятора.

3) (аCD3, аCD28)/спонтанный: отношение количества CD69-позитивных клеток в соответствующей субпопуляции (Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) после сочетанной стимуляции антителами против CD3 и CD28 к количеству CD69-позитивных клеток в этой субпопуляции после инкубации без стимулятора.

4) (аCD3, аCD28)/аCD3: отношение количества CD69-позитивных клеток в соответствующей субпопуляции (Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) после сочетанной стимуляции антителами против CD3 и CD28 к количеству CD69-позитивных клеток в этой субпопуляции после изолированной стимуляции антителами против CD3.

Количество клеток Рисунок 14 - Экспрессия CD69 на Т-лимфоцитах периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только Т-лимфоциты.

Количество клеток CD69-PC5 Рисунок 15 - Экспрессия CD69 на Т-хелперах периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только Т-хелперы.

Количество клеток Рисунок 16 - Экспрессия CD69 на цитотоксических Т-клетках периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28. Примечание: на цитограммах показаны только цитотоксическиеТ-клетки.

Рисунок 17 - Экспрессия CD25 на Т-лимфоцитах периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только Т-лимфоциты.

Количество клеток Рисунок 18 - Экспрессия CD25 на Т-хелперах периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только Т-хелперы.

Количество клеток Рисунок 19 - Экспрессия CD25 на цитотоксических Т-клетках периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и со стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только цитотоксическиеТ-клетки.

Добавление в инкубационную среду всех использованных стимуляторов (ФГА, aCD3, aCD3 в сочетании с aCD28) вызывало увеличение количества Тлимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток, экспрессировавших CD38, (рисунки 21, 22, 23).

в) г) Рисунок 20 - Количество регуляторных Т-клеток (CD3+CD4+CD25+CD127low/neg) и активированных Т-хелперов (CD3+CD4+CD25+CD127+) после инкубации без стимуляции (а), при стимуляции ФГА (б); при стимуляции aCD3 (в); при стимуляции aCD3 и aCD28 (г). Примечание: на цитограммах показаны только Т-хелперы.

Количество клеток CD38-PC5 Рисунок 21 - Экспрессия CD38 на Т-лимфоцитах периферической крови здорового ребенка после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28. Примечание: на цитограммах показаны только Т-лимфоциты.

Рисунок 22 - Экспрессия CD38 на Т-хелперах периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28.

Примечание: на цитограммах показаны только Т-хелперы.

Количество клеток в) а) б) CD38-PC5 Рисунок 23 - Экспрессия CD38 на цитотоксических Т-клетках периферической крови после инкубации без стимуляции (показано пунктирной линией на каждом из рисунков) и с различными стимуляторами: а) ФГА; б) aCD3; в) aCD3 и aCD28. Примечание: на цитограммах показаны только цитотоксическиеТ-клетки.

2.2.2. Методы серологических исследований

Получение образцов крови для всех исследований проводилось путем пункции локтевой вены в утренние часы строго натощак. Кровь забиралась в вакуумные пробирки, содержащие активатор свертывания и разделительный гель для получения сыворотки. После забора и до начала лабораторных исследований кровь транспортировалась и хранилась при комнатной температуре, в защищенном от солнечного света месте. С момента взятия крови до приготовления сыворотки проходило не более двух часов. Приготовление сыворотки осуществлялось путем центрифугирования при 3000 оборотов/мин в течение 30 минут. Сыворотка для серологических исследований использовалась в день забора крови или однократно замораживалась в полипропиленовых микропробирках (Sarstedt, Германия) и хранилась при -20°С до момента проведения исследований.

Оценка концентрации С-реактивного белка (СРБ) проведена методом твердофазного ИФА (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. Исследования проводили на ИФА-анализаторе Personal-Lab производства Adaltis (Италия). Чувствительность тест-системы (согласно прилагаемой инструкции) 0,05 мг/л, диапазон измерений: 0-10 мг/л.

Нормативные значения для здоровых доноров, согласно указаниям производителя, составляют от 0 до 8 мг/мл. В случае, если концентрация СРБ в исследуемой сыворотке превышала допустимый диапазон измерений, проводилось ее разведение буфером для разведения образцов, повторное лабораторное исследование и расчет искомой концентрации в соответствии с выполненным разведением, согласно инструкции производителя.

Определение титра антинуклеарного фактора (АНФ) проведено в реакции непрямой иммунофлюоресценции на Нер-2 клетках (Euroimmun, Германия) согласно инструкции производителя. Принцип метода заключается в соединении аутоантител класса IgG, содержащихся в сыворотке пациента, со структурами ядер и цитоплазмы клеток перевиваемой клеточной культуры Нерфиксированных на стеклянной подложке, с последующей визуализацией за счет соединения с анти-IgG-антителами, коньюгированными с FITC.

Визуальный анализ результатов реакции проводился с помощью люминесцентного микроскопа Leica MS производства Leica (Германия).

2.2.3. Методы статистического анализа данных

Для анализа данных использовали унифицированный аппарат теории общих линейных моделей (GLM) [264]. Оценивали эффекты следующих факторов (ковариат): пол (девочка – 0, мальчик – 1), возраст (в годах, проведено предварительное нормирование данных). Длительность заболевания не была включена в анализ, т. к. этот параметр значимо коррелировал с возрастом обследованных детей (r=0,39; p0,001). Включение взаимосвязанных предикторов не рекомендуется при использовании метода обобщенных линейных моделей [264, 315].

В рамках GLM-анализа, при исследовании больных в стадии активности в сравнении с контрольной группой УЗД принадлежность к определенной исследуемой группе параметризовали как номинальную переменную: 1 – СКВ, 2 – ЮСД, 3 – ЮИА, 4 – РеА, 5 – ХГС, 6 – УЗД, последняя служила референтным уровнем. При исследовании больных в разных стадиях активности ЮИА в сравнении с контрольной группой УЗД принадлежность к определенной исследуемой группе параметризовали как номинальную переменную: 1 – ЮИА в стадии активности (ЮИА-а), 2 – ЮИА в стадии медикаментозной ремиссии (ЮИА-мр), 3 – ЮИА в стадии стойкой ремиссии (ЮИА-р), 4 – УЗД, последняя служила референтным уровнем. Результаты оценки влияния факторов на исследованные переменные представлены в виде коэффициентов регрессии (bi), ошибок коэффициентов регрессии (se(bi)), tкритерия с указанием степеней свободы и 95% доверительных интервалов (95% ДИ).

Перед выполнением GLM-анализа для стабилизации дисперсий и преобразования мультипликативных эффектов в аддитивные проводилось предварительное логарифмирование данных для параметров, выраженных в единицах концентрации, в титрах и в количестве клеток в микролитре. Для параметров, выраженных в долях (процентах), проводилось предварительное логит-преобразование. После проведения анализа выполнялось обратное логарифмирование или логит-преобразование полученных средних значений параметров (средние значения вычислялись методом наименьших квадратов).

Результаты представлены в виде геометрических средних (М) и 95% доверительных интервалов (95% ДИ).

Для апостериорных (post hoc) сравнений выборочных средних в рамках GLM анализа был использован критерий Тьюки для выборок неравного размера. Для анализа различий между группой условно здоровых детей и всеми больными с ревматическими заболеваниями (либо больными с различной активностью ЮИА) применялся метод построения контрастов в рамках GLM анализа. Для обозначения вновь разграниченных групп использовались фигурные скобки, например: {УЗД} – {СКВ, ЮСД, ЮИА, РеА}. Построение контрастов позволяет выявить более общие закономерности, чем это возможно при индивидуальном сравнении выборочных средних [264].

Многомерный анализ различий между выборками осуществляли с помощью анализа главных компонент и дискриминантного анализа [20]. Перед их выполнением для параметров, выраженных в единицах концентрации, в титрах и в количестве клеток в микролитре проводилось предварительное логарифмирование данных. Для параметров, выраженных в долях (процентах), проводилось предварительное логит-преобразование.

Анализ главных компонент использован для определения структуры взаимосвязей между параметрами функционального состояния лимфоцитов периферической крови. Анализ главных компонент является аналогом факторного анализа и также используется для сокращения данных и их классификации путем объединения коррелированных переменных в один фактор [20]. Анализ проведен для всех исследованных групп (УЗД, СКВ, ЮСД, ЮИА, РеА, ХГС) одновременно (использованы данные, полученные при обследовании 208 детей). С помощью предварительного анализа главных компонент в отдельных группах обследованных детей (УЗД, ХГС, ревматические заболевания) показано, что характер взаимосвязей (положительные или отрицательные) исследованных переменных с выделенными в процессе анализа факторами в большинстве случаев совпадали во всех группах пациентов. Несовпадение не превышало 20% и касалось наименее значимых коэффициентов корреляции. Это послужило основанием для проведения анализа главных компонент одновременно во всех группах.

В анализе главных компонент проанализировано абсолютное количество лимфоцитов, популяционный состав лимфоцитов в процентном выражении и относительное количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Тклеток, экспрессировавших маркеры активации. Всего в анализе главных компонент оценено 73 переменных, характеризующих функциональное состояние лимфоцитов периферической крови. В качестве сопутствующих переменных, не участвующих в формировании факторов, использованы гендерная принадлежность (0 – девочки, 1 – мальчики), возраст детей (проведено предварительное нормирование данных), логарифмы концентрации СРБ и титра АНФ. В качестве группирующей переменной использована принадлежность к определенной исследуемой группе, которую параметризовали как номинальную переменную: 1 – СКВ, 2 – ЮСД, 3 – ЮИА, 4 – РеА, 5 – ХГС, 6 – УЗД.

Для оценки взаимосвязей между различными переменными также был использован регрессионный анализ [4].

Многомерный дискриминатный анализ был использован в качестве инструмента, позволяющего оценить функциональное состояние лимфоцитов периферической крови одновременно по комплексу параметров популяционного состава лимфоцитов и экспрессии маркеров активации Тклеток. Целью анализа был отбор диагностически важных признаков, позволяющих дискриминировать исследованные группы здоровых детей по исследованным параметрам [20].

При использовании всех видов статистического анализа различия между выборочными средними считали статистически значимыми при p0,05.

Таблицы и рисунки структурированы согласно рекомендациям Т.А. Ланга и М.

Сесик [31]. Статистический анализ данных проведен в рамках программного обеспечения Statistica для Windows (версия 6.0) и Microsoft Excel.

ГЛАВА 3. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ У ДЕТЕЙ С

АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИЕЙ

Патогенез аутоиммунных заболеваний включает в себя различные изменения в иммунной системе, в том числе, затрагивающие лимфоциты, как центральные клетки иммунной системы Данные литературных [57].

источников, посвященных исследованию субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и экспрессии маркеров активации этими клетками при аутоиммунной патологии, противоречивы [48, 67, 94, 119, 128, 325]. Кроме того, в литературе представлены единичные публикации, посвященные исследованию функционального состояния лимфоцитов у пациентов детского возраста с аутоиммунными заболеваниями, результаты которых не дают полноценного представления данного вопроса.

Для оценки функционального состояния лимфоцитов при различной аутоиммунной патологии проведено определение количества популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови, а также экспрессии активационных маркеров Т-лимфоцитов в группах детей с аутоиммунными заболеваниями в стадии активности. Оценена информативность определения количества и соотношения основных популяций лимфоцитов периферической крови (Т-, В- и NK-клеток, Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток) и спонтанной экспрессии маркеров активации Т-лимфоцитов для диагностики аутоиммунной патологии у детей. Использование стимуляции лимфоцитов in позволило проанализировать характер реакции Т-лимфоцитов vitro периферической крови на индукцию различными агентами при аутоиммунной патологии у детей.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
Похожие работы:

«Н.Н. Жук: ПРОМЫСЛОВЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ АНТАРКТИЧЕСКОГО. УКРАЇНСЬКИЙ АНТАРКТИЧНИЙ ЖУРНАЛ УАЖ, № 10-11, 201-211 (2011/2012) УДК 595.3.574 ПРОМЫСЛОВЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ АНТАРКТИЧЕСКОГО КРИЛЯ (EUPHAUSIA SUPERBA) НА УЧАСТКАХ ЕГО ПРОМЫСЛА У ЮЖНЫХ ШЕТЛАНДСКИХ ОСТРОВОВ И В П...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Одной из издержек научно-технического прогресса является деградация естественных экосистем, выражающаяся, прежде всего, в снижении биологического разнообразия и нарушении нормального функционирования природных сообществ. Эти изменения неизбежно сопровождаются снижением качества при...»

«Всероссийская научно­практическая конференция молодых ученых, аспирантов и студентов "Экология и безопасность в техносфере: современные проблемы и пути решения"3. Уэйберг Р.С., Гоулд Д. Основы пси...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" УДК 502.74., 502.75 (471.311) Код ГРНТИ 82.27.02, 87.31.02., 10.53.28., 20.23....»

«Целью вступительных испытаний по экологии и природопользованию является определение теоретической и практической подготовленности поступающего к выполнению профессиональных задач, установленных Федеральным государственным образовате...»

«Нормативные документы в сфере деятельности Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору Серия 08 Документы по безопасности, надзорной и разрешительной деятельности в нефтя...»

«Вестн. Моск. ун-та. Сер. 25. Международные отношения и мировая политика. 2012. № 2 МЕЖДУНАРОДНАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ Л.В. Панкова* ВОЕННО-ЭКОНОМИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ: ИННОВАЦИОННОЕ ИЗМЕРЕНИЕ Заме...»

«KS-002 Боррелиоз-ИФА-IgG Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов (болезнь Лайма). ООО "Омникс" KS-002 1....»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, 2 Актуальные проблемы, обзоры, итоги науки УДК 636.4:636.082:575 ПРОИСХОЖДЕНИЕ ГЕНОМА Sus scrofa domestica В ПРОЦЕССЕ МИКРОЭВОЛЮЦИИ ПРИ СОЗДАНИИ НОВЫХ ПОРОД В.Н. ТИХОНОВ, В.Е. БОБОВИЧ Рассматривается породообразование домашних свиней как микроэволюционный процесс, важнейшие условия которого (гибридиза...»

«УТВЕРЖДЕН приказом Министерства природных ресурсов и экологической безопасности Луганской Народной Республики от "18" февраля 2016 № 22 Зарегистрировано в Министерстве юстиции Луганской Народной Республики 15.03.2016 за №127/474 ПОРЯДОК проведения инве...»

«Соколова Евгения Александровна Флуоресцирующая модель HER2-гиперэкспрессирующей опухоли яичника человека и ее использование для оценки эффективности таргетного иммунот...»

«1. Цели освоения дисциплины: Обеспечение студентов биологических специальностей знаниями основных экологических закономерностей жизни живых организмов и их сообществ, проблем и направлений современной...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ЯМАЛО-НЕНЕЦКИЙ АВТОНОМНЫЙ ОКРУГ ДЕПАРТАМЕНТ ОБРАЗОВАНИЯ АДМИНИСТРАЦИИ ГОРОДА НОЯБРЬСКА МУНИЦИПАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "СРЕДНЯЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА № 7" МУНИЦИПАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ГОРОД НОЯБРЬСК ПРИКАЗ 25.05.2015 г. № 234-од...»

«Станция глубокой био-механической очистки хозяйственно-бытовых сточных вод Kolo Vesi (Коло Веси) Технический паспорт Kolo Vesi (Коло Веси) 2 Назначение Станции био-механической очи...»

«БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ УДК 599(282.256.63) О. И. Никифоров, Е. Н. Никифорова МЕЛКИЕ МЛЕКОПИТАЮЩИЕ БАССЕЙНА Р. СИНЯЯ (ЦЕНТРАЛЬНАЯ ЯКУТИЯ) И ИХ ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Национальный природный парк (НПП) "Синяя" и участок НПП "Ленские столбы" расположены в б...»

«Рабочая программа дисциплины Основы экологии и экологического менеджмента Направление подготовки 38.03.04 Государственное и муниципальное управление Уровень высшего образования Бакалавриат (программа академического бакалавриата) Форма обучения очная, заочная Краснодар 1 Цель и задачи освоения дисциплины Целью освоения дисципли...»

«1. Цели освоения дисциплины Целями дисциплины в рамках подготовки будущего специалиста к активной творческой инженерной работе по созданию перспективных процессов и производств биотехнологического и химического синтеза биологически активных веществ (БАВ) являются:Цели освоения дисциплины: Цели дисциплины Цели ООП Ц1: формирование основ техноло...»

«Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт геологии Уфимского научного центра Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный университет" Российское минералогическое общ...»

«ГОС УДАРС ТВЕНН ОЕ АГЕ НТСТВО РЫБНО ГО ХОЗЯЙСТВА УКРАИНЫ ЮЖНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОР СКОГО РЫБНОГО ХОЗЯЙСТВА И ОКЕАНОГРАФИИ КЕРЧЕНСКИЙ ГОРОДСКОЙ СОВЕТ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ЮЖНЫХ МОРЕЙ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУ...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ ГОСТР НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ 12.4.296— РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Система стандартов безопасности труда ОДЕЖДА СПЕЦИАЛЬНАЯ ДЛЯ ЗАЩИ...»

«Учреждение образования "Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова" УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе МГЭУ им. А.Д. Сахарова О.И. Родькин "" 2013 Регистрационный № УД -_/р. Биотический круговорот Учебная программа учреж...»

«В институтах ДВО РАН Вестник ДВО РАН. 2004. № 3 Тихоокеанскому институту биоорганической химии ДВО РАН — 40 лет Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (прежнее название Инсти...»

«Пояснительная записка Статус документа 1.Рабочая программа по биологии для обучающихся составлена на основании: Федерального компонента государственного образовательного стандарта среднего (полного)...»

«ОГЛАВЛЕНИЕ Принятые сокращения................................ 3 Предисловие.......................................... 4 Глава первая Общая микробиология Бактериологическая диагностика....................... 5 Тема 1. Введение.......................»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.