WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные материалы
 

«(51) МПК C12N 5/16 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ...»

RU 2 381 271 C1

(19) (11) (13)

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

(51) МПК

C12N 5/16 (2006.01)

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА

ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ,

ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ (21), (22) Заявка: 2008127785/13, 10.07.2008 (72) Автор(ы):

Ветчинин Сергей Сергеевич (RU), (24) Дата начала отсчета срока действия патента: Белова Елена Валентиновна (RU), 10.07.2008 Баранов Андрей Митрофанович (RU), Сапожников Александр Михайлович (RU), (45) Опубликовано: 10.02.2010 Бюл.

№ 4 Маргулис Борис Александрович (RU) RU (56) Список документов, цитированных в отчете о (73) Патентообладатель(и):

поиске: RU 2319743 C1, 20.03.2008. US 4,361,549, Федеральное государственное учреждение 30.11.1982.

науки Государственный научный центр Адрес для переписки: прикладной микробиологии и 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) (RU), п. Оболенск, ФГУНЦ ГНЦ ПМБ Институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 2E4 ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БЕЛКУ ТЕПЛОВОГО

ШОКА 70 C1

–  –  –



Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к белку теплового шока 70 (БТШ 70).

Белки теплового шока играют важную роль для обеспечения гомеостаза организма на всех стадиях его развития и в экстремальных для него условиях, таких как воздействие стресса, отравляющих и наркотических веществ, радиации, сублетальной температуры и других.

В настоящее время достаточно подробно изучены основные функции внутриклеточных БТШ, связанные с участием этих молекул в процессах синтеза, фолдинга, транспорта, репарации внутриклеточных протеинов (шаперонные функции) [1] и важной ролью БТШ в системе защиты клеток от повреждающих воздействий (протективные функции) [2]. Зарегистрирована поверхностная локализация БТШ у ряда линий опухолевых клеток, у вирус-инфецированных лимфоцитов, у активированных макрофагов и Т-лимфоцитов [3], а также обнаружено существование свободного БТШ в межклеточном пространстве [4]. На основе иммуноадъювантных свойств БТШ интенсивно ведутся исследования по разработке вакцин для иммунотерапии злокачественных опухолей [5, 6].

Одним из важных подходов определения БТШ 70 в биологических организмах является использование MKA, продуцируемых гибридомами.

Известно, любая белковая структура несет на своей поверхности определенное количество эпитопов, в том числе и структурных. Как правило, чем выше молекулярный вес белка, тем больше эпитопов. Они имеют разную иммуногенность и определяют уникальность той или иной белковой молекулы в осуществлении ее функциональных свойств. Поэтому, чем больше панель гибридом, антитела каждой из них работают только с одним из эпитопов белка, тем больше инструментов для исследования этих свойств. Следовательно, получение новых гибридом всегда актуально. Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, используются как важный инструмент для выявления основных структурно-функциональных свойств белков, в том числе и БТШ 70.

За рубежом некоторые фирмы, например, Sigma, Cayman chemical, Biocompare (США), StressGen (Канада), HyTest (Финляндия) продают моноклональные антитела к БТШ 70 [7].

Известен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus SPA 810 (фирма StressGen, Канада), продуцирующий МКА к БТШ 70. Коммерческие МКА, продуцируемые гибридомой SPA 810 слабо окрашивают при непрямом иммунофлуоресцентном анализе живые клетки (например, клетки лимфомы EL-4), что ограничивает их использование для определения БТШ 70 при воздействии стрессовых факторов на живые клетки [8].

Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к БТШ 70 и пригодные для определения БТШ 70 при воздействии стрессовых факторов.

45 Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2Е4 - продуцент моноклональных антител к БТШ 70.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ МПБ) коллекционный номер - H1.

Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c бычьим БТШ 70 в течение 78 суток. На третьи сутки после последней бустер-инъекции.: 4

–  –  –

проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (10 8 клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (10 7 клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 1500 (Merk, Германия). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.

Характеристика гибридомы 2Е4.

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток с размером с исходную миеломную клетку.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы 2Е4 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда DMEM или RPMI - 1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2 - 1:3. Посевная концентрация клеток составляет 10 5 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 10 5 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 15 пассажах in vitro (срок наблюдения).

Культивирование гибридомы в организме животного. Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток при прививке составляет 10 6 на одну мышь при первичном введении и 10 5 на одну мышь при вторичном введении из иммуноасцитной жидкости. За 14 суток до введения клеток гибридомы, мышам внутрибрюшинно вводят 0,5 мл 2, 6, 10, 14-тетраметиленпентадекана (пристана). Иммуноасцитическая жидкость образуется на 14-20 сутки в объеме 3-5 мл. Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).

Характеристика полезного продукта. Гибридома 2Е4 продуцирует специфичные моноклональные антитела к БТШ 70, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:1000, в иммуноасцитической жидкости (ИАЖ) 1:128000.

Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяют с помощью осаждения сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на белок А или G сефарозе. Гомогенность выделенных антител проверяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20мкг/мл, в асцитической жидкости - 2-4 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 15 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения).

Контаминация штамма. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы не выявлены. Микроплазмы не определяли.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида -10%. Режим криоконсервации и отогрева.

Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре - 70°С и затем опускают в жидкий азот.

Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°С.Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 10 6.

.: 5 RU 2 381 271 C1 Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 65-75%.

Свойства полезного продукта. Гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG3 подклассу иммуноглобулинов мыши. Моноклональные антитела специфичны к БТШ 70 быка, человека, мышей, дрожжей (с другими видами животных и микроорганизмами не проверялись).

Пример 1. Получение гибридомы.





Иммунизацация.

Мышей линии BALB/c иммунизируют препаратом БТШ 70 быка по схеме:

- подкожное введение мышам 45 мкг БТШ 70 в несколько точек в полном адъюванте Фрейнда;

- через 28 суток повторное введение мышам 45 мкг БТШ 70 в несколько точек в неполном адъюванте Фрейнда;

- через 28 суток внутривенная инъекция мышам 15 мкг БТШ 70 в физиологическом растворе;

- через 14 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг БТШ 70 в физиологическом растворе;

- через 7 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг БТШ 70 в физиологическом растворе;

- через 7 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг БТШ 70 в физиологическом растворе;

- через 7 суток внутривенная инъекция мышам 10 мкг БТШ 70 в физиологическом растворе.

Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после инъекции БТШ 70 согласно Animal protocol №P 02-19 стр.7.

Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.

Гибридизация.

Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 10 8 спленоцитов мыши с 10 7 клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-653 в присутствии 1 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (Sigma) с молекулярным весом 1500 в течение 1 минуты.

Селекция.

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде DMEM "Sigma" с 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Скрининг гибридных клонов.

Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют непрямой твердофазный ИФА.

Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96 - луночного полистироловой планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 нг БТШ 70, приготовленного на 0,01 М карбонатном буфере pН 9,6 в объеме 100 мкл и затем выдерживают при температуре 6°С в течение 16 ч. Лунки планшета отмывают забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твина-20 (ЗФР-Тв).

Вносят в лунки по 100 мкл 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА),.: 6 RU 2 381 271 C1 проверенного на отсутствие пероксидазной активности, и инкубируют при температуре 37°С в течение 45 мин. Три раза отмывают ЗФР-Тв и вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ЗФР-Тв и добавляют в лунки антитела против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой хрена в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 40 минут, затем 5 раз отмывают лунки раствором ЗФР-Тв.

Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания продукта хромогена - ортофениплендиамина (4 мкл 30% Н2O2 4 мг ортофенилендиамина на 100 мл 0,1 М натрий цитратного буфера pH 5,0). Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 8 N серной кислоты. Планшеты сканируют на планшетном ридере Пикон (Россия), измеряя поглощение при 492 нм.

Клонирование.

Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 10 4 клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.

Культивирование.

Культивирование клонов гибридомы ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI содержащая 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

Криоконсервация.

Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.

Проверка специфичности МКА.

Пример 2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ.

Для проведения твердофазного ИФА в лунки 96 - луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят БТШ 70 в разведениях от 100 нг до 1,5 нг, приготовленных на 0,01 М карбонатном буфере (рН 9,6) в объеме 100 мкл и выдерживают при температуре 6°С в течение 16 часов. Последующие стадии анализа проводят аналогично стадиям, описанным для скрининга гибридных клонов.

Моноклональные антитела вносят в лунки в концентрации 100 нг/мл.

Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.

В непрямом твердофазном ИФА моноклональные антитела гибридомы 2Е4 специфически взаимодействуют с БТШ 70 и определяют до 3 нг белка в анализируемом образце (фиг.1).

Пример 3 Иммуноблот.

Для проверки специфичности МКА гибридомы 2Е4 к БТШ 70 проводят СДС-электрофорез в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 2 часов при 220 В, 20 мА. Белки из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-P) в течение 1 час при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в 20 мМ трис-буфер, pH 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран и разведения белков использовали 20 мМ трис-буфер, pН 7,4, содержащий 150 мМ NaCl и 0,5% твин 20. Блокированные и промытые мембраны разрезают на полосы. Каждую полосу инкубируют отдельно в растворах МКА гибридомы 2Е4 и МКА SPA 810 с концентрацией 1 мкг/мл в течение 1.: 7 RU 2 381 271 C1 часа при температуре 37°С. После промывки буфером полоски обрабатывают раствором антимышиных антител конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают буфером и окрашивают раствором диаминобензидина (0,5 мг/мл 3.3'-диаминобензидина с 0,1 мг/мл NiCl2, 0,1 мг/мл СоС12, 0.03% Н2O2) в ЗФР pН 7,2. Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2Е4, взаимодействуют с БТШ 70 в иммуноблоте и выявляют те же белковые полосы, что и коммерческие МКА SPA 810 (фиг.2).

Пример 4. Дот-блот.

Дот-блот проводят на нитроцеллюлозной мембране (Hybond-P). Посадочная доза для БТШ 70 и его фрагментов составляет 50 нг в точку диаметром 2 мм.

Нитроцеллюлозную мембрану блокируют в 1% растворе БСА в ЗФР в течение 1 часа при комнатной температуре, погружают в раствор МКА гибридомы 2Е4 в концентрации 1 мкг/мл в ЗФР-Тв, инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С и промывают ЗФР-Тв. Затем мембраны помещают в раствор пероксидазного 20 конъюгата (Sigma) в ЗФР-Тв в рабочем разведении на 1 час при температуре 37°С и промывают ЗФР-Тв. В качестве субстрата для пероксидазы хрена используют раствор диаминобензидина (0,5 мг/мл 3.3'-диаминобензидина с 0,1 мг/мл NiCl2, 0,1 мг/мл CoCl2, 0.03% Н2O2) в ЗФР pН 7,2. Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

Отрицательный контроль - мембраны, обработанные сывороткой интактной мыши в разведении 1/1000. Положительный контроль - мембраны, обработанные сывороткой иммунной мыши в разведении 1/1000.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2Е4, специфически взаимодействуют в дот-блоте с цельным БТШ 70 и его С-концевым фрагментом (аа386-641) и не взаимодействуют с его N-концевым фрагментом (aal-437) (фиг.3).

Пример 5. Цитометрическое тестирование МКА.

Измерение уровня экспрессии поверхностных БТШ 70 производят методом проточной цитометрии после непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток с использованием тестируемых моноклональных антител к БТШ 70 (2Е4, SPA 810 - «первые» антитела, титр 1:500) и «вторых» антител - конъюгат антител против Fab-фрагментов мышиных IgG с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) ("Sigma", США) в рабочем разведении. Для этого клетки после центрифугирования при 200g в течение 10 минут переводят в ЗФР, содержащий 0,1%) NaN3 и 0,5% BSA, и инкубируют в течение 30 мин при температуре 4°С с первыми антителами. Затем клетки дважды отмывают ЗФР с использованием центрифугирования при 200g в течение 10 мин и инкубируют в течение 30 мин при 4°С со вторыми антителами. После инкубации клетки опять дважды отмывают в ЗФР центрифугированием в том же режиме. Окрашенные образцы анализируют на проточном цитофлуориметре (EPICS XL, "Coulter Corporation", США). В каждом образце проводят измерение уровня флуоресценции не менее 10000 клеток.

На фиг.4 представлены результаты сравнительного цитометрического тестирования полученных моноклональных антител гибридомы 2Е4 и коммерческих антител SPA 810 в модели их взаимодействия с БТШ 70, присутствующим на поверхности клеток лимфомы EL-4. В качестве контролей используют типичное распределение клеток EL-4.: 8 RU 2 381 271 C1 по параметрам переднего (FS) и бокового (SS) светорассеяния, выявляющее пулы живых и апоптозных клеток (фиг.4, А); контроль аутофлуоресценции (фиг.4, Б) и контроль окрашивания вторыми, ФИТЦ - мечеными антителами (фиг.4, В).

Коммерческие моноклональные антитела SPA 810 слабо окрашивают живые клетки, но хорошо связываются с поверхностью апоптозных клеток (фиг.4, Г). В то же время МКА гибридомы 2Е4 характеризуются гораздо более выраженным взаимодействием с пулом живых клеток и примерно равноценным связыванием с апоптозными клетками (фиг.4, Д).

Пример 6. Определение БТШ 70 при воздействии теплового шока.

Суспензию живых клеток лимфомы EL-4 инкубируют в течение 10 мин при температуре 43°С с последующим непрямым иммунофлуоресцентным окрашиванием внутриклеточных БТШ 70 с использованием МКА SPA810 и МКА гибридомы 2Е4.

Контрольная группа образцов клеток не подвергалась тепловому шоку.

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток EL-4 первыми и вторыми антителами для оценки внутриклеточного содержания БТШ 70 осуществляют по описанному выше протоколу (пример 5). Однако перед окрашиванием проводят префиксацию клеток и перфорирование их плазматических мембран для обеспечения проникновения антител во внутриклеточное пространство. Для фиксации к клеткам добавляют 2% раствор параформальдегида в ЗФР и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре и дважды отмывают ЗФР. Для перфорирования плазматических мембран клетки обрабатывают 0,5% раствором Triton-X100 в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого клетки дважды отмывают ЗФР, переводят в раствор ЗФР и проводят процедуру непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. Полученные образцы анализируют на проточном цитофлуориметре (EPICS XL, "Coulter Corporation", США). В каждом образце проводят измерение уровня флуоресценции не менее 10000 клеток.

В таблице представлены результаты, полученные при использовании различных антител для проточно-цитометрического анализа изменения содержания БТШ 70 в клетках EL-4, подвергнутых тепловому шоку.

–  –  –

Преимущество гибридомы 2Е4 по сравнению с гибридомой SPA810 заключается в том, что она продуцирует МКА, которые более выражено определяют БТШ 70 на поверхности пула живых клеток как в норме, так и при воздействии на клетки теплового шока (стрессовый фактор).

Моноклональные антитела гибридомы 2Е4 специфичны к БТШ 70.

Эти свойства гибридомы 2Е4, а также взаимодействие ее МКА с целым БТШ 70 и с его С-концевым фрагментом свидетельствует о возможности использования МКА как компонента тест-систем для определения БТШ 70.

Источники информации

1. Craig E.A., Weissman J.S., Horwich A.L. Heat shock proteins and molecular chaperones:

mediators of protein conformation and turnover in the cell // Cell - 1994. - Vol.78. - P.365-372.

2. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance:

degradation and reactivation of damaged proteins // Annu. Rev. Genet. - 1993. - Vol.27. - P.437Multhoff G. and Hightower LE. Cell surface expression of heat shock proteins and the immune response. // Cell Stress & Chaperones - 1996. - Vol.1. - P.167-176.

4. Hightower L.E., Guidon P.T. Selective release from cultured mammalian cells of heat-shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins. //J. Cell. Physiol. - 1989. Vol.138. - P.257-266.

5. Udono H. and Srivatstava P.K. Heat shok protein 70-associated peptides elicit specific cancer immunity // J. Exp.Med. - 1993. - Vol.178. - P.1391-1396.

6. Li Y., Yang G., Repasky E., Wang X.-Y. Generation of anti-tumor immunity using mammalian heat shok protein 70 DNA vaccines for cancer immunotherapy // Vaccine - 2006. Vol.24. - P.5360-5370.

7. /www.caymanchem.com, www.biocompare.com. www.stressgen.ru. www.abcam.com. /

8. Sapozhnikov A.M., Gusarova G.A., Ponomarev E.D., Telford W.G. Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis.//Cell Proliferation - 2002. Vol.35. - P.193-206.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2E4 - продуцент моноклональных антител, специфичных к белку теплового шока 70, депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ), коллекционный номер Н-1.

.: 10

–  –  –



Похожие работы:

«Сравнительный анализ стратегий восприятия Сибирский психологический журнал. 2016. № 62. С. 67–80 УДК 159.923.3 DOI: 10.17223/17267080/62/6 Д.М. Егоров, И.А. Бессмертная Томский государственный университет (Томск, Россия) Сравнительный анализ стратегий восприя...»

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13) RU 2 527 197 C2 (51) МПК G06F 17/30 (2006.01) H04L 12/02 (2006.01) ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ 2012147832/08, 10.05.2011 (21)(22) Заявка: (72) Автор(ы): ВИНТЕР Кристиан (DE)...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Кафедра "Управление персоналом и психологии" Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся по дисциплине Б1.В.02 Психология Направление подготовки (специальность) 38.03....»

«УДК 82-31:316.722 ГСНТИ 17.82.31 КОД ВАК 10.01.08 ББК Ш5(4/8)-4 М. НАДЕЛЬ-ЧЕРВИНЬСКА Катовица, Польша "ЛАСОЧКА" (ПЯТАЯ ГЛАВА РОМАНА Р. РОЛЛАНА "КОЛА БРЮНЬОН") КАК ЕДИНСТВО И ПРОТИВОПОСТАВЛЕНИЕ МЕТАЗНАКОВ 'ЖИЗНИ' И 'СМЕРТИ' Аннотация. Демонстрируется, как с помощью пространственных и временных указаний Р. Роллан...»

«Сафонова М. В. Выливной С. Л. Игры Богов Том второй Книга шестая Впервые издана в 2016 г. УДК 82-43 ББК 84(4Укр=411.2-2Донецк)6-44 С 217 Сафонова М.В., Выливной С.Л. С 217 Серия Роза Мира. Том второй. Книга шестая. Игры Богов....»

«1. Цели освоения дисциплины Целью дисциплины является обучение студентов теоретическим и прикладным основам социально-психологической науки.Задачи дисциплины: 1. Анализ взаимосвязи социальной психологии как науки с актуальными проблемами общес...»

«1. Перечень планируемых результатов обучения по дисциплине, соотнесенных с планируемыми результатами освоения образовательной программы Коды Планируемые результаты Планируемые результаты обучения по компетенций освоения образовательной дисциплине программы Знать: методы психоло...»

«БУРЧАК Элина Адольфовна ПСИХОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКСТРАИ ИНТРОВЕРТИРОВАННЫХ ЧЕРТ ЛИЧНОСТИ Специальность: 19.00.13 психология развития, акмеология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандида...»

«САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Филологический факультет Кафедра русского языка Лю Даян Русские фразеологизмы, характеризующие интеллектуальные способности человека, и их соответствия в китайском языке Выпускная квалификационная работа на соискание магистра лингвист...»










 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.