WWW.LIB.KNIGI-X.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Электронные матриалы
 


«Современные методы лабораторной диагностики Биочипы - настоящее и будущее клинической лабораторной диагностики Справочное пособие для врачей Ростов-на-Дону 2012 ...»

Современные методы лабораторной диагностики

Биочипы - настоящее и будущее

клинической лабораторной диагностики

Справочное пособие для врачей

Ростов-на-Дону

2012 год

Evidence MultiStat

Автоматизированная иммунохимическая аналитическая система на

основе биочип-технологий.

џ Для использования в любых подразделений медицинских

учреждений, включая реанимацию, хирургию и центральную

патологическую/биохимическую лаборатории;

џ Результаты для нескольких маркеров готовы за 20 минут, ускоряя тем самым диагноз и лечение;

џ Двойная вместимость проб – тестирование до 6 проб в час;

џ Простая трехшаговая процедура – добавьте пробу в картридж, введите картридж и прочтите результаты;

џ Картридж со штрих-кодом содержит готовые к использованию реагенты и биочипы;

џ Цветной touchscreen с ПО на базе Windows;

џ Сохранение более 1000 результатов исследований;

џ В наличии сканер штрих-кодов для отслеживания проб;

џ Биопробы (до 100 мкл): сыворотка, моча;

џ Возможность одновременной обработки двух проб, или одной пробы и контроля качества;

џ Автоматическое отображение результатов;

џ Лабораторные результаты качества – разброс исследования (CV) менее 10%;

џ Встроенная калибровка;

џ Установленные в лаборатории cut-off.

Evidence Evolution Автоматизированная иммунохимическая аналитическая система на основе биочип-технологий.

џ Первую в мире линейку Bio-drive Robotics характеризует быстрота и точность выполнения операций, а также бескомпромиссное качество;

џ Множественное тестирование позволяет врачу увидеть полную картину, что отражается на информированности при принятии решения и постановке точного диагноза;

џ Множественное тестирование позволяет проводить несколько тестов из биоматериала пациента;

џ Сокращена длительность и трудоемкость индивидуальных тестов;

џ Доступ random позволяет осуществлять ввод и вывод реагентов, проб и расходных материалов без прерывания процесса тестирования;

џ Evidence Evolution может одновременно обрабатывать несколько проб, имея возможность использовать функцию STAT;

џ Непревзойденные технические возможности обеспечивают постоянную работоспособность;

џ Первое в мире использование реагентов на борту за счет системы Butterfly Valve System;

џ Возможность производить комплексный анализ из 7 мкл образца;

џ Производительность до 2940 тестов в час.

ГРУППА КОМПАНИЙ “БЛИК” Тел./Факс: +7 (863) 201-53-94 Биочипы – настоящее и будущее клинической лабораторной диагностики.

Сегодня уже многие отнюдь не сведущие в биотехнологии люди уверенно рассуждают о биочипах – миниатюрных устройствах, способных реагировать на биохимические изменения в организме.

Тем временем, уже в этом году, емкость рынка биочипов достигнет миллиарда долларов, причем темпы роста рынка в последние годы превышают тридцать процентов в год. Вполне вероятно, что повсеместно рабочие биочипы – дело весьма недалекого будущего.

Ведь от первой идеи создания биочипа до выпускаемых уже промышленным способом, прошло всего пятнадцать лет.

На сегодняшний день биочип – это небольшая (от нескольких миллиметров) пластинка из стекла, пластика или кремния, вмещающая до нескольких десятков тысяч упорядоченно нанесенных микротестов на основе ДНК или белков для проведения множественного биохимического анализа. Вкупе с прибороманализатором это мини-лаборатория, помогающая быстро получать самые точные результаты.

Технология может быть использована в клинической диагностике для определения вирусов и микроорганизмов, гормонов, аллергенов, наркотиков, любых биоактивных веществ в малых концентрациях; в биологических и медико-биологических исследованиях; в криминалистике; для исследования в области экологии и биобезопасности. На сегодняшний день существуют три основных типа биочипов: ДНКчипы, белковые и клеточные чипы.

На современном уровне диагностики основная доля производимых биочипов – ДНК-чипы. Они способны анализировать так называемые линейные молекулы: ДНК и РНК, к примеру, находить мутации в генах, сравнивая «больные» и «здоровые» ДНК, или отлавливать вирусные и бактериальные ДНК. Белковые чипы появились сравнительно недавно, с их помощью анализируют более сложные по форме, чем ДНК, различные белковые молекулы

– антитела, антигены, гормоны, аллергены и т.п.

Как это часто бывает, инновационное решение появилось в точке пересечения двух, не связанных доселе, линий научнотехнического прогресса: прогресс в биотехнологии состыковался с прогрессом в сфере информационных технологий. Ученые-биологи так научились работать с ДНК и белками, что появилась возможность «манипулировать» ими в формате микроэлектронных технологий. Так, размер биочипа – это тонкая пластинка 1,5х1,5 миллиметра (едва видимая на кончике пальца), но содержит она огромное количество информации.

Из информационных технологий были взяты некоторые способы нанесения информации на чип:

изготовление с помощью роботов, наподобие того, как штампуют электронные чипы, другие – с помощью устройств вроде струйных принтеров.

И хотя сама идея создания биочипов все же принадлежала биотехнологам, в последние годы, судя по доступным аналитическим материалам, в топ-список компаний, патентующих отдельные технологии, применяемые в биочиповых системах, входили в основном электронные компании, такие как Hitachi, Matsushita, и Fuji, но лидером в производстве биочипов все же остается американская биотехнологическая компания Affymetrix.

Впрочем, те же аналитики заявляют о том, что в ближайшее время эта ситуация скорее всего изменится, поскольку биохимическая сторона проблемы будет приобретать все большее значение, и в числе заинтересованных будут крупные фармакологические и биотехнологические компании. В частности, это связывается с тем, что фармакологи с целью персонификации терапии ведут активную «охоту» за новыми генами и белками, которые могут быть определены в биочипах.

Именно биочипы должны помочь фармакологическим компаниям и в создании новых лекарств, и в их тестировании (в ближайшие пару лет темпы роста рынка биочипов в фармакогеномике прогнозируются самые высокие – более 70% в год). Уже имеются биочипы и для распознавания взрывчатых веществ, химического и биологического оружия, а также их используют как средства идентификации для криминалистики и судебной медицины.

2005 год стал годом широкого вывода на рынок первой генерации промышленных биочипов, отвечающих за получение информации для диагностики болезней и обнаружения опасных веществ.

Что же такое биочип? Биочип – это матрица, на которую наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, в том числе и ферменты, клетки), способные ИЗБИРАТЕЛЬНО связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

Основой биочипа является матрица микроячеек на плоскости, каждая из которых содержит молекулярные зонды, специфичные к одной из множества биологических молекул или их фрагментов. В качестве молекулярных зондов могут служить олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки, полипептиды, рецепторы антител, лиганды, олигосахариды и т.д. Таким образом, это многопараметровый (в некоторых случаях до 16 искомых показателей) анализ одного биообъекта.

Что такое матрицы для биочипа? Это может быть стеклянный или гелевый слайд стандартного размера 25х75х1 мм. Так как большинство сканеров биочипов работают именно в таком формате, для пользователя важно, что покупая готовый биочип, он может анализировать его на сканере любого производителя.

Однако, компания Applied Biosystems производит готовые чипы н е с т а н д а рт н о го р а з м е р а д л я а н а л и з а ге н ет и ч е с к о го полиморфизма, и для анализа этого чипа необходим специальный сканер от Applied Biosystems, и по этой причине такие чипы не получили широкого распространения.

Компания Perkin Elmer создала CQH-биочипы (сравнительная геномная гибридизация) для современного решения молекулярного кариотипирования высокого разрешения – два типа биочипов:

Constitutional Chip 3,0 и 4,0. С этой целью используют конфокальный сканер биочипов Scan RI и специальное программное обеспечение Spectral ware для обработки и анализа полученных данных.

В настоящий момент широко известны и внедрены биочипы для анализа генетических и клеточных исследований.

Учитывая то, что профиль белков – «жалобная книга» тела, а клинические тесты по широкой гамме этих соединений проводятся редко (дорого, длительно), недавно создан еще один вид чипа (экспресс-метод) – комплексно-штриховой код крови (Integrated Blood – Barcode Chip – IBBC). По общему принципу действия IBBC во многом напоминает генетический и клеточный биочипы. Для анализа наличия определенных молекул (в нашем случае – белков), необходимо, чтобы весь поток прошел через разветвленную сеть специфических ловушек, в которых остались бы только те молекулы, на которые эти ловушки настроены. Затем, нужно сделать так, чтобы прореагировавшие ловушки засветились. Тогда, просмотрев чип под микроскопом, можно свериться с картой и узнать – какие белки присутствуют в образце. В деталях, впрочем, в новой разработке и м е ет с я м а с с а отл и ч и й от п р ед ы д у щ и х р а з р а б от о к (предшественников такого биочипа). Каплю крови подают в очень узкий канал на поверхности чипа и под небольшим давлением заставляют кровь пройти вглубь. От главного канала отходит множество боковых, еще более тонких каналов. Клетки крови в них не могут «протиснуться», а плазма проходит свободно.

Теперь она оказывается в коридоре, которые внешне напоминает штрих-код:

поперек этого русла лежит большое число полосок шириной 20 микрометров. Каждая полоска «ждет и забирает» свой специфический белок. Вот и еще одно отличие. Если в роли настроенных ловушек в упомянутых ранее системах выступали мириады коротких отрезков одиночных спиралей ДНК, захватывавших из образца комплиментарные фрагменты кода, то в IBBC каждая полоска штрих-кода покрыта специфическими антителами, притягивающими только один определенный белок.

После того как кровь прореагировала с полосками, чип отправляют на «проявку». Тогда те полоски, что поймали белки, начинают флуоресцировать красным, причем тем интенсивнее, чем больше молекул-биомаркеров они собрали. Весь прореагировавший чип выглядит как набор штрих-кодов, однозначно показывающий, сколько и каких белков присутствует в плазме (детали можно найти в статье создателей IBBC в Nature Biotechnology). В настоящий момент, чтобы прочитать этот штрих-код крови, ученые используют лабораторный сканер, тот же, что применяется для генетических исследований. Но, по словам участников проекта, в будущем чтение чипов IBBC можно будет выполнять при помощи небольшого приборчика, сходного по облику с рутинным сканером штрих-кодов в кассах супермаркета. В пресс-релизе Калифорнийского технологического института говорится о том, что Хит и его коллеги (2008 г.) построили несколько таких чипов, каждый из которых способен одновременно выполнять отдельный химический анализ крови для восьми пациентов, да еще и по нескольким десяткам белков. В течение ближайшего года исследователи намерены довести возможности IBBC до распознавания сотни разных белков одномоментно. Следует отметить, что цена одного такого мультитеста оказывается (при массовом выпуске чипов) идентичной цене нынешнего анализа плазмы на один единственный белок (а ученые говорят именно о такой цели проекта), и IBBC действительно будут востребованы. В США испытывали штрих-кодовый тестер в некоторых клиниках. при помощи биочипа – ими удалось проследить за меняющейся концентрацией в крови гормона ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) у беременной женщины, и что важно, в течение всей ее беременности. При развитии беременности содержание ХГЧ увеличивается в сто тысяч раз.

Важно то, что с помощью этого биочипа легко уловить ХГЧ как в очень малых, так и в очень больших концентрациях. Такой широкий диапазон работы – плюс для метода. Следует отметить, что другие химические тесты, либо не улавливают низкие концентрации анализируемого вещества, либо улавливают только очень высокую его концентрацию. Кроме того, авторы технологии применили ее для ДИАГНОСТИКИ С ЦЕЛЬЮ ПРОГНОЗА раков молочной железы и предстательной железы у ряда пациентов. Типы и концентрации белков варьируются от болезни к болезни, а также между разными лицами. Женщины с раком молочной железы, например, будут генерировать иной набор биомаркеров по сравнению с мужчинами, страдающими раком простаты, а в то время как у женщин с агрессивной формой рака обнаружены белки, которые отличаются от белков для женщин с менее «смертоносной формой». Кроме того, те же концентрации специфических белков будут меняться в ходе лечения, так что IBBC является удобным монитором положительных сдвигов в состоянии больного. Следует особо отметить, что высокая скорость получения результата позволит врачам применять штрихкодовый чип для выявления реакции человека на новое «специфическое» лекарство – ведь происходящее в организме будет видно «не сходя с места», а это значит, что план лечения может стать более точным и более индивидуальным. Одним из ключевых участников этого проекта является Лерой Худ (Leroy Hood), президент института системной биологии и мировая знаменитость в области биотехнологии и секвенирования ДНК.

Более пяти лет назад этот ученый заявил, что благодаря биотехнологии в течение следующих 30 лет мы станем свидетелями роста средней продолжительности жизни человека на 10 – 20 лет; и что с новыми приборами мы сможем выполнять по десять тысяч различных медицинских тестов одновременно всего под одной пробе крови из пальца. Как видим, слова доктора Leroy Hood не расходятся с делом: он сам активно работает, чтобы реализовать свой прогноз.

В практическом отношении применение микрочипов уже сегодня позволяет решать следующие задачи:

- точная постановка диагноза, выявление новых подтипов заболевания, уточнение классификации;

- прогнозирование течения болезни и клинического исхода, выявление генов и сигнальных путей, вовлеченных в патогенез онкогематологических, и не только, заболеваний, поиск новых мишеней для направленной дифференцированной персонифицированной терапии;

- разработка и создание более простых и дешевых диагностических тестов, в том числе, на основе технологии микрочипов (микрочипы, содержащие пробы на десятки или сотни генов);

- включение микрочипов в проспективные клинические исследования, подтверждение результатов анализа на микрочипах для внесения в клинические протоколы лечения, использование клинических протоколов с учетом новых данных о природе заболеваний, полученных с помощью технологии микрочипов.

На сегодняшний день в клинической лабораторной диагностике имеются чипы и сканеры, позволяющие получить высокоточную информацию при минимальных трудозатратах и максимальной экономии времени.

Биочипы CQH (сравнительная геномная гибридизация, Perkin Elmer) позволяет проводить одновременный анализ множества локусов генома при высоком уровне разрешения, недоступном для обычного цитогенетического анализа в короткие сроки (Constitutional Chip, 3.0; 4.0), выявляет 99 аномалий в геноме, в том числе, трисомии - 13, 18 и 21 хромосом, что является важным для скрининга в пренатальном периоде. И кроме того, компания параллельно проводит работу по усовершенствованию сканеров и программного обеспечения обработки и анализа данных.

В нашей стране биочипы разработаны под руководством академика А. В. Мирзабекова в Институте молекулярной биологии РАН им. В. А. Энгельгарда. В основе работы биологического микрочипа лежит гибридизация амплифицированных ДНК участков генов, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. В настоящий момент существуют два набора для диагностики туберкулеза. ТБ-БИОЧИП для выявления возбудителя туберкулеза и од н о в р е м е н н о го о п р ед ел е н и я ч у в с т в и т ел ь н о с т и к противотуберкулезным препаратам рифампицину и изониазиду. ТББИОЧИП-2 предназначен для определения чувствительности к фторхинолонам. С помощью этих биочипов можно выявить 29 типов мутаций в гене, ответственном за устойчивость к рифампицину и 19 мутаций в генах, ответственных за устойчивость к изониазиду.

Молекулярно-биологический метод гибридизации на микрочипах является высокоэффективным и быстрым (всего 48 часов по сравнению с 2-4 неделями для культурального и биологического методов диагностики туберкулеза) и с одновременным определением резистентности бактерий к противотуберкулезным препаратам. Следует отметить, что А.В.Мирзабеков первый в мире и России начал разработку исследований на микрочипах.

Кроме того, были разработаны биочипы для иммунофенотипирования клеток. Методы иммунотипирования клеток крови, используются, в основном, для диагностики гемобластозов, весьма трудоемки и дорогостоящие, например метод проточной цитометрии. Разработаны различные методики проведения анализа на биочипах на основе нанотехнологии и наноматериалов. Биочип, в данном случае, представляет собой прозрачную подложку, на которой в строго определенные участки нанесены иммобилизованные антитела (Ig G), способные взаимодействовать с определенными поверхностными антигенами клеток. Весьма существенно использование сочетания методов измерения сигнала и морфологического изучения клеток (прозрачная подложка биочипа) с последующим окрашиванием (Шишкин А.В., 2010). Исследования на биочипах и их разработку, с обеспечением точности и экономичности, взяла на себя компания Randox (Великобритания).

Одним из таких приборов является Evidence в различных проекциях – автоматические и полуавтоматические анализаторы.

Принцип действия сочетает в себе последние технологические преимущества, устанавливая новые стандарты лабораторной диагностики. Осуществляется возможность проведения анализов от 9 до 3600 тестов за 1 час, при программном обеспечении, контролирующем работу всей системы от обслуживания и оценки достоверности калибровки до определения профиля тестируемых образцов. Технология основана на новой концепции использования биочипа (9 мм2 ) в качестве реакционной платформы, содержащей множество специфических лигандов (антител или антигенов), фиксированных на определенных зонах поверхности биочипа, которые будут связывать тестируемые аналиты в образцах пациента. Хемолюминесцентный поток определяет степень связывания, это оценивается в специальной камере с добавлением сигнального реактива и системой визуализации. Объем образца (цельная кровь, сыворотка, плазма, моча, выделения полости рта – с л ю н а ) с о с т а вл я ет 2 5 - 1 0 0 м к л, к а к д л я п ол н о с т ь ю автоматизированной системы Evidence® (1080 тестов за час), так и для полуавтоматической системы Evidence Investigator (540 тестов за 75 минут). Следует особо отметить наличие мультианалитных калибраторов, мультиконтрольных наборов и реагентов.

Панели определения аналитов для всех приборов достаточно широки: от гормонов (репродукции, фертильности, гормонов щитовидной железы, опухолевых маркеров) до молекул адгезии, цитокинов, лекарственных препаратов, а также ДНК–исследований (в частности – мутаций генов при колоректальном раке, раках молочной железы и легких), кардиоваскулярных заболеваний и других. Цитокины являются низкомолекулярными растворимыми белками, функционируют как сигнальные молекулы, регулирующие клетки иммунной системы, обладают аутокринной, эндокринной и паракринной функциями.

Цитокины активируются при воспалении, системном ответе и гемопоэзе, включая активацию клеточной пролиферации, миграции и инициации апоптоза, они могут проявляться при различных патологических состояниях и их концентрация может являться маркером прогноза. Следует отметить, при использовании прибора Randox возможно одновременно количественно определять двенадцать цитокинов и факторов роста (VEGI, TNT, EgF, MCP, и другие) в образце пациента при использовании 100 мкл сыворотки или плазмы крови.

Кроме того, разработаны биочипы для определения а н т и м и к р о б н о й ч у в с т в и т ел ь н о с т и ( р ез и с т е н т н о с т и ) к химиопрепаратам и противоспалительным продуктам в ветеринарии.

Следует особенно отметить, что имеются в наличии биочипы для церебральной патологии в плазме крови в двух вариантах многомерного анализа, включающих несколько веществ, являющихся высокоспецифичными белками для патологических состояний клеток мозга, а также белками выхода клеток после повреждения. С помощью одной из панелей проводят определение деструкции астроцитов и нейродегенеративных изменений мозга, вплоть до белка, связывающего жирные кислоты. Вторая панель детектирует белки, участвующие в атеротромбозе. Широко представлена панель для определения аполипопротеинов от А до Е.

Важным является то, что в Randox-приборах имеется система архивирования результатов (до 200 тысяч) в виде изображения реакционной зоны на биочипе и соответствующего количественного уровня аналитов. Кроме того, самодостаточность системы обеспечивает высокую безопасность и минимальное участие оператора. Прибор Evidence® (RANDOX) позволяет определить несколько аналитов при минимальном объеме биопробы и через минимальное время исследования, но при широком спектре аналитов, тем самым ускоряя постановку диагноза.

Преимущества биочиповой технологии компании Randox заключаются в следующем:

- одна система детекции для чипов определения белков и ДНК;

- мультиплексное исследование: один образец – множество результатов

- широкий выбор панелей;

- минимизация объема образца 25-100 мкл на многомерное исследование;

- готовые к использованию биочипы со всеми реагентами, необходимыми для теста;

- мультианалитные калибраторы, мультианалитные контроли;

- бар-код калибраторов;

- качественный контрольный материал;

- DNA биочипы для детекции полиморфизма и мутаций генома.

Кроме того, производители предлагают для многомерного анализа (с помощью программного обеспечения прибора) специфические тесты (две панели) одновременной детекции уровня десяти классов лекарственных препаратов в моче, цельной крови, отделяемом ротовой компании Randox, предназначенные для ветеринарых клиник.

Основные принципы работы на анализаторах биочипов Randox.

Методика анализа с использованием биочипов основана на стандартных способах иммунохимического анализа для измерения анализируемых веществ на поверхности биочипа. Специфическое и одновременное представление биологических маркеров является самым большим преимуществом такой технологии для множества приложений. Биочип представляет собой единый наиболее важный компонент, так как он несет на себе области химического распознавания для анализа множества параметров. Биочип (RANDOX) представляет собой квадратный твердый субстрат площадью 9мм/2 с матрицей дискретных тест-областей (ДТО), располагающихся на поверхности биочипа в точно заранее определенных координатах. Матрица изготовлена с помощью технологии нанонанесения, и каждая ДТО состоит из различных антител или других реакционных частиц, специфических для каждого исследуемого вещества. Биочипы, в свою очередь, располагают в носителе биочипов. Это объект квадратной формы с девятью реакционными ячейками, расположенными 3х3. Каждая ячейка содержит биочип, закрепленный в основании ячейки при помощи держателей. В каждый биочип помещают биологический образец одного пациента. Если анализируемый аналит (антиген или антитело) присутствует в образце пациента, то он связывается с поверхностью специфического лиганда и его концентрация может быть определена. Присоединение анализируемого вещества к лигандам, связанным с биочипом, приводит в результате, после добавления сигнального реактива, к образованию хемилюминесцентного сигнала, который легко обнаруживается и оценивается количественно. Для этих целей используют усиленный хемилюминесцентный субстрат с пероксидазой хрена (ПХ) в качестве метки для обнаружения анализируемых антител или анализируемого антигена, связавшихся со специфическим рецепторами на поверхности биочипа. Интенсивный испускаемый сигнал дает возможность обнаружения пикограмм антитела или антигена. Сигнальный реактив включает в себя смесь 1:1 люминол/усиливающий раствор и раствор перекиси.

Механизм действия основан на реакциях окисления и восстановления, приводящих в результате к образованию свободных радикалов и излучению света. Пероксидаза (ПХ) реагирует с образованием промежуточного соединения, которое далее вступает в реакцию с люминолом с образованием радикала люминола, который затем распадается с испусканием света. Молекулы усилителя восстанавливают свободные радикалы, что способствует усилению реакции хемилюминесценции. Усиление хемилюминесценции позволяет получить высокую чувствительность с точечных тестобластей на поверхности биочипа. С целью объективной регистрации хемилюминесценции в каждой точке биочипа используют специальные камеры с зарядовой связью (КЗС), КЗС одновременно регистрирует испускание света со всех дискретных тест-областей на каждом из девяти биочипов, находящихся в носителе биочипов. Таким образом, для количественного определения сигнала используют процесс визуализации, управляемый специализированной программой. Программное обеспечение определяет величину относительного освещения по интенсивности хемилюминесцентного сигнала с каждой ДТО на биочипе и величину соответствующей расчету концентрации каждого анализируемого вещества в тестируемом образце, основываясь на информации, полученной в результате анализа калибровочной кривой, связанной с каждым исследуемым белком или геном. Регистрируемые данные сохраняются в компьютере, а именно: изображение и цифровые показатели биопробы, и наряду с этим, данные контроля качества и данные калибровки для каждого аналита. Следует отметить, что калибровочные наборы содержат по девять изучаемых веществ, т.е. являются мультианалитными для получения достоверных концентраций калибровочных кривых, которые хранятся в программном обеспечении и используются для расчета концентрации анализируемых веществ в контрольных образцах и в образцах пациентов. Технологию биочипов используют в современной медицине достаточно широко: для научных исследований, в судебной экспертизе, с целью выполнения клинических и ветеринарных анализов. Производители фирмы

Randox (Великобритания) выпускают линейку аппаратов:

автоматические анализаторы Evidance и Evidance Evolution и полуавтоматические приборы Evidance Investigator u Multi Stat.

Характерным для этих приборов является наличие однозначных (совместимыми со всеми приборами) наборов биочипов, мультиконтрольных и мультикалибровочных препаратов по определенным панелям с различными (рутинными и ведущими) биомаркерами, и постоянно пополняемым диапазоном меню.

Особенностью системы Randox является мультиплексное исследование, т.е. в одном образце на биочипе получаем множество ответов на одну биопробу одновременно и в зависимости от выбранной панели (кардиоваскулярные, гормоны щитовидной железы, количественные уровни и соотношения цитокинов (несколько панелей); панель фертильности, панели нагрузки лекарственными веществами (антимикробными и другими химическими веществами), панели стимуляторов метаболизма, а также ДНК – биочипы для определения полиморфизма 28 мутаций в 4 генах для колоректального рака кишечника и рака яичников;

панели для определения 22 патогенов респираторных инфекций и панель для выявления 10 возбудителей ИППП одновременно и другие. С целью исследования в данной системе анализируемыми могут быть: цельная кровь, сыворотка крови, плазма крови, моча, бронхоальвеолярный лаваж, мазок тканей клеток бронхов и урогенитального тракта, смыв из носоглотки и другой биоматериал.

Объем пробы составляет 25-200 мкл, и одна панель может включать от 9 до 16 исследуемых субстратов (в зависимости от предназначения). Кроме того, особенностью анализаторов с биочиповой технологией является наличие соответствующие интернациональным (международным) стандартам мультианалитные (для определяемых биомаркеров) контроли и калибраторы. Автоматические анализаторы которые работают по принципу иммуноферментного или иммунохемилюминесцентного анализа, как правило, представляют результат лишь одного теста на кювету или стрип, тогда как анализатор биочипов может обеспечить осуществление множества тестов из одной пробы на один биочип.

Таким образом, анализаторы, использующие биочиповую технологию, определяют как одна система – множество результатов + множество приложений (протеомный и геномный анализы) и обусловливают возможность оценки взаимодействия цитокинов, и других белков.

Методы иммунной реакции, используемые биочиповой технологии:

1. анализ сэндвич на биочипе;

2. анализ с захватом антитела на биочипе;

3. конкурентный анализ на биочипе.

Анализ сэндвич, как правило, применяются для обнаружения молекул с высокой молекулярной массой с множеством функциональных групп для связывания антитела. Антитела прикреплены к дискретным тест-областям (ДТО) на поверхности биочипа. Когда добавляют образец пациента, содержащий интересующие анализируемые вещества, они связываются с областями, содержащими антитела на поверхности биочипа. Затем добавляется реактив, содержащий меченые ферментом антитела для обнаружения (то есть конъюгат), который связывается с вторичной функциональной группой захваченного анализируемого вещества.

Анализ сэндвич на биочипе

–  –  –

После добавления сигнального реактива испускается световой сигнал, который прямо пропорционален концентрации анализируемого вещества в образце пациента. В случае отсутствия образца отсутствуют молекулы анализируемого вещества для связывания с поверхностью биочипа, и поэтому, не образуется никакой сигнал. Следует отметить, что реактив с мечеными ферментом антителами содержит специфические антитела для всех дискретных тест-областей на поверхности биочипа. Для мечения антител используется пероксидаза хрена. Сигнальный реактив представляет собой универсальный субстрат, используемый для всех дискретных тест-областей на поверхности биочипа.

Анализы с захватом антител используют с целью обнаружения антител в образцах пациентов. Макромолекулы, специфичные в отношении антител, прикреплены к дискретным тест-областям (ДТО) на поверхности биочипа. Когда добавляется образец пациента, содержащий искомые антитела, то они связываются с макромолекулами на поверхности биочипа.

Анализ с захватом антитела на биочипе

–  –  –

Как правило, ввиду специфичности, они связываются посредством распознавания сайтов (молекул белков) связывания антигена. Затем, с захваченными антителами связываются меченые ферментом антитела, обладающие специфичностью в отношении антител (антиантитела) образца. После добавления сигнального реагента, продуцируется световой сигнал, который прямо пропорционален концентрации в образце пациента. При отсутствии антител в исследуемой пробе и при отсутствии образца, сигнал не продуцируется. Реактив с меченными ферментом (пероксидаза хрена) антителами содержит специфические антитела для всех искомых антител, прикрепляющихся на дискретных тест-областях биочипа. Сигнальный реактив представляет собой универсальный субстрат, используемый для всех тест - областей на поверхности биочипа.

Конкурентные методы иммунологического анализа используют, как правило, для обнаружения молекул с низкой молекулярной массой, имеющих несколько функциональных групп для связывания с антителами.

–  –  –

Антитела прикреплены в дискретных тест-областях на поверхности биочипа, и затем добавляют анализируемое вещество, обработанное ферментом. В отсутствии образца пациента, меченое анализируемое вещество связывается с областями антител на поверхности биочипа, и после добавления сигнального реактива исходящий свет пропорционален концентрации связанного меченного анализируемого вещества (контроль). Когда же добавляют образец пациента, содержащий анализируемые вещества, последние конкурируют с мечеными веществами за сайты связывания антител. Это приводит к уменьшению количества связавшегося меченого вещества, и таким образом, будет уменьшаться исходящий световой сигнал. Исходящий световой сигнал в конкурентном анализе обратно пропорционален концентрации анализируемого вещества, присутствующего в образце пациента.

Хемилюминесцентная техника.

Хемилюминесценция представляет собой продуцирование света посредством химической реакции. Она используется в иммуноанализах для определения уровня анализируемого вещества в образце. В приборах с биочиповой технологией используют усиленный хемилюминесцентный субстрат с пероксидазой хрена (ПХ) в качестве метки для обнаружения антител или анализируемых веществ, связавшихся с поверхностью биочипа.

Интенсивный испускаемый сигнал дает возможность для обнаружения пикограмм антитела или антигена. Сигнальный реактив универсален для всех тест-панелей анализаторов с биочиповой технологией компании Randox. Сигнальный реактив включает в себя смесь 1:1 люминол/усиливающий раствор и раствор перекиси. Растворы могут храниться в анализаторе в отдельных контейнерах и автоматически смешиваются непосредственно перед анализом. Механизм реакции основан на реакциях окисления и восстановления, приводящих в результате к образованию свободных радикалов и излучению света.

Пероксидаза вступает в реакцию с пероксидом с образованием промежуточного раствора 1. Соединение 1 вступает в реакцию с люминолом с образованием радикала люминола, который затем распадается с испусканием света. Молекулы усилителя восстанавливают свободные радикалы, что способствует реакции хемилюминесценции.

–  –  –

Усиление хемилюминесценции позволяет получить высокую чувствительность с малых тест-областей на поверхности биочипа.

Испускание света в результате реакций хемилюминесценции, которое происходит в дискретных областях на поверхности биочипа, обнаруживают и количественно определяют с использованием камеры с зарядовой связью (КЗС). КЗС одновременно регистрирует испускаемый свет со всех дискретных тест-областей на каждом из девяти биочипов, содержащихся в носителе биочипов. Затем для количественного определения сигнала используется процесс визуализации, управляемый программным обеспечением. Следует особо отметить, что в этих приборах используют камеру с зарядовой связью, так как она позволяет визуализировать низкий уровень света вследствие её чувствительности, линейной зависимости от испускаемых фотонов, широкого динамического диапазона и высокого пространственного разрешения, и в то же время, при поддержании приемлемой производительности по образцам. В отличие от пленки для регистрации изображения, у КЗС имеется датчик, который преобразует свет, испускаемый вследствие хемилюминесцентной реакции, в электрический заряд. Камера с зарядовой связью собрана из матрицы тесно посаженных полисиликоновых проводящих электродов (фотообластей), располагающихся на силиконовом носителе и разделенных слоем изолирующего оксида. Когда испускается свет в результате хемилюминесценции, часть его поглощается полупроводящим веществом. Энергия заставляет электроны высвобождаться, и позволяет им свободно течь в направлении электрического поля через фотообласть. Поток электронов представляет собой поток, который переносится в форме заряженных пакетов (10 6 электронов), что затем определяется по напряжению. Картина заряда в КЭС, которая соответствует картине испущенного света, превращается в колонку пикселей, и оцифровывается. КЗС о б у с л о в л и в а ет в о з м о ж н о с т ь д л я п р о с т р а н с т в е н н о г о количественного измерения света, испущенного с поверхности биочипа. Это облегчает измерение количества света, испущенного с ДТО и разделение между определенными ДТО.

Обработка изображения. Хранение информации с изображением основано на хранении данных в компьютере в двоичном формате.

Память компьютера, по существу, представляет собой ограниченное количество 1 и 0, которые собраны в дискретные группы. Таким образом, когда изображение хранится в компьютере или в любой цифровой среде, оно должно быть представлено в таком виде. Система Evidence сохраняет изображения в виде битовых массивов, которые представляют изображение в виде набора пикселей, и которые соответствуют конкретным точкам на изображении. Каждый пиксель имеет координаты х и у точки наряду с данными яркости. Способность хранения пикселей основана на ресурсах компьютера; компьютер с большей памятью может представлять каждый см2 большим числом пикселей, таким образом позволяя получить более близкую аппроксимацию изображения. Она представляет собой разрешение изображения, и является важным фактором обработки изображения.

Программное обеспечение для обработки изображения использует способы математической обработки для максимизации выхода с КЗС.

Обработка данных включает следующие основные функции:

1.Удаление фонового шума с изображения, что приводит в результате к очень высокому отношению сигнал/шум;

2.Программное обеспечение определяет форму, размер и яркость ДТО для оценки того, является ли это действительно ДТО.

Каждый биочип должен пройти несколько тестов для гарантии того, получены ли достоверные результаты;

3. П р о г р а м м н о е о б е с п еч е н и е о п р ед ел я ет в ел и ч и н у относительного освещения по интенсивности хемилюминесцентного сигнала с каждой ДТО на биочипе и расчетах, соответствующих концентрации каждого анализируемого вещества в тестируемом образце, основываясь на информации, полученной в результате анализа калибровочной кривой, связанной с каждым анализируемым веществом;

4.В компьютере сохраняются изображение и цифровые данные, наряду с контролем качества и данными калибровки, полученными в результате анализа калибровочных/контрольных образцов для каждой ДТО.

Каждый биочип имеет на своей поверхности множество реакционных областей, а для конкретного анализируемого аналита эта область специфична и определенная. Процедура калибровки позволяет получить множество калибровочных кривых, по одной для каждого аналита. Программа компьютера позволяет выбрать тест для тех анализируемых веществ, для которых имеются достоверные калибровочные кривые, которые хранятся в базе программного обеспечения. Калибровочные наборы поставляются с девятью калибраторами и калибровочным компакт-диском, который содержит заранее определенные калибровочные показатели, и эту информацию используют для анализа и оценки достоверности результатов калибровки.

Таким образом, анализаторы компании RANDOX используют технологию биочиповых матриц для проведения одновременного тестирования множества анализируемых веществ. Каждый биочип служит в качестве реакционной платформы для определения множества параметров в образце одного пациента. Биочип в автоматических приборах транспортируется через последовательность блоков добавления реактива, инкубации, и промывки, затем блока добавления сигнального реактива, (в полуавтоматических анализаторах эти процедуры выполняет исследователь) а затем осуществляется визуализация реакционной поверхности через КЗС и количественно оценивается свет, испущенный с дискретных областей биочипа.

В каждый носитель помещают 9 биочипов, в составе одного носителя все биочипы являются специфичными (одна панель), в отношении тестируемых показателей. Следовательно, требования к одной тестируемой панели и к добавлению реактива, инкубации и визуализации для всех биочипов в составе одного носителя, одни и те же. В зависимости от требований, предъявляемым к используемой панели, применяют методы конкурентного анализа, техники сэндвич или захвата антител, и соответственно, последовательность транспортировки блока заложена в программном обеспечении.

По данным отечественной и зарубежной литературы 2008-2011 г.г.

–  –  –

Evidence Evolution & Multistat Test Menu

Самое разнообразное в мире тест-меню:

џДоступно больше тестов, чем у любого другого поставщика;

џДоступны как стандартные, так и новейшие маркеры.

–  –  –

Evidence Автоматизированная иммунохимическая аналитическая система на основе биочип-технологий.

џ Biochip Array технология позволяет одновременно производить высокоинформативные количественные исследования широкого спектра параметров, с использованием единого образца пробы пациента;

џ Evidence является единственным в мире анализатором, способным удовлетворить потребностям как средних, так и мощных централизованных лабораторий;

џ Производительность системы до 3600 анализов в час;

џ На биочипе тестируется 25 различных аналитов одновременно, а на матрице биочипов биоматериал от 9 пациентов;

џ Анализатор Evidence имеет высокую производительность на основе суперсовременной матричной технологии для измерения широкого спектра гормонов, медиаторов, маркеров и других биологически значимых веществ.

Evidence Investigator Компактная полуавтоматическая иммунохимическая система на основе биочип-технологий.

џПринцип исследований - хемилюминесценция (технология Biochip Array);

џПроизводительность до 1080 измерений в час;

џМинимальный объем пробы (25 – 100 мкл на биочип) и используемого мультиреагента (конъюгат) ;

џИспользование мультикалибратора и контрольной сыворотки;

џВозможность гибкого выбора панелей;

џВозможность быстрого и удобного изменения спектра измеряемых аналитов;

џСистема архивирования и просмотра результатов исследований биопробы пациентов;

џСохранение всех калибровок на мини-CD;

џПрограммное обеспечение - управление осуществляется с поставляемого в комплекте с прибором PC.

ГРУППА КОМПАНИЙ “БЛИК” Тел./Факс: +7 (863) 201-53-94 ь Широкий спектр медицинского оборудования и расходных материалов.

ь Производство инновационных реагентов для цитологии и гистологии.

ь Сервисное обслуживание оборудования.

Россия, 344111, г. Ростов-на-Дону, проспект 40-летия Победы, 95/6, офис 2

Похожие работы:

«В.Я Серия Философия. Социология. Право. 2016. № 17 (238). Выпуск 37 68 Н АУЧ Н Ы Е ВЕД О М О СТИ ЛОГИКА, МЕТОДОЛОГИЯ И ФИЛОСОФИЯ НАУКИ У Д К 159.9 ОПЫТ ДИСКУРС-АНАЛИЗА РИСУНОЧНОГО ЮМОРА HUMOR IN PICTURES...»

«ESR-100 ESR-200 ESR-1000 Справочник команд CLI Версия ПО 1.0.6 (08.2015) Маршрутизатор Версия документа Дата выпуска Содержание изменений Версия 1.6 17.08.2015 Изменения: 2 Правила пользования командной строкой 3.2 Конфигурирование маршрутизатора 5...»

«ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "СмолГ еоТ ехПроекТ " Свидетельство об аккредитации на право проведения негосударственной экспертизы проектной документации № РОСС R...»

«НЕДЕЛЯ БИРЖЕВОГО ФОНДОВОГО РЫНКА КАЗАХСТАНА 07 – 13 октября 2010 года СПРАВОЧНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Доллар США = 147,79 тенге по официальному курсу на конец периода. Доллар США = 147,61 тенге по биржевому средневзвешенному курсу на конец...»

«WWW.MEDLINE.RU ТОМ 16, ФАРМАКОЛОГИЯ, 17 ЯНВАРЯ 2015 НОРМАТИВНО-ПРАВОВЫЕ И НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ АСПЕКТЫ СОСТОЯНИЯ АНТИДОТНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Гладких В.Д., Беловолов А.Ю., Баландин Н.В. ФГУП НПЦ "Фармзащита" ФМБА России, 141402 Московская обл., г....»

«Общество с ограниченной ответственностью "Объединенная сервисная компания" КОЛЛЕКТИВНЫЙ ДОГОВОР ООО ОСК НА 2015-2017 годы Утвержден на конференции работников ООО "ОСК" 24.04.2015 года 1. СТОРОНЫ, ЗАКЛЮЧИВШИЕ КОЛЛЕКТИВНЫЙ ДОГОВОР, ИХ ПОЛНОМОЧИЯ И ОТВЕТСТВЕННОСТЬ. СФЕРА ДЕЙСТВ...»

«НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК МГТУ ГА № 170 УДК 331.45:65-05:347.82 ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛИРОВАНИЯ ТРУДОВЫХ И СОЦИАЛЬНООБЕСПЕЧИТЕЛЬНЫХ ОТНОШЕНИЙ АВИАЦИОННОГО ПЕРСОНАЛА ГРАЖДАНСКОЙ АВИАЦИИ М.Ю. ЛЕБЕДЕВА, Л.А. КОЛЫШЕВ Статья представлена доктором юридических наук, пр...»

«РАЗДЕЛ 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ ЭМИТЕНТЕ 1. Наименование Эмитента и организационно-правовая форма его существования. Таблица 1. Наименование Эмитента На государствен...»








 
2017 www.lib.knigi-x.ru - «Бесплатная электронная библиотека - электронные матриалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.